李文楊，王 娟，趙振利，范國強(qiáng)

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院 林學(xué)院，河南 信陽 464000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 泡桐研究所，河南 鄭州 450002）

林木生長緩慢，世代周轉(zhuǎn)慢，遺傳雜合性高，絕大多數(shù)重要的林木經(jīng)濟(jì)性狀為數(shù)量性狀，生長發(fā)育易受到環(huán)境影響，多數(shù)性狀的遺傳控制機(jī)制還未了解[1]，而分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)提高了植物遺傳分析的準(zhǔn)確性和有效性，對科學(xué)快速地鑒定林木種質(zhì)資源及遺傳多態(tài)性、遺傳圖譜的構(gòu)建、目標(biāo)性狀連鎖標(biāo)記等相關(guān)研究具有重要意義。分子標(biāo)記以 DNA 多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記基礎(chǔ)，反映 DNA 水平上的遺傳變異，目前已經(jīng)發(fā)展到第3代基于單個堿基差異的分子標(biāo)記技術(shù)，主要是單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism,SNP）的標(biāo)記[2]。簡化基因組測序技術(shù)中的限制性酶切位點相關(guān) DNA 測序（Restriction-site associated DNA sequencing，RAD），是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，并對酶切后產(chǎn)生的 RAD 標(biāo)記進(jìn)行高通量測序。由于 RAD 標(biāo)記是全基因組范圍的呈現(xiàn)特異性酶切位點附近的小片段 DNA 標(biāo)簽，代表了整個基因組的序列特征，因此通過對RAD標(biāo)記測序能夠在大多數(shù)生物中獲得成千上萬的 SNP 標(biāo)記，該技術(shù)具有操作簡單、不受基因組的限制、實驗成本較低等多個優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于植物和動物的遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究中[3-5]。

遺傳圖譜的構(gòu)建是林木分子育種研究的重要內(nèi)容，以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)構(gòu)建遺傳圖譜，是最直接快速獲取植物基因組和遺傳變異信息的方法。目前楊樹Populus alba、桉樹Eucalyptus、落葉松Larix kaempferi、柳樹Salix viminalis等有較高經(jīng)濟(jì)價值的林木種質(zhì)資源相繼構(gòu)建了自己的遺傳圖譜[6-9]。泡桐Paulownia隸屬于玄參科Scrophulariaceae泡桐屬Paulownia，落葉喬木，原產(chǎn)自中國，已有 2 000 多年的栽培史，目前已廣泛分布于世界各地。泡桐是重要的速生用材和園林綠化樹種，而且因其材質(zhì)輕、易加工、紋理美觀還被廣泛用于建筑、家具及工藝品的制作。目前關(guān)于泡桐的研究大多集中在新品種培育、抗逆性等方面[10-13]，而分子遺傳基礎(chǔ)和發(fā)育進(jìn)化方面的研究卻相對較少，尤其泡桐遺傳連鎖圖譜國內(nèi)外還未見報道。本研究利用 RAD-seq 簡化基因組測序技術(shù)，獲取豐富的 SNP標(biāo)記，構(gòu)建泡桐的高密度遺傳連鎖圖譜，為泡桐比較基因組學(xué)研究、分子標(biāo)記輔助育種和從分子水平上探究泡桐屬植物生長、發(fā)育、遺傳系統(tǒng)進(jìn)化等提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用的試驗材料來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐試驗基地，選用兩種雜交組合：母本毛泡桐Paulownia tomentosa（P1_M2_RA）和父本白花泡桐Paulownia fortunei（P2_B2_RA）雜交，母本白花泡桐（BF1A）和父本毛泡桐 （BM2A）雜交，規(guī)定毛泡桐×白花泡桐為正交。選用4個親本以及正反交獲得的子一代（F1）群體（正交F1代91株，反交F1代90株）中挑選181株子代個體作為作圖群體。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

采摘泡桐4個親本和 181 個子代個體的新鮮葉片，提取每個樣品總 DNA ，提取方法參照 Paterson 等的 CTAB 法[14]。

1.2.2 RAD文庫構(gòu)建及測序

用限制性內(nèi)切酶EcoR1消化樣品基因組 DNA，并在酶切片段兩端加 Solexa 接頭 P1 Adapter（P1 接頭包含4 個部分：與 PCR 擴(kuò)增的前引物結(jié)合的互補序列；與 Illumina 測序引物結(jié)合的互補序列；用來對樣品進(jìn)行跟蹤的 4～5 bp 的 Barcode；相應(yīng)的限制酶切位點），對連接 P1 接頭的DNA 片段進(jìn)行 pooling，并隨機(jī)打斷，收集長度在350～550 bp之間的片段；在回收片段兩端加P2 接頭。P2 接頭為分叉的 Y 型接頭，可阻止未連接P1 接頭的片段擴(kuò)增；選擇連接了P1接頭的 RAD tag進(jìn)行擴(kuò)增；1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，純化回收350～550 bp DNA后，并稀釋到1 nmol用于測序，構(gòu)建好的185個樣品（4個親本和181個子代）的RAD測序文庫產(chǎn)量和質(zhì)量檢測合格（所有樣品的測序數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量值通過Q20和Q30檢測）后，利用Illumina Hiseq2000測序平臺進(jìn)行混合測序，采用pair-end雙端測序，確定樣本中親本平均的測序深度為10X，F(xiàn)1代樣品平均測序深度為0.8-1X，測序長度為100 bp。

1.3 數(shù)據(jù)分析

RAD 數(shù)據(jù)分析參考陳祥平等[15]的方法。先將所有樣本混合測序的數(shù)據(jù)按 MID barcode 分離開；再對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制（Quality control,QC）；接著進(jìn)行 SNP 位點的識別（SNP Calling）和對 SNP 標(biāo)記進(jìn)行基因型分型（Genotyping），在本階段分析中獲得親本所有可能的 SNP 位點，再將子代的 SNP 位點與親本的位點進(jìn)行比對，如果匹配則保留該個體此位點的 SNP 信息。從親本中確定得到的 SNP 應(yīng)滿足測序深度（depth）≥8 且≤200 以及質(zhì)量值Q≥20 的條件。

使用 Rainbow 2.02[16]對親本 RAD 數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，去除小于200 bp的拼接contig，SOAP2.02[17]把親本的RAD reads定位到contig 上，并用 SOAPsnp進(jìn)行 SNP的篩選，過濾掉測序深度（depth）大 于200的 序 列。用 Stacks version 0.999 8軟件對作圖群體進(jìn)行基因型分析[18]。群體 genotype 的過濾條件為：1）得到的標(biāo)記符合卡方檢驗（P＜0.01）；2）缺失率少于 20%；3）2個親本的基因型具有多態(tài)性，并且都是純合基因型。

1.4 連鎖分析與圖譜構(gòu)建

統(tǒng)計經(jīng)X2檢驗（P＜0.01）后在子代中符合孟德爾遺傳定律分離的SNP位點數(shù)，去除其中相似的位點（100 bp坐標(biāo)內(nèi)只保留一個位點），最后得到的標(biāo)記用于作圖，做兩點連鎖分析，計算兩兩標(biāo)記之間的重組率和LOD（Logarithm of odds）值，根據(jù)不同的LOD值進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建連鎖群，LOD值的選擇以獲得重組的連鎖群符合泡桐染色體數(shù)目為準(zhǔn)，作圖函數(shù)為Kosambi，算法為回歸算法[19]。采用 Joinmap version 4.0軟件，在 PC 計算機(jī)上進(jìn)行泡桐遺傳圖譜的構(gòu)建。

1.5 基因組長度估計和圖譜覆蓋度估計

遺傳圖譜構(gòu)建完成后，對各個連鎖群的遺傳數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，統(tǒng)計的參數(shù)有標(biāo)記數(shù)、每個連鎖群的長度、標(biāo)記間最大和最小圖距及標(biāo)記間平均距離等。根據(jù)Chakravarti 等[20]和Postlethwait 等[21]提出的方法估算基因組長度，其平均值作為圖譜預(yù)期長度（Ge）。利用公式估算圖譜的基因組覆蓋度：圖譜的基因覆蓋度（Cof）=圖譜觀測長度（Goa）/圖譜期望長度（Ge）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAD 測序及初始數(shù)據(jù)過濾

原始數(shù)據(jù)為 219.14 Gb，經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后共產(chǎn)出有效數(shù)據(jù)201.343 Gb。185 個樣品的測序質(zhì)量較高，Q20≥96.49%，GC含量正常。其中，親本平均 reads 數(shù)為 26.405 M，子代的平均 reads 數(shù)為12.23 M。將所有過濾后所得的RAD tag利用SOAP2軟件與參考序列進(jìn)行序列比對，并統(tǒng)計比對信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：親本白花泡桐分別有14 630 584條和21 333 202條雙末端RADtags比對到基因組，3 183 020條和5 612 901條單末端RADtags被比對到參考基因組，總共有81%和74.82%的reads比對到參考基因組序列上；親本毛泡桐分別有11 149 680條和16 259 650條雙末端RADtags以及3 679 989條和3 734 350條單末端RADtags比對到基因組，總共有69%及75.02%的reads比對到白花泡桐參考基因組上；在181個子代中，RADtags比對到基因組的比對率都在72%以上，最高比對率為82.94%。

2.2 個體SNP檢測及基因分型

測序得到原始數(shù)據(jù)拆分過濾后，對泡桐雙親和子代的測序序列進(jìn)行聚類比對分析，獲得了每個單株的標(biāo)記開發(fā)結(jié)果，其中在P1_M2_RA中開發(fā)出126 974個SNP，其中純合SNP有101 262個，純合率為79.75%；在P2_B2_RA中開發(fā)出117 277個SNP，其中純合SNP有54 036個，純合率為53.92%；在BF1A中開發(fā)出273 173個SNP，其中純合SNP有85 011個，純合率為68.88%；在BM2A中開發(fā)出195 414個SNP，其中純合SNP有65 688個，純合率為33.61%；F1代SNP純合率平均值為47.64%，SNP雜合率平均值為52.36%。利用一致性序列，按照過濾條件（如堿基的質(zhì)量值大于等于 20、SNPs之間至少5 bp間隔、測序深度大于等于6、拷貝數(shù)小于等于 1.5），將與參考序列比對的多態(tài)性位點條挑選出來，得到各個樣品的SNP信息，再將所有個體的SNP整合在一起，得到整個群體高質(zhì)量的基因型，共551 894個多態(tài)SNP位點，最后對群體基因型進(jìn)行過濾，獲得 5 015 個分離位點。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

5 015個標(biāo)記位點中去除相似的位點（100 bp坐標(biāo)內(nèi)只保留一個位點），最后得到3 785個標(biāo)記位點，使用 joinmap 4.0構(gòu)建遺傳圖譜，并手動去除了相似標(biāo)記，最后保留3 545個標(biāo)記用于作圖，作圖群體個體數(shù)為178個，以LOD 等于13到20指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，所有標(biāo)記位點劃分為20個連鎖群（部分染色體連鎖遺傳圖見圖1），圖譜總長度為2 050.77 cM。

以連鎖群為單位，利用Joinmap version 4.0軟件獲得連鎖群內(nèi)標(biāo)記的線性排列，多點分析估算相鄰標(biāo)記間的遺傳距離。由表1可以看出，各個連鎖群的兩點標(biāo)記間的平均距離變化范圍是0.39～1.55 cM，連鎖圖的平均圖距為0.58 cM。各個連鎖群上標(biāo)記數(shù)目變化范圍是87～282個SNP，其中標(biāo)記數(shù)量最多的連鎖群是LG1，標(biāo)記數(shù)量最少的連鎖群是LG20，20個連鎖群中標(biāo)記密度最大的是2.57個SNP/cM，位于LG1上。在形成的 20個連鎖群上連鎖位點覆蓋的遺傳距離從 67.89 cM 至 134.49 cM，平均為 102.54 cM，連鎖群最長的是LG20，最短的是LG19。每一連鎖群上含有的 SNP連鎖標(biāo)記數(shù)從最少 87個到最多 282 個。標(biāo)記間平均間距最大的連鎖群為LG18，平均間距為1.50 cM。從構(gòu)建的2個親本遺傳圖譜連鎖群的數(shù)量來看，F(xiàn)1代連鎖圖包含了20個連鎖群。

2.4 基因組長度的估計和圖譜覆蓋度的估計

圖1 部分泡桐染色體連鎖遺傳圖Fig.1 Genetic linkage map of Paulownia chromosome

圖譜標(biāo)記數(shù)量和 LOD 值的選取將共同影響基因組大小的估計。本研究得到的遺傳圖譜的實際長度為2 050.77 cM；采用 Postlethwait 等人[21]提出的方法計算得到的泡桐遺傳連鎖圖譜預(yù)期長度為2 051.93 cM；根據(jù) Chakravarti等人[20]提出的方法計算得到的泡桐遺傳連鎖圖譜預(yù)期長度為2 076.64 cM。2種算法取平均值后最終得到的泡桐遺傳連鎖圖譜預(yù)期長度為 2 064.29 cM，圖譜覆蓋度為 99.35%。

3 討論與結(jié)論

在利用分子標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜時，作圖群體的選擇很重要。林木生長周期長而且生產(chǎn)上多采用無性繁殖，所以泡桐的作圖群體的選擇不能像農(nóng)作物作圖中常用的近交系和高世代材料，而且泡桐的基因組比較大，重復(fù)的序列較多，大大限制了泡桐連鎖圖譜的研究發(fā)展。我國的泡桐遺傳育種研究多圍繞著毛泡桐×白花泡桐（簡稱毛×白）的雜交育種進(jìn)行的，先后選育出了20多個優(yōu)良毛×白F1 無性系，但對雜交親本及F1無性系的遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究很少。葉金山等[22-23]發(fā)現(xiàn)毛×白正反交具有同等重要的雜交育種意義，毛×白正反交F1 無性系在樹高、胸徑、材積等性狀的遺傳變異各方面表現(xiàn)完全相同或無顯著差異，并且毛×白正反交 F1無性系自然接干性狀的遺傳變異表現(xiàn)完全相同或無顯著差異。本研究選用毛泡桐和白花泡桐正反交作為親本及雜交F1代建立作圖群體，為探索毛×白正反交 F1 雜種優(yōu)勢的形成奠定遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

表1 泡桐連鎖遺傳圖譜統(tǒng)計Table 1 Genetic linkage map of Paulownia

泡桐為異花授粉植物，易雜交，不同的雜交組合后代表現(xiàn)出豐富的變異，有利于雜種優(yōu)勢良種。利用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)可以推測出物種的雜合度，但由于標(biāo)記覆蓋率低，得到的結(jié)果缺乏實際的應(yīng)用價值[24]。RAD測序結(jié)合SNP標(biāo)記開發(fā)技術(shù)能夠全面揭示泡桐的雜合特性，從而更加有效地利用雜種優(yōu)勢。本研究通過對泡桐每個樣品進(jìn)行SNP比對，發(fā)現(xiàn)白花泡桐SNP純合率均低于毛泡桐，SNP雜合率均高于毛泡桐，4個親本的SNP純合率平均值為56.67%，SNP雜合率平均值為43.33%；F1代SNP純合率平均值為47.64%，SNP雜合率平均值為52.36%，說明以白花泡桐和毛泡桐為親本的雜交配合力較高，子代重組率多由白花泡桐貢獻(xiàn)，雜交子代群體中雜合基因型較多。這與我國林木育種專家研究發(fā)現(xiàn)毛泡桐×白花泡桐的子代具有明顯的雜種優(yōu)勢的結(jié)果一致，如毛白33的苗高和地徑分別比母本大21.3% ～72.7%和14.3%～ 69.0%，比父本分別大4.9%～49.1%和0～ 41.3%[25]；陜桐3號和陜桐4號具有速生、材質(zhì)好、抗性強(qiáng)等優(yōu)點[26]。

通常遺傳連鎖框架圖基本要求標(biāo)記間平均距離在 20 cM左右；若要進(jìn)行基因定位，則要求標(biāo)記的平均間隔在 10～20 cM 之間或更??；若要用于 QTL 定位，其平均距離須在 10 cM 以下。王源秀等[27]利用 SSR 和 SRAP分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的響葉楊×銀白楊遺傳圖譜中估算楊樹基因組總長度為2 695.56 cM，圖譜的基因組覆蓋度為93.34%。王磊等[28]以 ‘紅茄梨’和 ‘晚秀梨’雜交 F1 代中已結(jié)果的 81 株單株為試材，構(gòu)建了包含 187個 SSR 標(biāo)記，分布在 18 個連鎖群上的遺傳連鎖圖譜，圖譜總長為 964.82 cM，標(biāo)記平均間距為 5.16 cM。林艷等[29]構(gòu)建的加勒比松遺傳圖譜共包含199個標(biāo)記，總長度為1 734 cM，標(biāo)記平均間距10.6 cM。劉列釗等[30]構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜高密度 SNP 遺傳圖譜中用于 QTL 分析的圖譜包括 2 756 個 SNP 位點，覆蓋甘藍(lán)型油菜基因組 1 832.4 cM，標(biāo)記之間平均距離為 0.66 cM。劉凱等[31]構(gòu)建的該圖譜覆蓋小麥21條染色體，有6 244個標(biāo)記，其中SNP標(biāo)記 6 001 個，DArT 標(biāo)記 216 個，SSR 標(biāo)記 27 個；染色體總長度為 4 895.29 cM，兩標(biāo)記間平均距離為0.78 cM。本研究利用RAD測序技術(shù)，從毛泡桐和白花泡桐及雜種 F1 181個子代群體中篩選出551 894個多態(tài)SNP位點，構(gòu)建了一張包含 3 545個標(biāo)記的泡桐高密度遺傳連鎖圖譜，所有標(biāo)記分布于20個連鎖群，符合泡桐單倍體的染色體數(shù)目（n=20），圖譜總長度為2 050.77 cM，標(biāo)記間平均距離為 0.58 cM，圖譜對泡桐基因組的覆蓋度達(dá)到99.35%。與前人研究的木本植物還是農(nóng)作物的遺傳圖譜相比，作圖群體數(shù)量和使用的標(biāo)記數(shù)量都更豐富，構(gòu)建的遺傳圖譜更精密。

泡桐是我國特有的重要經(jīng)濟(jì)林樹種，在我國林木遺傳育種研究中占有重要地位，本研究構(gòu)建的泡桐高密度遺傳圖譜，為今后進(jìn)行泡桐基因組學(xué)、分子標(biāo)記輔助育種等研究提供了一個好的平臺。但是，本研究中SNP分子標(biāo)記能否與泡桐的性狀關(guān)聯(lián)，能否通過某一遺傳標(biāo)記性狀的遺傳規(guī)律來驗證構(gòu)建的遺傳圖譜，還需要進(jìn)一步開展目的性狀相關(guān)基因的定位，采用構(gòu)建載體和基因?qū)氲燃夹g(shù)手段，為泡桐種質(zhì)創(chuàng)制與新品種培育提供理論依據(jù)。