張冬梅，李玉杰，王松，張丹丹，于明艷

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

妥布霉素(Tobramycin，Tob)是第二代氨基糖苷類抗生素，臨床主要用于眼部、呼吸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、尿道、胃腸道及軟組織、骨等的細菌感染,對于由多重耐藥性志賀氏菌引起的菌痢也有很好的療效，優(yōu)于阿米卡星(Amikaein)、慶大霉素等。妥布霉素滴眼液主要適用于敏感菌所致的外眼及附屬器的局部感染[1]。

2018年，我院承擔(dān)了妥布霉素滴眼液國家藥品計劃抽驗評價任務(wù)，共抽取妥布霉素滴眼液174批次，涉及生產(chǎn)企業(yè)21家，涉及批準文號23個。抽驗樣品規(guī)格除1家企業(yè)外均為多劑量包裝。多劑量包裝滴眼液為多次使用制劑，為了防止開封后保存和使用過程中微生物的污染，因此在處方中會加入一定劑量一種或幾種抑菌劑。臨床數(shù)據(jù)表明，抑菌劑的加入對眼部均有不同程度的刺激性，使用過量還會對眼組織產(chǎn)生損害，如苯扎氯銨可導(dǎo)致眼部炎癥、過敏、纖維化和干眼癥；硫柳汞可引起明顯的點狀角膜上皮損傷、可使隱形眼鏡變色[2-3]，眼藥水中的防腐劑有細胞毒性作用[4]。因此抑菌劑加入的量應(yīng)嚴格控制。妥布霉素滴眼液不同生產(chǎn)企業(yè)添加的抑菌劑種類及濃度不同，藥典及相關(guān)單篇標準對抑菌劑的檢查未涵蓋所有企業(yè)處方中使用的抑菌劑類別，個別抑菌劑缺少相關(guān)檢驗標準，無法監(jiān)督其投料情況[5-10]。我國藥典標準僅控制苯扎氯銨、羥苯乙酯、羥苯丙酯3種抑菌劑，未涵蓋企業(yè)實際使用的如硫柳汞鈉、苯扎溴銨抑菌劑。本研究擬建立妥布霉素滴眼液中抑菌劑檢查方法，涵蓋所用的全部抑菌劑，為該品種的質(zhì)量控制和安全監(jiān)管提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀(島津)、CP225D電子天平。羥苯乙酯(99.9%，批號：100847-201604)、羥苯丙酯(99.6%，批號：100444-201403)、苯扎溴銨(10.9 mg·mL-1，批號：135051-201401)、苯扎氯銨(12.19 mg·mL-1，批號：1300549-201504)等對照品來自中國食品藥品檢定研究院；硫柳汞對照品(96.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批號：43172)。

妥布霉素滴眼液來自2018年國家評價性抽驗樣品，174批，來源于21家企業(yè)。輔料包括硼酸、硼砂、依地酸二鈉、玻璃酸鈉、氯化鈉、硫代硫酸鈉、聚維酮K30、羥丙甲纖維素、無水硫酸鈉，來自2018年國家評價性抽驗。乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，柱溫35 ℃，測定波長214 nm，進樣體積20 μL，流速1.0 mL·min-1，流動相A為1%三乙胺(磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5±0.05)；流動相B為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液的制備和測定

2.2.1 對照品溶液 精密稱取羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉和苯扎溴銨對照品適量，用甲醇依次溶解稀釋制成每1 mL中含羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉和苯扎溴銨分別為0.04、0.04、0.1和0.2 mg的溶液，作為對照品溶液的混合溶液。另精密量取苯扎氯銨對照品適量，加水溶解并稀釋制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，作為苯扎氯銨對照品溶液。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 供試品溶液 樣品中含苯扎溴銨、苯扎氯銨和硫柳汞的滴眼液，直接取樣品作為供試品溶液；含羥苯乙酯和羥苯丙酯的樣品，取樣品加甲醇定量稀釋制成含羥苯乙酯和羥苯丙酯為40 μg·mL-1的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)使用性 按“2.1”項下的色譜條件，精密量取“2.2.1”項下各混合對照品溶液，進樣20 μL，分別記錄色譜圖，系統(tǒng)適用性溶液中色譜圖各成分的出峰順序依次為羥苯乙酯、硫柳汞鈉、羥苯丙酯和苯扎溴銨(苯扎氯銨)，見圖1～2。各相鄰峰之間的分離度均大于1.5。

1.羥苯乙酯；2.硫柳汞；3.羥苯丙酯；4.苯扎溴銨圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

1.n-C12H25；2.n-C14H29圖2 苯扎氯銨系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

精密量取混合對照品溶液、苯扎氯銨對照品溶液和樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算各抑菌劑的含量。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 專屬性試驗 按各企業(yè)處方工藝配制不含抑菌劑的陰性對照樣品，在各抑菌劑的保留時間處均無色譜峰，陰性對照溶液無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系、定量限與檢出限 按“2.2.1”項下的對照品配制方法，分別加甲醇定量稀釋制成系列濃度的溶液，精密量取適量進入液相，以對照品進樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標，以對照品峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。對照品峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。取儀器信噪比10∶1時進樣量為各成分的定量限，信噪比為3∶1時進樣量為各成分的檢出限?；貧w方程、線性范圍、定量限及檢出限見表2。

表2 線性關(guān)系和定量限驗證結(jié)果

2.3.3 精密度和重復(fù)性 精密量取各對照品溶液20 μL，按規(guī)定的色譜條件，連續(xù)進樣6次，計算各抑菌劑峰面積的相對標準偏差(RSD)。取妥布霉素滴眼液樣品4批(標示抑菌劑為羥苯乙酯和羥苯丙酯，標示含量各為0.2 mg·mL-1；標示抑菌劑為硫柳汞鈉，標示含量為0.1 mg·mL-1；標示抑菌劑為苯扎溴銨，標示含量為0.2 mg·mL-1；標示抑菌劑為苯扎氯銨，標示含量為0.1 mg·mL-1)，每批次樣品分別平行制備6份，計算樣品溶液中各抑菌劑的含量及RSD。精密度及重復(fù)性RSD結(jié)果均小于1.0%，結(jié)果良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 將混合對照品溶液和苯扎氯銨對照品溶液分別在室溫放置，于0、2、4、6、8、10、12 h后，按照“2.1”項下條件分析。測得5種抑菌劑主峰面積RSD均小于2%，均無顯著變化，表明溶液室溫放置12 h穩(wěn)定。

2.3.5 回收率試驗 按所有廠家處方配制不含抑菌劑的陰性對照溶液，精密量取5 mL，置9個10 mL量瓶中，分別精密量取10倍濃度的混合對照品溶液0.8、1.0和1.2 mL各3份，加入上述量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取陰性對照溶液5 mL，置9個10 mL量瓶中，分別精密量取10倍濃度的苯扎氯銨對照品溶液0.8、1.0和1.2 mL各3份，加入上述量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；量取20 μL分別注入色譜柱，測定抑菌劑含量，并計算平均回收率及RSD值，結(jié)果見表3。

2.3.6 耐用性 取混合對照品和苯扎氯銨對照品溶液，分別考察不同品牌色譜柱、流速相對值變化±20%、柱溫變化±5 ℃、流動相A pH值變化時對抑菌劑測定結(jié)果的影響程度，其結(jié)果表明各抑菌劑峰之間的分離度均符合要求。

2.4 樣品測定結(jié)果 按照新擬定的抑菌劑檢查方法對174批樣品進行檢測，結(jié)果見表4。結(jié)果，使用硫柳汞鈉的兩批次全部不合格，僅為標示量的40%左右，一批次苯扎溴銨不合格，提示需要結(jié)合抑菌劑的選擇合理性進一步查找不合格產(chǎn)生的原因。

2.5 影響因素對抑菌劑的影響 在影響因素試驗下，按擬訂的妥布霉素滴眼液抑菌劑測定方法對抑菌劑含量進行測定。高溫條件下，苯扎溴銨、苯扎氯銨穩(wěn)定，羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉含量降低。高濕條件對羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨均沒有影響。光照條件下，羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨、苯扎溴銨不受光照的影響，硫柳汞鈉呈下降趨勢，光照5 d后，硫柳汞含量下降近半，影響產(chǎn)品的安全性。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 通過紫外吸收光譜測定的結(jié)果，5種抑菌劑的紫外最大吸收波長如下：羥苯乙酯和羥苯丙酯均為256 nm處有最大吸收，苯扎溴銨和苯扎氯銨在262 nm附近有最大吸收，硫柳汞均無最大吸收，僅有末端吸收。在214 nm處5種抑菌劑均有較大吸收，經(jīng)考察，其檢出限和定量限均能達到定性及定量的要求，綜合考慮，最終選擇檢測波長為214 nm[11]。

3.2 流動相的選擇 分別用1%三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇[12]，1%三乙胺溶液(磷酸調(diào)pH至5.0)-甲醇和1%三乙胺(磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5)-甲醇，經(jīng)過比較，pH 5.0時硫柳汞峰和羥苯丙酯完全重合，pH 3.0時，硫柳汞峰出峰過快，因此選擇1%三乙胺(磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5)-甲醇體系，各峰分離度較好。

表3 回收率試驗結(jié)果(n=9)

表4 樣品測定結(jié)果

3.3 色譜柱的選擇 通過各品牌色譜柱比較，使用250 mm C18色譜柱時，出峰較慢，峰容易在梯度時出現(xiàn)，拖尾較嚴重，而選擇150 mm C18色譜柱時，使用規(guī)定的色譜條件，各抑菌劑峰之間的分離度均符合要求，因此建議選擇150 mm C18色譜柱。

3.4 苯扎溴銨和苯扎氯銨的確證 苯扎溴銨為單一純品，而苯扎氯銨非純品，是一系列同系物，中檢院提供的國家藥品標準物質(zhì)中含兩種取代同系物，n-C12H25同系物含量為65.49%，n-C14H29同系物含量為34.09%，計算時以二者之和計。苯扎溴銨峰與苯扎氯銨n-C12H25同系物在液相色譜條件下為同一重疊峰，因企業(yè)在加入抑菌劑時單獨使用，因此在檢測中單獨配制對照品溶液可以解決該問題，并不影響抑菌劑的檢測。

3.5 限度的制定 《中國藥典》2015年版(二部)妥布霉素滴眼液質(zhì)量標準中羥苯乙酯、羥苯丙酯及苯扎氯銨限度為80.0%～120.0%，《美國藥典》41版通則<341>要求，在生產(chǎn)時要保證藥品中應(yīng)含有標簽中所標示的抑菌劑用量(生產(chǎn)和分析的允許偏差為±20%)，因此暫將方法限度設(shè)定為標示量的80.0%～120.0%。

4 結(jié)論

《中國藥典》2015年版(二部)妥布霉素滴眼液質(zhì)量標準僅控制羥苯乙酯、羥苯丙酯及苯扎氯銨，標準中缺少苯扎溴銨和硫柳汞的檢測方法，對使用苯扎溴銨和硫柳汞作為抑菌劑的產(chǎn)

品，無法有效的控制其抑菌劑的含量，致使部分企業(yè)按制定的方法檢驗，含量未達到要求。本方法采用HPLC梯度洗脫程序，建立了可以同時測定鹽酸妥布霉素中多種抑菌劑(羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨和苯扎氯銨)含量的方法，同時對方法進行了驗證。該方法能有效地檢測目前妥布霉素滴眼液中所用到的抑菌劑的含量，為滴眼液中抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。使用該方法測定了174批妥布霉素滴眼液中抑菌劑的含量，發(fā)現(xiàn)部分企業(yè)產(chǎn)品抑菌劑的量低于標示量，影響到產(chǎn)品的有效性和安全性。從影響因素試驗結(jié)果來看硫柳汞鈉對光照十分敏感，建議包材選用避光滴眼液瓶。