王 煒，王素歡，李世平，侯慧清，楊 靜，吳冰潔，董 梅

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是體液免疫為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫性疾病，反復(fù)發(fā)作，主要侵犯視神經(jīng)和脊髓，是青壯年致殘的重要原因之一。

水通道蛋白4(Aquaporin 4，AQP4)抗體(AQP4-Ab)是由B細(xì)胞產(chǎn)生的NMOSD特異性抗體，B細(xì)胞是疾病發(fā)生的重要參與者。B細(xì)胞的活化、增殖和分化主要受B細(xì)胞抗原受體(B cell antigen receptor，BCR)信號(hào)通路調(diào)控。當(dāng)BCR受到抗原或B細(xì)胞活化因子刺激后，將信號(hào)傳至胞內(nèi)，胞質(zhì)中多種蛋白酪氨酸激酶可激活下游效應(yīng)器，其中很重要的一種激酶就是Bruton酪氨酸激酶(bruton’s tyrosine kinase，BTK)，它是B細(xì)胞發(fā)育成熟并行使免疫功能的關(guān)鍵因素，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。BTK首先激活與之緊密聯(lián)系的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，產(chǎn)生“第二信使”，促進(jìn)B細(xì)胞正常分化發(fā)育或參與炎癥反應(yīng)， PI3K通過(guò)激活核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor kappa B Kinase，IKK),介導(dǎo)NF-κB核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)入核，NF-κB通過(guò)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，影響B(tài)細(xì)胞增殖、分化和抗體產(chǎn)生，并促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生[2]。

B細(xì)胞可以分化為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)、漿細(xì)胞(產(chǎn)生抗體)及效應(yīng)B細(xì)胞等不同細(xì)胞亞群，分泌多種抗炎和促炎因子，維持免疫平衡，而B(niǎo)TK/NF-κB 通路中相關(guān)各激酶異常可能是介導(dǎo)B細(xì)胞異常分化、導(dǎo)致免疫失衡的關(guān)鍵因素。 故本文擬通過(guò)測(cè)定NMOSD急性期患者與健康對(duì)照組中的BTK/NF-κB信號(hào)通路中BTK、NF-κB、PI3K、IKK mRNA表達(dá)水平，探討其在NMOSD急性期的變化及對(duì)疾病可能的影響作用。

NMOSD患者長(zhǎng)節(jié)段性橫貫性脊髓炎(longitudinally extensive transverse myelitis，LETM)更常見(jiàn)，病灶多大于3個(gè)脊髓節(jié)段。AQP4-Ab血清陽(yáng)性狀態(tài)對(duì)孤立性LETM或視神經(jīng)炎(optic neuritis，ON)患者具有重要的預(yù)后和治療意義[3]。故本文通過(guò)檢測(cè)NMOSD急性期患者AQP4-Ab血清陽(yáng)性與否及其滴度水平，及脊髓MRI中受累節(jié)段數(shù)，探討AQP4-Ab對(duì)脊髓受累的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月-2019年1月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院東院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科的33例急性期視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病患者為實(shí)驗(yàn)組[急性期：患者出現(xiàn)新的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征，持續(xù)時(shí)間大于24 h不緩解，擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(Expanded Disability Status Scale，EDSS)評(píng)分增加≥1分]，同期選取性別、年齡相似的33位健康志愿者作為對(duì)照組。所有患者均經(jīng)由我科主治及以上資質(zhì)的醫(yī)師診斷，符合最新NMOSD指南制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)征得研究對(duì)象或家屬同意后簽署知情同意書(shū)后進(jìn)行，所有患者在給予任何免疫治療前抽取外周血。

1.2 標(biāo)本采集 所有受試對(duì)象征得知情同意后，抽取空腹急性期激素治療前靜脈血2 ml，置于EDTA管中，1500 rpm，離心5 min，分離出血細(xì)胞。將血細(xì)胞用PBS以1∶1的比例稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩难?xì)胞緩緩加入5 ml的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的上方，置于離心機(jī)中2000 rpm密度梯度離心20 min，離心管第二層云霧狀細(xì)胞層為單個(gè)核細(xì)胞層。吸取第二層云霧狀細(xì)胞于新的離心管中，加入細(xì)胞洗滌液12 ml，搖勻后以1500 rpm離心10 min，舍棄上清液去沉淀得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)懸液。將其分為兩份，分裝于EP管內(nèi)，每管細(xì)胞數(shù)大致相當(dāng)，約1×106個(gè)。而后將PBMCs懸液分別存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集 記錄所有研究對(duì)象的基本信息，包括：姓名、性別、年齡、病程、EDSS評(píng)分，復(fù)發(fā)次數(shù)，血AQP4-Ab結(jié)果、脊髓MRI平掃及強(qiáng)化結(jié)果，依據(jù)強(qiáng)化結(jié)果確定此次發(fā)病的脊髓受累節(jié)段數(shù)。

1.3.2 采用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)人外周血PBMCs中BTK、NF-κB、PI3K、IKK的mRNA含量，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2.1 Real Time PCR檢測(cè)目的基因引物在北京Invitrogen公司合成。

1.3.2.2 提取樣本總RNA采用TRNzol總RNA提取試劑提取樣本RNA，使用NanoDrop?ND-2000測(cè)定RNA濃度和純度。

1.3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行，具體操作如下：(1)去除基因組DNA反應(yīng)，于冰上配制反應(yīng)混合液，5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μl，gDNA Eraser 1.0 μl，Total RNA 1 μg，RNase Free H2O Up to 10 μl，42 ℃孵育2 min；(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：上述反應(yīng)液加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl，RT Primer Mix 1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，RNase Free H2O 4.0 μl，共20 μl，37 ℃孵育15 min，之后放入85 ℃ 5 s，cDNA保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3.2.4 Real Time PCR樣本檢測(cè) 將所有cDNA樣品分別配置RT-PCR反應(yīng)體系。體系配置如下：2 × Master Mix 10 μl，10 μmol的PCR特異引物F 0.5 μl，10 μmol 的PCR特異引物R 0.5 μl，加水至總體積為18 μl 5000 rpm短暫離心；將18 μl混合液、2 μl cDNA依次加入96-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，粘上封口膜，混勻，置于冰上；將96-PCR板置于Realtime PCR儀上，以95 ℃，30 s；40個(gè)PCR循環(huán)[95 ℃，5 s；60 ℃，40 s(收集熒光)]。建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，從60 ℃緩慢加熱到99 ℃來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)。儀器自動(dòng)匯總熒光值后進(jìn)行分析。

1.3.3 血液AQP4-Ab水平測(cè)定 患者抽取的檸檬酸鈉管靜脈血送至北京協(xié)和醫(yī)院行免疫組化染色法測(cè)定AQP4-Ab水平。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的一般資料 NMOSD患者共33例，女性30例，男性3例，發(fā)病年齡19～67(42±14.75)歲；患者均符合NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)，EDSS評(píng)分2.0～9.0分，中位數(shù)為3.5分，四分位數(shù)間距為2.8分，復(fù)發(fā)患者占69.70%。行脊髓MRI平掃及強(qiáng)化檢查24例，脊髓MRI受累階段數(shù)0～17(5.67±4.36)，累及頸段、上胸段23例，累及下胸段、腰段4例，受累節(jié)段≥3個(gè)椎體節(jié)段17例；行AQP4-Ab水平檢測(cè)25例，女性23例，男性2例，AQP4-Ab陽(yáng)性率80%；對(duì)照組33例，各組間在性別、年齡方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 NMOSD急性期患者與健康對(duì)照組BTK、PI3K、IKK、NF-κB mRNA水平相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1～圖4)。

2.3 NMOSD急性期患者AQP4-Ab陽(yáng)性者較陰性者脊髓受累節(jié)段數(shù)多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AQP4-Ab滴度與脊髓受累節(jié)段數(shù)無(wú)線性相關(guān)關(guān)系(P>0.05)(見(jiàn)圖5、圖6)。

圖1 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對(duì)照組，兩組血液PBMCs中BTK mRNA對(duì)數(shù)水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖2 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對(duì)照組，兩組血液PBMCs中PI3K mRNA對(duì)數(shù)水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖3 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對(duì)照組，兩組血液PBMCs中IKK mRNA對(duì)數(shù)水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖4 NMOSD急性期患者為病例組，健康者為對(duì)照組，兩組血液PBMCs中NF-κB mRNA對(duì)數(shù)水平比較，病例組明顯增高P<0.05

圖5 NMOSD急性期患者血清AQP4-Ab陽(yáng)性為陽(yáng)性組，陰性為陰性組，兩組脊髓MRI受累節(jié)段數(shù)比較，陽(yáng)性組明顯增高P<0.05

圖6 NMOSD急性期患者血清AQP4-Ab陽(yáng)性組中抗體滴度與脊髓MRI受累節(jié)段數(shù)關(guān)系，無(wú)相關(guān)關(guān)系P>0.05

3 討 論

B細(xì)胞是重要的體液免疫細(xì)胞，其功能異常時(shí)產(chǎn)生特異性AQP4抗體，并分泌多種炎癥因子，導(dǎo)致NMOSD發(fā)生，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。BCR是B細(xì)胞特征性標(biāo)志之一， BTK激酶是BCR信號(hào)通路重要組成部分，表達(dá)于B細(xì)胞。 BTK通過(guò)激活下游核轉(zhuǎn)錄因子PI3K、 IKK、NF-κB信號(hào)通路，參與調(diào)控B細(xì)胞，介導(dǎo)B細(xì)胞成熟、增殖、分化，發(fā)揮免疫保護(hù)功能。研究表明，BTK/NF-κB信號(hào)通路中不同激酶異常激活后，參與自身免疫性疾病發(fā)生，但B細(xì)胞在NMOSD發(fā)病中的作用機(jī)制尚不清楚。

B細(xì)胞表達(dá)BTK增高可能會(huì)引起對(duì)BCR刺激的高度反應(yīng)，而B(niǎo)CR信號(hào)通路的活化可以引起NF-κB信號(hào)通路的活化以及抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡，引起B(yǎng)細(xì)胞活化和分化異常，從而參與的發(fā)病過(guò)程。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)及原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren’s syndrome，PSS)患者的B細(xì)胞中，BTK蛋白和磷酸化BTK顯著增加[4]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者外周血BTK過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致SLE樣疾病，產(chǎn)生自身抗體[5]。本研究表明，NMOSD患者急性期外周血PMBCs中BTK mRNA較對(duì)照組明顯升高，提示其參與了NMOSD發(fā)病。應(yīng)用BTK抑制劑可顯著減緩SLE、RA的進(jìn)展[6]。BTK抑制劑Ibrutinib可顯著降低小鼠CNS小膠質(zhì)細(xì)胞和AS激活及促炎因子產(chǎn)生，改善CNS炎癥反應(yīng)[7]。

PI3K激活的信號(hào)通路在協(xié)調(diào)促炎和抗炎通路等方面具有重要作用。PI3Kδ和PI3Kγ可作為抗炎治療的潛在靶點(diǎn)[8]，減輕SLE小鼠模型的疾病進(jìn)展[9]。本研究中，PI3K mRNA在NMOSD患者中顯著升高，提示其參與了促炎病程。有數(shù)據(jù)顯示臨床試驗(yàn)和臨床前小鼠模型表明，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可避免腫瘤惡化，及CNS炎癥和疾病進(jìn)展[10]。

IKK、NF-κB是連接促炎信號(hào)通路與細(xì)胞存活、增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的信號(hào)通路的中心樞紐。IKK是介導(dǎo)NF-κB通路激活的重要環(huán)節(jié)，NF-κB入核調(diào)控基因表達(dá)[11]，NF-κB在炎癥和自身免疫疾病中通過(guò)過(guò)度表達(dá)效應(yīng)分子導(dǎo)致疾病進(jìn)展[12]。IKKε可促進(jìn)RA發(fā)展和炎癥發(fā)生[13]。在SLE小鼠模型中，抑制IKK/NF-κB通路，可減輕小鼠腎臟損傷[14]。Lee[15]等提出IKK/NF-κB誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞活化，加劇EAE病情，特異性抑制劑可能將作為MS的免疫療法。Yang[16]等檢測(cè)NMOSD患者中IKK通路下的NF-κB基因表達(dá)較MS與正常對(duì)照組增高，與本研究一致。 由于多種刺激能激活NF-κB信號(hào)通路， 故必須精確控制NF-κB活性， 避免異常的免疫應(yīng)答。 研究表明抑制BTK、NF-κB信號(hào)通路可顯著控制炎癥和減輕疾病[17,18]。

NMOSD典型的脊髓病變多累及3個(gè)或以上椎體節(jié)段，尤其是頸、胸段[19]。AQP4-Ab血清陽(yáng)性患者比陰性患者脊髓損傷程度可能更為明顯[20]。多項(xiàng)研究提出AQP4-Ab陽(yáng)性LETM的NMO轉(zhuǎn)化率較高，AQP4-Ab血清水平與脊髓損傷長(zhǎng)度、大于3個(gè)節(jié)段以上病變的存在之間存在相關(guān)性[21,22]。本研究中，血清AQP4-Ab檢測(cè)陽(yáng)性患者脊髓受累節(jié)段多于陰性患者，且≥3個(gè)節(jié)段者占70.83%，病灶多廣泛，多有脊髓腫脹，與多數(shù)研究者報(bào)道一致。而血清AQP4-Ab抗體滴度與脊髓受累節(jié)段數(shù)無(wú)線性相關(guān)關(guān)系，Isobe[23]等學(xué)者根據(jù)不同檢測(cè)方法均未發(fā)現(xiàn)AQP4-Ab滴度與臨床參數(shù)的相關(guān)性，與本研究一致，分析可能與一些患者體內(nèi)AQP4-Ab滴度雖高但此次發(fā)病與ON有關(guān)而非脊髓炎。Kessler[24]等多中心隊(duì)列研究表明AQP4-Ab滴度對(duì)NMOSD患者臨床病程無(wú)預(yù)測(cè)作用。

本研究表明，NMOSD患者急性期外周血B細(xì)胞BTK、NF-κB、PI3K、磷酸化IKK表達(dá)水平較健康人明顯增高，表明BTK/NF-κB信號(hào)通路參與了NMOSD急性期B細(xì)胞的增殖、分化、抗體產(chǎn)生及炎癥的發(fā)生，可能在NMOSD發(fā)病中具有重要的作用，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)。另外，NMOSD患者血清AQP4-Ab陽(yáng)性可能提示脊髓受累節(jié)段較廣泛。