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        美人蕉黃斑駁病毒巢式PCR檢測方法的建立

        2019-09-04 09:34:39陳細紅楊小龍廖富榮高芳鑾沈建國
        植物保護 2019年4期
        關鍵詞:檢測

        陳細紅 楊小龍 廖富榮 高芳鑾 沈建國

        摘要 本文以我國臺灣進境美人蕉病株為材料,根據(jù)已報道的美人蕉黃斑駁病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)基因序列設計2對特異性引物(外側(cè)引物1對、內(nèi)側(cè)引物1對),建立了巢式PCR快速檢測CaYMV的方法,并對進境的50份美人蕉樣品進行了檢測。結(jié)果顯示,該方法特異性強,且靈敏度高于常規(guī)PCR,是常規(guī)PCR的1 000倍,表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對CaYMV的快速、準確、靈敏檢測,適用于口岸快速檢測CaYMV。

        關鍵詞 美人蕉黃斑駁病毒; 巢式PCR; 檢測

        中圖分類號: Q 503, S 41-30

        文獻標識碼: A

        DOI: 10.16688/j.zwbh.2018283

        美人蕉Canna indica L.是美人蕉科Cannaceae美人蕉屬Canna的一種多年生草本花卉,主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū),具有一定的觀賞價值和藥用價值,在我國常作為一種園林觀賞植物進行引種栽培[14]。美人蕉在生長過程中易受病毒侵染,國內(nèi)外關于美人蕉病毒病的研究較少,目前已報道的美人蕉病毒有菜豆黃花葉病毒Bean yellow mosaic virus(BYMV)[5]、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、美人蕉矮化類病毒Canna stunt viroid[67]、美人蕉黃斑駁病毒Canna yellow mottle virus(CaYMV)[8]、美人蕉黃條病毒Canna yellow streak virus(CaYSV)[9]等。

        美人蕉黃斑駁病毒(CaYMV)是美人蕉上的一種重要病毒,屬于花椰菜花葉病毒科Caulimoviridae桿狀DNA病毒屬Badnavirus成員。其病毒粒體呈桿狀,長約120~130 nm,直徑約28 nm[10],基因組為不完全環(huán)狀雙鏈DNA,含3個開放閱讀框(open reading frame,ORF)。該病毒最早出現(xiàn)在日本和美國中北部[1113],隨后在意大利、荷蘭[14]、印度[2]、肯尼亞[15]、中國[16]等國家陸續(xù)出現(xiàn)報道。CaYMV的寄主范圍較窄,已報道的自然寄主為美人蕉。受侵染的美人蕉生長出現(xiàn)異常,典型癥狀為葉脈黃化,葉片、莖稈和花上出現(xiàn)條斑,組織逐漸壞死、變褐等,其觀賞價值和經(jīng)濟價值均受到影響[1011]。CaYMV主要通過無性繁殖材料傳播,可隨美人蕉種苗的運輸進行遠距離傳播,其傳播介體尚未明確,且目前尚缺乏有效的防治該病的方法。

        為有效降低CaYMV的傳播和擴散,急需建立針對該病毒快速、靈敏的檢測方法。國內(nèi)外針對CaYMV檢測方法的研究較少,沈建國等[10]報道了常規(guī)PCR檢測該病毒的方法。與常規(guī)PCR相比,巢式PCR方法檢測植物病毒具有更強的特異性和更高的靈敏度。張巧萍等[17]設計了鳳仙花壞死斑病毒的特異性引物,建立了巢式PCR檢測方法,提高了檢測的靈敏度。聞偉剛等[18]通過建立煙草環(huán)斑病毒和番茄環(huán)斑病毒的半巢式RT-PCR檢測方法,靈敏度較常規(guī)RT-PCR方法提高了10 000倍以上。本文以我國臺灣進境美人蕉病株為材料,根據(jù)已報道的CaYMV基因序列設計了2對特異性引物(外側(cè)引物1對、內(nèi)側(cè)引物1對),建立了巢式PCR快速檢測CaYMV的方法,以期進一步提高檢測靈敏度和準確性,以滿足口岸快速、準確檢測CaYMV的需要。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        CaYMV毒源為我國臺灣進境的美人蕉病株。菜豆黃花葉病毒(BYMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)以及番茄不孕病毒Tomato aspermy virus(TAV)的毒源(葉片)由本實驗室保存。所有毒源均保存于-80℃冰箱中。

        1.2 主要試劑

        Plant Genomic DNA kit購自天根生化科技(北京)有限公司,2×Easy Taq PCR Supermix、TRIzol試劑購自北京全式金生物技術有限公司,隨機引物、5×RT buffer、M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、10 mmol/L dNTPs 購自Promega 公司,10×PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTPs、MgCl2、Taq DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司。

        1.3 引物設計與合成

        桿狀DNA病毒屬通用引物BadnaFP/BadnaRP:ATGCCITTYGGIAARAAYGCICC/CCAYTTRC-AIACISCICCCCAICC,目的片段576 bp[19]。

        根據(jù)已報道的CaYMV基因序列設計2對特異性引物,外側(cè)引物為:上游引物CaYMVF1:5′-TAG-GGCAGTCAAGGATTAAGC-3′;下游引物CaYMVR1:5′-CAATCTTGGCGTAGAACGAG-3′,預期擴增片段大小為540 bp。內(nèi)側(cè)引物為:上游引物CaYMVF2:5′-ACTGCGTCAGTTTCTCGG-3′;下游引物CaYMVR2:5′-GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3′,預期擴增片段大小352 bp。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.4 總核酸的提取

        利用Plant Genomic DNA kit提取樣品總DNA,方法參照試劑盒說明書。

        1.5 PCR鑒定

        以提取的DNA為模板,PCR反應體系(25 μL)為:2×Easy Taq PCR Supermix 12.5 μL,無菌水8.5 μL,BadnaFP(10 μmol/L)1 μL,BadnaRP(10 μmol/L)1 μL,DNA 2 μL。擴增條件為:94℃預變性7 min;94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

        1.6 巢式PCR檢測

        第一輪PCR以提取的DNA為模板,PCR反應體系(25 μL)為:10×PCR Buffer (Mg2+free) 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,CaYMVF1(10 μmol/L)1 μL,CaYMVR1(10 μmol/L)1 μL,無菌水13.8 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,DNA 2 μL。擴增條件為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,53℃退火45 s,72℃延伸1 min,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。第二輪PCR擴增以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,反應體系為:10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,CaYMVF2(10 μmol/L)1 μL,CaYMVR2(10 μmol/L)1 μL,無菌水15.6 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,第一輪PCR產(chǎn)物0.2 μL。擴增條件為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

        1.7 序列測定及分析

        PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測得的核苷酸序列在NCBI中運用BLAST程序進行同源性比較分析。

        1.8 巢式PCR的特異性驗證

        菜豆黃花葉病毒(BYMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄不孕病毒(TAV)提取總RNA后,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,同攜帶CaYMV的樣品DNA一起進行巢式PCR擴增,同時以健康美人蕉植株的DNA為模板設陰性對照,以無菌水為模板設空白對照,反應體系及擴增條件同1.6。

        1.9 巢式PCR的靈敏度測定

        將CaYMV的DNA原液進行10倍梯度稀釋,分別以10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9不同稀釋度的DNA為模板,利用建立的巢式PCR方法進行擴增,同時設陰性對照,測定其靈敏度。

        1.10 樣品檢測

        利用建立的巢式PCR方法對口岸送檢的一批美人蕉樣品(共50份)進行檢測。檢測方法同1.4~1.7。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 PCR鑒定

        以提取的DNA為模板,以引物BadnaFP/BadnaRP進行擴增,結(jié)果從美人蕉病株中擴增出與預期大小一致的條帶,約576 bp,而空白對照和陰性對照均未擴增出相應的特異性條帶(圖1)。將所得的目的片段進行克隆和測序,測得的序列進行BLAST比對,與已報道的CaYMV序列一致性達97%以上,證實樣品攜帶有CaYMV。

        2.2 巢式PCR檢測

        以第一輪PCR產(chǎn)物為模板,利用設計的內(nèi)側(cè)引物進行第二輪PCR,結(jié)果從帶毒樣品中擴增出與預期大小一致的條帶,約352 bp,而空白對照和陰性對照均未擴增出相應的特異性條帶(圖2)。將所得的目的片段進行克隆和測序,測得的序列進行BLAST比對,與已報道的CaYMV序列(GenBank登錄號:KT447042)一致性達99%。

        2.3 巢式PCR的特異性驗證

        分別以BYMV、CMV、TAV的cDNA以及攜帶CaYMV的樣品DNA為模板,在相同條件下進行巢式PCR,同時設陰性對照,結(jié)果從圖3可見,僅攜帶CaYMV的樣品在352 bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶,其他病毒樣品和健康樣品均無條帶,表明建立的巢式PCR方法具有較強的特異性。

        2.4 巢式PCR的靈敏度測定結(jié)果

        將攜帶CaYMV樣品的DNA按10倍梯度稀釋后,分別作為模板,單獨使用CaYMVF1/CaYMVR1進行擴增,在1~3泳道均能擴增出540 bp的單一條帶(圖4a),而使用CaYMVF2/R2進行第二輪PCR擴增,在泳道1~6均能擴增出352 bp的條帶(圖4b)。第二輪PCR的檢測靈敏度比第一輪PCR高103倍,即巢式PCR使檢測靈敏度提高了103倍,由此表明,該病毒的巢式PCR的靈敏度明顯高于常規(guī)PCR,前者的靈敏度是后者的103倍。

        2.5 樣品檢測

        檢測結(jié)果表明,采用巢式PCR法能夠從50份美人蕉樣品中檢測出CaYMV 9份(檢出率為18%),比常規(guī)PCR檢出率(8%)高10個百分點,表明本文建立的巢式PCR方法具有更高的靈敏度。

        3 討論

        美人蕉黃斑駁病毒(CaYMV)是美人蕉上發(fā)生率較高的病毒之一,在美國、日本等美人蕉大面積種植的地區(qū)發(fā)生較為普遍,導致美人蕉的觀賞價值和經(jīng)濟價值下降。目前尚未有針對CaYMV有效的防治方法,在美國曾被迫采取銷毀病株的方式來防止其進一步擴散,給當?shù)貛磔^大的經(jīng)濟損失[10]。因此,加強病毒檢測,建立針對CaYMV快速、準確的檢測方法,對有效防止該病毒隨帶病植株的遠距離運輸而擴散,保護我國觀賞作物的生產(chǎn)安全意義重大。本文根據(jù)已報道的CaYMV序列設計了內(nèi)、外側(cè)2對特異性引物,在常規(guī)PCR的基礎上,建立了可用于CaYMV快速檢測的巢式PCR方法。

        本文建立的巢式PCR方法僅能夠從感染CaYMV的樣品中擴增到特異性目的片段,而從其他病毒樣品及健康樣品中均未擴增到相應的目的片段,提高了PCR擴增的特異性,有效避免了非目的片段的擴增。與常規(guī)PCR相比,本文建立的巢式PCR方法經(jīng)過2輪PCR反應,檢測靈敏度得到顯著提高,使整個PCR檢測靈敏度提高了1 000倍(第一輪、第二輪的檢測下限分別為10-2和10-5倍稀釋的DNA)。應用本文建立的巢式PCR方法對進境的美人蕉樣品進行CaYMV檢測,檢出率為18%,明顯高于常規(guī)PCR的檢出率,因此當CaYMV含量較低時,該方法能彌補常規(guī)PCR方法可能存在的漏檢問題,使檢測結(jié)果更為準確可靠。本文建立的巢式PCR檢測CaYMV的方法具有快速、簡便、特異和靈敏的優(yōu)點,能夠有效應用于CaYMV檢測。

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        (責任編輯:田 喆)

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