張雅男 劉月慶 JUNAID S M 王智琪 樊東

摘要 黏蟲是我國作物上最重要的害蟲之一。細胞色素P450能夠參與昆蟲外源物質(zhì)代謝。本研究采用RACE技術(shù)克隆了一條編碼黏蟲P450基因的cDNA序列，并通過Real-time PCR技術(shù)，檢測了4種外源物質(zhì)對該基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)。該基因被國際P450命名委員會命名為CYP9A113，GenBank登錄號為KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD50處理黏蟲3 h，LD10、LD30和LD50處理12 h和24 h，可誘導(dǎo)表達CYP9A113基因;20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑的LD10處理黏蟲12、24和48 h，LD30和LD50處理24 h，CYP9A113基因表達呈誘導(dǎo)效應(yīng);0.1和0.5 mg/mL香豆素處理6、12、24和48 h，CYP9A113基因表達均呈誘導(dǎo)效應(yīng);0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇處理3、6、12、24和48 h，CYP9A113基因表達均呈誘導(dǎo)效應(yīng)。

關(guān)鍵詞 黏蟲; CYP9A113基因; 克隆; 外源物質(zhì); 誘導(dǎo)效應(yīng)

中圖分類號： S 435.132

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018358

細胞色素P450酶（P450s或CYPs）是一類亞鐵血紅素硫醇鹽蛋白[1]，在哺乳動物的肝微粒體中首次被發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)已證明幾乎在所有生物體內(nèi)廣泛存在。自1965年Ray在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)P450后[3]，目前已經(jīng)克隆得到分屬于CYP2、CYP3、CYP4和線粒體P450s的多個昆蟲細胞色素P450基因序列[4]，其中CYP3分支又包括CYP6和CYP9家族[5]，這些基因既能催化激素、信息素、脂肪酸等內(nèi)源物質(zhì)的合成，又能參與殺蟲劑、誘變劑、植物次生代謝物質(zhì)等外源物質(zhì)的代謝，對昆蟲的生長發(fā)育起著非常重要的作用[68]。采用98%氯氰菊酯（55 ng/μL）對野桑蠶Bombyx mandarina點滴1 μL處理后，脂肪體中CYP9A20和CYP9A21基因表達量均升高[9];甘藍夜蛾Mamestra brassicae經(jīng)0.5 μL 2.5%溴氰菊酯水乳劑（0.152 ng/g）處理后，CYP9A90基因表達量總體呈誘導(dǎo)趨勢[10];甜菜夜蛾Spodoptera exigua經(jīng)95%氯蟲苯甲酰胺（0.01 mg/kg和0.02 mg/kg）處理后，CYP9A9基因相對表達量升高[11];香豆素可誘導(dǎo)斜紋夜蛾Spodoptera litura脂肪體中CYP4M14和CYP6AB14基因的表達[1213]。吲哚-3-甲醇處理可誘導(dǎo)飛蝗Locusta migratoria體內(nèi)CYP6HL1和CYP6FE12基因的表達[14]。

黏蟲Mythimna separata屬于鱗翅目，夜蛾科，是糧食作物上的重要害蟲之一[15]，在多個國家廣泛分布，我國除西藏地區(qū)未見報道外，其他各地均有報道[16]。本研究克隆黏蟲CYP9家族的一條P450基因，選取生產(chǎn)上常用于防治黏蟲的殺蟲劑2.5%高效氯氟氰菊酯乳油、20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑和黏蟲豆科寄主植物中含有的次生代謝物質(zhì)香豆素[17]、十字花科蔬菜活性成分吲哚-3-甲醇[18]，對其進行誘導(dǎo)效應(yīng)的研究，探究該基因在黏蟲外源物質(zhì)解毒和對自然環(huán)境的適應(yīng)性方面的重要作用，為利用分子手段防治該害蟲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

黏蟲M.separata采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽實驗基地，黑光燈誘集成蟲后于實驗室以5%的蜂蜜水飼養(yǎng)，幼蟲用玉米葉飼養(yǎng)，均放入恒溫培養(yǎng)箱中，溫度為（25±1）℃，相對濕度為70%，光周期為L∥D=16 h∥8 h。在實驗室飼養(yǎng)2代后用作試驗材料。

1.2 供試試劑與藥劑

TRIzol Reagent試劑購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、低熔點瓊脂糖購于Promega公司;3′RACE試劑盒、5′RACE試劑盒、DNA純化試劑盒和Taq DNA聚合酶購于TaKaRa公司;ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購于TOYOBO公司;2.5%高效氯氟氰菊酯乳油（EC）購于青島星牌作物科技有限公司，20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑（SC）購于美國杜邦公司;香豆素（coumarin）和吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol）購于合肥博美生物科技有限公司;其余試劑為國產(chǎn)或進口的分析純。由上海生工生物有限公司完成基因的測序和引物合成。

1.3 CYP9A113基因序列的克隆及分析

1.3.1 總RNA的提取以及cDNA的合成

選擇健康的4齡黏蟲幼蟲為樣本，采用TRIzol提取法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書合成cDNA，并保存于-20℃冰箱，剩余的RNA保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 全長基因序列的克隆

將GenBank上已經(jīng)登錄的甘藍夜蛾M.brassicae CYP9A90（KR676343）和棉鈴蟲Helicoverpa armigera CYP9A12（AY371318）基因的序列進行比對，設(shè)計黏蟲保守區(qū)上下游特異性引物Ms9A-F和Ms9A-R（表1）。以1.3.1中合成的cDNA為模板進行PCR擴增，將得到的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，目的片段膠回收測序。根據(jù)3′RACE和5′RACE試劑盒中自帶的引物3′RACE-Ro、3′RACE-Ri和5′RACE-Ro、5′RACE-Ri，分別設(shè)計對應(yīng)的嵌套引物Ms9A-3′RACE-Ro、Ms9A-3′RACE-Ri和Ms9A-5′RACE-Ro、Ms9A-5′RACE-Ri（表1）。按照試劑盒說明書，分別進行3′端序列和5′端序列的擴增，并進行膠回收測序。通過AlignX軟件將保守區(qū)序列、3′端序列和5′端序列進行拼接，得到完整的基因序列。再設(shè)計全長引物Ms9A-Full-F和Ms9A-Full-R（表1）克隆全長序列進行驗證，確定最終序列。

1.3.3 序列分析

該基因由國際P450命名委員會命名，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder （ORF Finder）將基因開放閱讀框翻譯成氨基酸序列;利用在線網(wǎng)站ExPASy （https：∥www.expasy.org/）進行功能域的預(yù)測;利用BioXM 2.6軟件進行蛋白質(zhì)分子量和等電點的計算;利用MEGA 5.1軟件采用鄰接（neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 殺蟲劑的誘導(dǎo)效應(yīng)

1.4.1 高效氯氟氰菊酯的誘導(dǎo)效應(yīng)

選取4齡第1天黏蟲幼蟲，稱量單個蟲體的重量，計算平均值，將2.5%高效氯氟氰菊酯EC用丙酮稀釋成5個不同濃度，分別為33.33、16.67、8.33、4.17、2.08 μg/mL，以丙酮為對照。每個濃度藥劑和對照均點滴0.5 μL于蟲體的第2～3腹節(jié)之間，每處理20頭，3次重復(fù)，于培養(yǎng)箱中正常飼養(yǎng)條件培養(yǎng)。24 h后檢查死亡蟲數(shù)，求出2.5%高效氯氟氰菊酯EC對黏蟲的LD10、LD30和LD50。

選擇4齡第1天黏蟲幼蟲進行試驗，分別點滴0.5 μL LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC于黏蟲幼蟲2～3腹節(jié)之間，每處理和對照均點滴40頭，共設(shè)3個重復(fù)，放在實驗室飼養(yǎng)條件下培養(yǎng)，于3、6、12、24和48 h分別收集3頭存活的幼蟲，于液氮中速凍，放在-80℃冰箱中保存。每個重復(fù)的3頭幼蟲混合提取RNA后，根據(jù)熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA模板。采用SYBR Green染料3步法進行熒光定量，利用Primer 5.0軟件設(shè)計熒光定量上下游引物Ms9A-RT-F和Ms9A-RT-R（表1），以黏蟲β-actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計上下游引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。在熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX Connect）中進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束記錄熔解曲線和相關(guān)數(shù)據(jù)，檢測LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC處理不同時間CYP9A113基因的表達情況。

1.4.2 氯蟲苯甲酰胺的誘導(dǎo)效應(yīng)

選擇4齡第1天黏蟲幼蟲進行試驗，饑餓處理12 h后利用ddH2O將20%氯蟲苯甲酰胺SC稀釋成5個不同濃度，分別為5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 μg/mL，以ddH2O為對照，每個濃度20頭黏蟲，3個重復(fù)。將玉米葉用打孔器打成直徑為1 cm的葉碟，其上點10 μL藥液晾干備用，每個培養(yǎng)皿中均放入1頭黏蟲和1片葉碟，葉碟吃光后用未處理正常葉片喂飼。24 h后檢查死亡蟲數(shù)，求出20%氯蟲苯甲酰胺SC對黏蟲幼蟲的LD10、LD30和LD50。

供試蟲體的選擇和試驗方法同上，分別用LD10、LD30和LD50進行處理，以ddH2O作為對照，每處理和對照均飼喂40頭，設(shè)3個重復(fù)，于3、6、12、24和48 h分別收集3頭存活的幼蟲，于液氮中速凍，放在-80℃冰箱中保存。提取RNA后，通過Real-time PCR檢測LD10、LD30和LD50的20%氯蟲苯甲酰胺SC處理不同時間CYP9A113基因的表達情況，具體步驟參照1.4.1。

1.5 植物次生代謝物質(zhì)的誘導(dǎo)效應(yīng)

選取4齡第1天幼蟲進行試驗，香豆素和吲哚-3-甲醇均設(shè)兩個濃度，分別為0.1和0.5 mg/mL，用加熱的無菌ddH2O稀釋到所需濃度，對照為加熱的無菌ddH2O。待溶液溫度降到室溫時，開始試驗，之后的試驗方法均參照1.4.2。提取RNA后，通過Real-time PCR檢測不同濃度的2種植物次生代謝物質(zhì)處理不同時間CYP9A113基因的表達情況，具體步驟參照1.4.1。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用DPS軟件進行回歸統(tǒng)計分析;采用2-ΔΔCt法計算熒光定量PCR相對定量數(shù)據(jù)結(jié)果;數(shù)據(jù)的多重比較和差異顯著性分析利用SAS 9.4軟件Duncan氏檢驗法進行（P < 0.05）;數(shù)值均以平均值±標準誤（SE）表示;圖表的制作以及相關(guān)數(shù)據(jù)的計算均在Excel 2010中進行;將每一時間點CK均設(shè)為1，同一時間點進行差異顯著性分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP9A113基因的鑒定及序列分析

通過克隆測序后拼接，進行序列全長的驗證后，得到一條包含1 752個堿基的P450基因序列，在NCBI上比對發(fā)現(xiàn)其屬于昆蟲CYP9A亞家族，經(jīng)國際P450命名委員會命名為CYP9A113（GenBank登錄號：KY436739）。CYP9A113基因編碼529個氨基酸，分子量約為60.4 kDa，等電點為8.81。在編碼的氨基酸序列中，具有P450基因的保守序列，分別為血紅素結(jié)合域（FGVGPRNCIG）、meander結(jié)合域（PEKFDPERF）、螺旋C（WKDMR）、螺旋I（AGFETV）和螺旋K（ELLR）（圖1）。

翻譯后的氨基酸在NCBI的BLAST上比對，找出與之相似的其他鱗翅目昆蟲的氨基酸序列，進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆的黏蟲M.separata CYP9A113（ARI68319）與甘藍夜蛾M.brassicae CYP9A13（AAR26518）、棉鈴蟲H.armigera CYP9A17（AAY21809）和美洲棉鈴蟲H.zea CYP9A12 （ABH09252）首先聚類，然后與斜紋夜蛾S.litura CYP9A39（ACV88722）和甜菜夜蛾S.exigua CYP9A9（BAG71410）聚類，再與草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda CYP9A58（AID55429）聚類，與六星燈蛾Zygaena filipendulae CYP9A36（ACZ97417）和家蠶Bombyx mori CYP9A19（BAM73827）等其他鱗翅目非夜蛾科昆蟲CYP9家族基因遺傳距離較遠，聚類結(jié)果基本符合形態(tài)分類特征（圖2）。

2.2 殺蟲劑對CYP9A113基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)

2.2.1 高效氯氟氰菊酯對CYP9A113基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)

經(jīng)過室內(nèi)毒力測定，2.5%高效氯氟氰菊酯EC對黏蟲4齡幼蟲的LD10、LD30和LD50分別為4.370 7（1.142 5～9.114 9）、18.771 4（8.957 0～28.947 1）和51.507 9（34.761 9～69.128 3）ng/g（表2）。

黏蟲幼蟲經(jīng)LD10和LD30的2.5%高效氯氟氰菊酯EC處理3 h，CYP9A113基因表達均被抑制，經(jīng)LD50處理3 h，CYP9A113基因相對表達量升高，呈現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng);LD10、LD30和LD50處理6 h，CYP9A113基因表達均被抑制;LD10、LD30和LD50處理12 h，CYP9A113基因表達均呈誘導(dǎo)效應(yīng)，相對表達量分別為對照組的2.5、2.0和2.1倍;LD10、LD30和LD50處理24 h，CYP9A113基因表達均呈誘導(dǎo)效應(yīng)，相對表達量分別為對照組的2.6、1.9和2.3倍;LD10和LD50處理48 h，CYP9A113基因相對表達量無明顯變化，LD30處理下，CYP9A113基因表達被抑制（圖3）。結(jié)果說明，2.5%高效氯氟氰菊酯EC對CYP9A113基因表達產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)與時間和劑量有關(guān)。

2.2.2 氯蟲苯甲酰胺對CYP9A113基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)

經(jīng)過室內(nèi)毒力測定，20%氯蟲苯甲酰胺SC對黏蟲4齡幼蟲的LD10、LD30和LD50分別為10.664 4（2.287 3～24.028 8）、49.980 0（21.438 3～80.395 8）和145.690 2（94.027 3～199.318 4）ng/g（表2）。

黏蟲幼蟲經(jīng)LD10、LD30和LD50的20%氯蟲苯甲酰胺SC處理3 h，CYP9A113基因相對表達量無明顯變化;3個劑量處理6 h，CYP9A113基因相對表達量均明顯降低;LD10處理12 h，CYP9A113基因表達呈誘導(dǎo)效應(yīng)，為對照組的3.9倍，LD30和LD50處理下無明顯變化;LD10、LD30和LD50處理24 h，均對CYP9A113基因表達有誘導(dǎo)效應(yīng)，分別為對照組的11.1、5.1和3.0倍;LD10處理48 h，CYP9A113基因表達呈誘導(dǎo)效應(yīng)，為對照組的2.1倍，LD30和LD50處理下與對照相比無顯著差異（圖4）。

2.3 植物次生代謝物質(zhì)對CYP9A113基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)

黏蟲幼蟲經(jīng)0.1和0.5 mg/mL香豆素處理3 h，CYP9A113基因表達均被抑制;處理6、12、24和48 h，均對CYP9A113基因的表達有誘導(dǎo)效應(yīng)，且均在處理6 h誘導(dǎo)作用最強，分別為對照組的2.7和2.8倍;高濃度處理12、24和48 h，CYP9A113基因表達量均顯著高于低濃度處理（圖5）。結(jié)果說明，不同濃度香豆素處理6 h后，可能對CYP9A113基因表達均產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，并且在12 h后，高濃度處理誘導(dǎo)效應(yīng)高于低濃度處理。

黏蟲幼蟲經(jīng)0.1和0.5 mg/mL的吲哚-3-甲醇處理3、6、12、24和48 h，CYP9A113基因表達均呈誘導(dǎo)效應(yīng)，低濃度處理48 h誘導(dǎo)作用最大，為對照組的2.0倍。高濃度處理12 h誘導(dǎo)作用最大，為對照組的2.4倍（圖6）。結(jié)果說明，不同濃度吲哚-3-甲醇處理不同時間，可能對CYP9A113基因表達均產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

細胞色素P450在合成具有關(guān)鍵生物學(xué)功能的內(nèi)源物質(zhì)和代謝天然或合成的外源化學(xué)物質(zhì)方面起重要作用[6]，長期以來一直是研究的熱點。本研究克隆黏蟲的一條P450基因CYP9A113，屬于在異物代謝和殺蟲劑抗性中起重要作用的CYP9家族基因，研究了其在合成殺蟲劑和植物次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)后的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源物質(zhì)對其有誘導(dǎo)效應(yīng)，而且是在一定劑量下經(jīng)過一定時間才產(chǎn)生，具有時間和劑量效應(yīng)。

已有研究表明，家蠶B.mori經(jīng)1 μL的98%氯氰菊酯（5 ng/μL）處理24 h，脂肪體中CYP9A22基因相對表達量升高[19]。飛蝗L.migratoria用3 μL溴氰菊酯（0.01、0.02、0.04、0.08和0.12 μg/mL）處理12 h，在3個較高濃度處理下CYP9AQ2基因表達量升高，存在劑量效應(yīng)[20]。甜菜夜蛾S.exigua經(jīng)0.01 mg/kg的95%氯蟲苯甲酰胺原藥處理36 h，CYP9A9基因表達誘導(dǎo)效應(yīng)最高，0.02 mg/kg處理12 h誘導(dǎo)效應(yīng)最高，存在時間和劑量效應(yīng)[11]。不同藥劑對不同昆蟲的同一家族P450基因產(chǎn)生的效應(yīng)也可能不同。在本研究中，黏蟲經(jīng)LD10和LD30的2.5%高效氯氟氰菊酯EC處理12 h和24 h，對CYP9A113基因表達有誘導(dǎo)作用，LD50處理3、12和24 h均可產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，說明基因的誘導(dǎo)反應(yīng)與時間和劑量有關(guān)。LD50處理6 h，基因表達量降低，可能是由于蟲體特殊生理過程對其造成影響，3個劑量處理48 h均無誘導(dǎo)反應(yīng)，可能因為細胞色素P450酶系的合成是個耗能過程，不會一直保持高含量，當(dāng)需要時產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，藥劑毒性逐漸消失，誘導(dǎo)作用也會慢慢消失。黏蟲經(jīng)LD10的20%氯蟲苯甲酰胺SC處理12、24和48 h，CYP9A113基因表達呈誘導(dǎo)效應(yīng)，LD30和LD50處理24 h產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，同樣具有時間和劑量效應(yīng)，在開始的時間點沒有誘導(dǎo)效應(yīng)產(chǎn)生，并且劑量高，產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)時間晚，可能是由于蟲體產(chǎn)生中毒反應(yīng)，無法及時進行調(diào)節(jié)。

植物產(chǎn)生有毒物質(zhì)防止被侵害，昆蟲體內(nèi)物質(zhì)也會相應(yīng)調(diào)節(jié)進行解毒進而能夠取食植物，二者相輔相成，共同進化[12]。已有研究表明香豆素和吲哚-3-甲醇可對昆蟲P450基因產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。吲哚-3-甲醇處理飛蝗L.migratoria 24 h，可誘導(dǎo)CYP6HL1和CYP6FE12基因的表達[14];斜紋夜蛾S.litura脂肪體中CYP4M14和CYP4S9基因表達均可被香豆素誘導(dǎo)[12]，并且用高濃度香豆素處理48 h，CYP6AB14基因在中腸和脂肪體中的表達量均高于低濃度處理時的表達量，表現(xiàn)出劑量效應(yīng)[13]。本試驗將黏蟲用0.1和0.5 mg/mL香豆素處理3 h，基因表達無誘導(dǎo)效應(yīng)，可能是因為其對蟲體產(chǎn)生較大刺激，未能及時做出反應(yīng)。處理6、12、24和48 h，均有誘導(dǎo)效應(yīng)，并且高濃度處理12、24和48 h基因相對表達量均顯著高于低濃度處理，與之前研究結(jié)果相似，存在時間和劑量效應(yīng)。0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇處理每個時間點，基因表達均被誘導(dǎo)，說明可能在一定時間和劑量范圍內(nèi)，吲哚-3-甲醇對CYP9A113基因表達均產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。

本試驗克隆了黏蟲的一條P450基因CYP9A113，并對外源物質(zhì)對該基因表達的誘導(dǎo)效應(yīng)進行了研究，初步探索了CYP9A113基因的功能及其與外源物質(zhì)的相互作用，為今后該基因的系統(tǒng)研究及其應(yīng)用于黏蟲的防治提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）