邵長春 劉光瑞 田妮娜

摘要 [目的]建立一種快速檢測豬、牛、羊動物源性成分的實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法。[方法]針對豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytB特異性基因分別設(shè)計LAMP引物，通過實(shí)時檢測熒光強(qiáng)度判斷反應(yīng)結(jié)果。[結(jié)果]豬、羊源性成分的檢測靈敏度為10 pg，牛源性成分的檢測靈敏度為1 pg。對模擬摻雜肉制品檢測時，摻雜豬肉、牛肉、羊肉的檢出限為0.01%。[結(jié)論]該研究所建立的LAMP法特異性強(qiáng)、靈敏度高，能有效地對肉制品摻雜的豬、牛、羊源性成分進(jìn)行檢測，可作為肉類鑒別的一種快速檢測方法。

關(guān)鍵詞 豬源性成分；牛源性成分；羊源性成分；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增；可視化檢測

中圖分類號 TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0186-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.054

Abstract [Objective] The research aimed to establish a loopmediated isothermal amplification （ LAMP） method for porcin， bovine and sheepderived materials in meat products. [Method]LAMP primers were designed for ND1， COXI and cytB specific genes of pig， cattle and sheep， and the reaction results were judged by realtime detection of fluorescence intensity.[Result]The analytical sensitivity of the LAMP assay for porcin and sheep DNA were 10 pg，1 pg for bovine DNA. The detection limits for adulterated meat products could reach 0.01% for porcin， bovine and sheep.[Conclusion]This method exhibits a very high specificity and sensitivity for porcin， bovine，and sheepderived ingredients and can be used in filed studies ，and does not require any gelelectrophoresis apparatus.

Key words Porcinderived component；Bovinederived component；Sheepderived component；Loopmediated isothermal amplification；Visual detection

2013年的馬肉風(fēng)波在瑞典、德國、法國的部分牛肉中都發(fā)現(xiàn)摻雜馬肉，國內(nèi)媒體也多次曝光鴨肉冒充牛羊肉、假肉丸魚丸等肉類食品摻假事件，肉類食品摻假問題是目前國際國內(nèi)都比較關(guān)注的一個問題，美國《FDA食品安全現(xiàn)代化法案》已將摻假行為列入需要重點(diǎn)防范的食品安全風(fēng)險之一，為了維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，很多國家都對肉類產(chǎn)品含量標(biāo)示做了明確要求，比如歐盟、美國都要求肉制品需標(biāo)識所有成分及凈含量，我國食品安全法也規(guī)定預(yù)包裝食品包裝上應(yīng)標(biāo)明名稱、凈含量、成分配料表等。

肉類摻假是目前研究的一個熱點(diǎn)問題，各種檢測方法的開發(fā)也應(yīng)運(yùn)而生，主流的檢測方法主要是基于蛋白質(zhì)和核酸而開發(fā)的方法，基于蛋白檢測的方法有諸多的局限性，尤其是在深加工食品領(lǐng)域，蛋白在食品加工過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，變得不容易被識別，而以核酸為基礎(chǔ)的方法就可以避免這些缺點(diǎn)，因?yàn)楹怂嵩谒械纳锝M織基本都存在，在加工過的食品中不容易被降解，仍然可以被檢測到，所以以核酸檢測為基礎(chǔ)的方法應(yīng)用更為廣泛。

目前國家也制定了一些肉類成分鑒定的標(biāo)準(zhǔn)[1-2]，這些標(biāo)準(zhǔn)都是通過DNA的檢測技術(shù)來制定的，主要采用熒光定量和普通PCR的方法，常需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是2000年日本學(xué)者發(fā)明的一種新技術(shù)，此技術(shù)自出現(xiàn)以來在細(xì)菌、病毒、轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[3]，也有很多成型的商品試劑盒，比較適合應(yīng)用到基層的實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中。

筆者根據(jù)豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytB特異性基因序列，設(shè)計特異性引物，優(yōu)化試驗(yàn)條件建立肉制品中豬、牛、羊源性成分的LAMP檢測方法，旨在為肉類摻假鑒別提供方法依據(jù)及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、兔肉、狗肉、驢肉、鵝肉、鹿肉、魚肉、狐貍?cè)?、貂肉、鼠肉、蝦肉、馬血；馬血由甘肅省食品檢驗(yàn)研究院提供。

1.2 主要儀器與試劑

實(shí)時熒光PCR儀（QuantStudio7熒光定量PCR儀），超微量分光光度計（eppendorf Biospectrometer basic 系列），通用性LAMP試劑盒（廣州雙螺旋基因有限公司），血液組織DNA提取試劑盒（Qiagen）。

1.3 DNA提取

試驗(yàn)樣品DNA提取采用試劑盒（QIAGEN），提取DNA的濃度及純度用超微量分光光度計測定。

1.4 引物設(shè)計

從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索獲得豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytB特異性基因，利用BLAST在線比對軟件進(jìn)行分析，采用LAMP專用引物設(shè)計軟件Primer Explorer Version 4設(shè)計LAMP引物，由大連寶生物有限公司合成，引物序列見表1。

1.5 LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系均設(shè)為25 μL，內(nèi)引物、環(huán)引物與外引物比例為8∶4∶1，其中內(nèi)引物終濃度為1.6 μmol/L，環(huán)引物終濃度為0.8 μmol/L，外引物終濃度為0.2 μmol/L，并在體系中加入12.5 μL 2×LAMP反應(yīng)預(yù)混液、適量的Bst DNA 聚合酶及DNA模板。將混勻的反應(yīng)體系置入熒光定量PCR儀中于63 ℃恒溫反應(yīng)40 min。

1.6 LAMP引物特異性分析

為了驗(yàn)證所選引物的特異性，分別使用豬、牛、羊的LAMP引物對豬肉、牛肉、羊肉，雞肉、鴨肉、兔肉、狗肉、驢肉、鵝肉、鹿肉、魚肉、狐貍?cè)狻Ⅴ跞?、鼠肉、蝦肉、馬肉樣品的DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，判斷LAMP引物的針對目標(biāo)物種的特異性。

1.7 LAMP引物靈敏度檢測試驗(yàn)

將10倍梯度稀釋的豬、牛、羊源性成分基因組DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分別用于LAMP方法檢測樣品核酸的靈敏度。

1.8 肉制品中目標(biāo)成分含量測定

為了確定所建立的方法對模擬摻假肉樣品的最低檢出限，分別把鴨、馬、肉3個物種摻入牛肉中，制備成不同摻假比例（10%、1%、0.1%、0.01%）的模擬混合肉樣品，確定摻假肉制品中的最低檢出濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)

用設(shè)計的3種動物源性成分引物對16種動物的總DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，其擴(kuò)增結(jié)果見圖1，僅針對豬、牛、羊3種動物源性成分產(chǎn)生了擴(kuò)增曲線，其他混入的動物成分均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，表明該試驗(yàn)設(shè)計的LAMP引物具有較好的特異性。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

將10倍梯度稀釋的豬、牛和羊源性成分基因組DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分別用于LAMP反應(yīng)，其擴(kuò)增結(jié)果見圖2，豬、羊源性成分的檢測靈敏度可達(dá)10 pg DNA，牛源性成分的檢測靈敏度為1 pg DNA。

2.3 模擬混合肉中目標(biāo)成分含量測定

人工制備10%、1%、0.1%和 0.01%摻假比例的模擬樣品，用上述設(shè)計的LAMP引物進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示，豬、牛、羊源性成分檢測均能檢出0.01%的摻假樣品，而陰性及空白對照反應(yīng)管擴(kuò)增呈現(xiàn)陰性。

3 討論與結(jié)論

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)主要是根據(jù)特異性靶序列設(shè)計3對特異性引物，分別是外引物（F3/B3）、內(nèi)引物（FIP/BIP）、環(huán)引物（FLP 和 BLP），其中環(huán)引物的加入使得擴(kuò)增速度明顯提高。該技術(shù)所需設(shè)備簡單，不需要重復(fù)的降溫升溫的循環(huán)過程，具有操作簡便、快速特異的優(yōu)點(diǎn)。自從2000年LAMP技術(shù)發(fā)明以來，經(jīng)過近20年的時間，LAMP技術(shù)從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸延伸到食品、農(nóng)學(xué)等更多的領(lǐng)域，在很多領(lǐng)域都建立了一些檢測方法，食品領(lǐng)域主要集中在食品摻雜摻假[4-6]、轉(zhuǎn)基因[7-10]、過敏原[11]等領(lǐng)域。

基于核酸水平的動物源性成分檢測比較關(guān)鍵的一點(diǎn)是選擇合適的靶基因，核染色體基因、線粒體基因以及重復(fù)基因序列是常用的靶基因，這其中用的最多的是線粒體基因，首先線粒體基因拷貝數(shù)多，在食品加工過程中遭受的降解程度低[12-13]，其次在不同物種間具有特異性[14]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)作為近幾年新興的一項(xiàng)技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，但是由于在一個片段內(nèi)需要同時設(shè)計6個引物，對于引物設(shè)計的要求較高，同時需要避免多條引物之間引物二聚體的形成及不同物種間的交叉反應(yīng)，同時由于敏感性較高，在操作過程中盡量避免氣溶膠污染，產(chǎn)生假陽性，操作過程盡量不要開蓋。

該研究選取線粒體ND1、COXⅠ、cytB基因，經(jīng)DNA軟件比對選取的序列具有種間特異性，可用于區(qū)分不同物種動物。

該研究建立的豬、牛和羊源性成分的實(shí)時熒光LAMP檢測方法具有較高的特異性，僅對含有目標(biāo)DNA的樣品有擴(kuò)增，對其他動物源性成分的DNA沒有交叉反應(yīng)。實(shí)時熒光 LAMP 法對豬、羊源性成分的檢測靈敏度均可達(dá)10 pg，牛源性成分的檢測靈敏度可達(dá)1 pg。對模擬摻雜肉檢測時，實(shí)時熒光LAMP法對摻雜豬肉、牛肉和羊肉的檢測靈敏度可達(dá)0.01%。

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