朱 殊，江順福，曹銘華，吳明超，毛元潮

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)又稱腦梗死，是卒中最常見的類型。缺血性腦卒中作為全球人類死亡及致殘的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，卒中治療手段雖然取得了一定進步，但研究顯示，與1990年相比，2016年全球人群卒中終身風(fēng)險卻從22.8%上升至24.9%，相對增加8.9%[1]。作為卒中高發(fā)國家，我國每年因卒中引發(fā)上百萬人死亡，數(shù)百萬患者喪失勞動力，不僅給患者家庭帶來巨大打擊，還給國家造成一定損失。因此卒中防治工作，任重道遠。近年來機制研究發(fā)現(xiàn)，NO參與調(diào)節(jié)血壓、血管生成以及抑制血小板聚集和白細胞粘附[2]，在卒中發(fā)病過程中具有重要保護意義，因而靶向NO治療被給予厚望。NO的生成由一氧化氮合酶(NOS)調(diào)節(jié)，在3種NOS中，NOS3，又稱內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶(eNOS)，因調(diào)節(jié)作用和表達分布廣泛而備受關(guān)注。NOS3基因的多態(tài)性，如7號外顯子G894T(rs1799983)將導(dǎo)致NOS3功能受損，NO產(chǎn)生減少[3]，參與冠心病、心肌梗死以及卒中的發(fā)生發(fā)展[4～6]。然而，關(guān)于NOS3基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)聯(lián)知之甚少，仍需深入探索。本研究利用臨床樣本，旨在應(yīng)用基因檢測技術(shù)，探討NOS3多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性，為缺血性腦卒中的一級預(yù)防以及治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 病例組：2017年10月-2018年9月期間在江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院進行治療的缺血性腦卒中患者100例。a.納入標(biāo)準(zhǔn)：2017年10月-2018年9月期間在江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科進行住院治療；經(jīng)頭部CT或MRI檢測，滿足缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)，且病歷信息完整。b.排除標(biāo)準(zhǔn)：存在相似癥狀及體征疾病，如腦出血、瘤卒中、短暫性腦缺血發(fā)作和蛛網(wǎng)膜下腔出血，或先天殘疾者如脊髓灰質(zhì)炎、腦癱患者等。對照組：同期本院所招募的健康志愿者80例，其年齡和性別比例與病例組相匹配。

1.2 血脂指標(biāo)檢測 受試者空腹后抽取靜脈血，所有的血脂水平及載脂蛋白水平的檢測工作均在江西省景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院臨床檢驗中心完成，使用全自動生化分析儀進行血脂檢測，該中心血脂測定質(zhì)控合格。檢測指標(biāo)包括血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、以及載脂蛋白A1、B(ApoA1、ApoB)和脂蛋白a[Lp(a)]。其中，血清TC和TG的檢測采用酶法，HDL-C和LDL-C采用酶聯(lián)免疫一步法測定，ApoA1和ApoB及Lp(a)采用免疫透射比濁法。

1.3 DNA提取及基因型檢測 采集研究對象空腹靜脈血2 ml于EDTA無菌抗凝管中，混勻，-20 ℃凍存待提基因組DNA，使用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA。通過PCR-RFLP技術(shù)對SNPs基因型進行鑒定。引物序列：上游引物：5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3’，下游引物：5’-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3’，由Invitrogen公司合成。擴增體系為：PCR Mix(Thermo) 10 μl，引物0.1 μmol各1 μl，DNA模板25-50 ng，用ddH2O補加至20 μl。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)后，再在72 ℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpn Ⅱ酶切后進行2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中GG等位基因因不被切割產(chǎn)生248 bp的一個片段，而TT等位基因可產(chǎn)生160 bp和88 bp的兩個片段。

2 結(jié) 果

2.1 入組人群一般信息及生化指標(biāo)分析 對照組與卒中組在年齡和性別上相匹配，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在血脂水平上，腦卒中組TC、TG、HDL-C、以及ApoB、Lp(a)則顯著高于對照組(P<0.05或0.01)，LDL-C、ApoA1較對照組又顯著降低(P<0.01)(見表1)。表明缺血性腦卒中患者血脂水平存在異常變化。

2.2 NOS3基因rs1799983位點基因型多態(tài)性分布 3種基因型GG、GT和TT，在對照組的人數(shù)分別是64(80%)、15(18.75%)、1(1.25%)，在卒中組3種基因型人數(shù)分別是66(66%)、27(27%)、7(7%)。3種基因型分布在兩組之間有顯著差異(χ2=7.234，df=2，P=0.027)。等位基因G和T，在對照組的人數(shù)分別是143(89.375%)、17(10.625%)。在卒中組人數(shù)分別是159(79.5%)、41(20.5%)。兩組之間有差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.17，df=2，P=0.007)(見表2)。該結(jié)果顯示，NOS3基因rs1799983位點基因型多態(tài)性可能與缺血性腦卒中患病相關(guān)，T等位基因的攜帶，可能預(yù)示著患病風(fēng)險的增加。

2.3 缺血性腦卒中患者NOS3不同基因型血脂指標(biāo) 在缺血性腦卒中組中，TT基因型患者外周血中TC含量顯著高于GG和GT基因型患者(P<0.01)，且GT基因型患者較GG基因型外周血TC含量也有顯著升高(P<0.05)。與GG和GT基因型患者比較，LDL-C在TT基因型患者中也顯著升高(P<0.01)，而在GG和GT基因型患者中無差異。但是，攜帶不同基因型的患者，其外周血中TG、HDL-C、ApoA1、ApoB、Lp(a)含量之間無差異(見表3)。所以在不同基因型的缺血性腦卒中患者中，血脂指標(biāo)TC和LDL-C之間有顯著差異，其他指標(biāo)無差異。此結(jié)果表明NOS3基因多態(tài)性可能與血脂中TC和LDL-C的含量有著關(guān)聯(lián)。

表1 入組人群一般信息

與對照組比較*P<0.05,#P<0.01

表2 NOS3基因rs1799983位點基因型多態(tài)性分布

注：*P<0.05,#P<0.01

表3 缺血性腦卒中患者NOS3不同基因型血脂指標(biāo)

與GG組比較*P<0.05;與GG組比較#P<0.01;與GT組比較&P<0.01

2.4 NOS3基因型多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病關(guān)聯(lián)分析 與NOS3的GG純合基因型相比較，TT純合基因攜帶者的卒中風(fēng)險顯著升高(OR=5.091，95%置信區(qū)間為1.025～25.276，P=0.047)；而GT雜合基因攜帶者患卒中的風(fēng)險較對照組有升高趨勢，但差異未達到顯著性意義(見表4)。所以，NOS3基因SNP+G894T(rs1799983)與缺血性腦卒中的患病風(fēng)險存在陽性關(guān)聯(lián)(見表4)。

表4 NOS3基因型多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病關(guān)聯(lián)分析

注：*P<0.05,#P<0.01

3 討 論

目前研究認為NOS3功能性多態(tài)性位點有3個：T786C/rs2070744、eNOS 4a/b和G894T/rs1799983。其中，外顯子G894T和內(nèi)含子4a/b多態(tài)性被認為在缺血性腦卒中的發(fā)病中具有重要傾向[4]。最近的薈萃研究顯示，亞洲人群的4a/b多態(tài)性的確與卒中患病相關(guān)，然而G894T在不同分類情況下，結(jié)果不一致，仍存在分歧[7]。

所以，本研究著手于NOS3的多肽位點G894T/rs1799983。研究發(fā)現(xiàn)NOS3基因rs1799983的多態(tài)性，與人群缺血性腦卒中的易感性相關(guān)：與GG基因型攜帶者相比，GT基因型換缺血性腦卒中概率有升高趨勢，而TT基因型攜帶者的易感度更是增加了5.091倍。此外，我們還發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)性變化，還與缺血性腦卒中患者外周血TC和LDL-C這兩種血脂指標(biāo)的升高存在關(guān)聯(lián)。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)NOS3多態(tài)性位點G894T中的TT基因型相對GG基因型，可使eNOS表達下調(diào)，主要因eNOS蛋白在Caveolae(如Cav-1)上的定位改變，導(dǎo)致其剪切依賴反應(yīng)減弱，活性發(fā)生改變，使得NO產(chǎn)生減少[8]。因此，研究者開始進一步深入研究eNOS的調(diào)節(jié)周期。最近研究發(fā)現(xiàn)，在臺灣漢族人群中eNOS G894T和Cav-1 14713A/29107A的多態(tài)性與患缺血性腦卒中的危險性增加具有相關(guān)性[9]。此外，在印度人群中，研究者也發(fā)現(xiàn)G894T位點多態(tài)性與缺血性腦卒中具有關(guān)聯(lián)[4]。上述兩個研究均與本研究結(jié)果一致。

本研究首次報道eNOS G894T基因的多態(tài)性變化，還與缺血性腦卒中患者外周血TC和LDL-C這兩種血脂指標(biāo)的升高相關(guān)。血脂水平的升高作為動脈粥樣硬化的重要危險因素，可能在一定程度上表明G894T位點的突變通過引起血脂中TC和LDL-C的升高，使得腦卒中發(fā)病危險系數(shù)增加，但其具體機制還有待進一步探索。關(guān)于血脂水平的變化，我們數(shù)據(jù)顯示卒中患者血脂水平顯著高于正常人，與有些研究者結(jié)果一致[10]。但也有早前研究結(jié)果報道卒中患者HDL顯著降低，而TC/HDL顯著升高[11]。

我們分析原因可能為：(1)所入選人群的飲食習(xí)慣具有差異，較之較早的研究，我們研究延遲十多年。在這十多年中，人們生活水平大幅提高，更加注重飲食；(2)與他人研究相比(516例缺血性腦卒中患者，131例非卒中患者)，我們的研究人群樣本較小。這也是本研究的主要局限之處；(3)吳征瑜的研究對照組為與病例組同期神經(jīng)內(nèi)科收治的非卒中患者，來自臨床患者，而我們的對照組采集的是健康志愿者血脂信息。此外，有研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E基因的多態(tài)性可影響血脂水平，可能是缺血性腦卒中的易感因子和危險因素[12]。受限研究對象數(shù)目，本研究未能進行亞組分析，比如性別和年齡段，以及卒中危險因素抽煙、飲酒等。因此，NOS3多態(tài)性與缺血性腦卒中之間關(guān)聯(lián)的確切結(jié)論，仍需后續(xù)開展多中心合作，大樣本深入研究。

綜上，該研究在一定程度上證明eNOS G894T突變的確與缺血性腦卒中的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)，且該位點的TT純合突變，還引起血脂中TC和LDL-C的升高。聯(lián)合其他研究，將有助于臨床實踐的指導(dǎo)，如利用遺傳多態(tài)性的檢測預(yù)測缺血性腦卒中易感人群，進而達到精準(zhǔn)醫(yī)療的個體化預(yù)防和治療的目的。