管慶霞 張悅 鄒淑君 孫爽 于欣 張偉兵 華曉丹 楊志欣 李秀巖 王艷宏

摘要：目的? 制備馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，對(duì)其進(jìn)行表征，并探討其體外釋藥規(guī)律。方法? 采用溶劑乳化超聲法制備馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。透射電鏡觀察其微觀形態(tài);Malvem激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑、Zeta電位及多分散指數(shù)（PDI）;差熱分析法分析馬錢(qián)子堿在載體中的存在形態(tài);動(dòng)態(tài)膜透析法研究馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外釋放行為，采用HPLC測(cè)定馬錢(qián)子堿含量，比較馬錢(qián)子堿溶液與馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體84 h內(nèi)的累積釋放度，并考察馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的釋藥機(jī)制。結(jié)果? 馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體透射電鏡下為完整的類球形實(shí)體粒子;粒徑為（137.20±1.11）nm，PDI為0.14±0.05，Zeta電位為（-34.40±0.32）mV;差熱分析結(jié)果表明馬錢(qián)子堿以分子態(tài)或不定形狀態(tài)存在于載體中;體外釋藥曲線符合Higuchi方程（R2=0.965 9），藥物釋放量于60 h趨于飽和，累積釋放量接近87%。結(jié)論? 馬錢(qián)子堿納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制劑學(xué)性質(zhì)良好，且與馬錢(qián)子堿溶液相比具有明顯的體外緩釋作用。

關(guān)鍵詞：馬錢(qián)子堿;納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體;動(dòng)態(tài)膜透析法;體外釋放;高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R283.5;R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）08-0066-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.014????? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To prepare Brucine nanostructure lipid carrier （NLC）; To characterize Brucine NLC; To study in vitro release characteristics of Brucine NLC. Methods Ultrasound emulsification solvent method was used to prepare the Brucine NLC. The microscopic morphology was observed by transmission electron microscopy; the particle size， Zeta potential and polydispersity index （PDI） were measured by Malvem laser particle size analyzer; DTA was used to analyze the presence of Brucine in the carrier; dynamic dialysis method was used to conduct the study on in vitro release of Brucine NLC. HPLC was used to determine the content of Brucine. Accumulative release rates of Brucine solution and Brucine NLC within 84 h were compared， and the drug release behaviors of Brucine NLC were investigated. Results Brucine NLC was observed under transmission electron microscopy as a complete spheroidal solid particle. The average particle size was （137.20±1.11） nm; PDI was 0.14±0.05; Zeta potential was （-34.40±0.32） mV. DTA results showed that Brucine existed as molecular or amorphous state in the NLC; the release curve of lyophilized powder was Higuchi equation （R2=0.965 9）; cumulative release was almost saturated within 60 hours; the cumulative release percentage was nearly 87%. Conclusion Brucine NLC has good formulation properties， and has a significant in vitro sustained release effect compared with Brucine solution.

Keywords： Brucine; nanostructure lipid carrier; dynamic membrane dialyse method; in vitro release; HPLC

馬錢(qián)子為馬錢(qián)科植物馬錢(qián)Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子，馬錢(qián)子堿為其有效化學(xué)物質(zhì)，同時(shí)也是毒性成分，是一種呈弱酸性的吲哚類生物堿[1]。馬錢(qián)子堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[2-3]，是一種高效的抗腫瘤單體，但因水溶性差、具有毒性等缺點(diǎn)[4-5]，制約其臨床應(yīng)用。如何將藥物導(dǎo)向于肝，使其更好地服務(wù)于臨床，已成為目前亟需攻克的難題。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructure lipid carrier，NLC）是為了克服固體脂質(zhì)納米粒的不足，采用納米技術(shù)對(duì)其進(jìn)行修飾而開(kāi)發(fā)的一種可負(fù)載活性成分的新型載體系統(tǒng)，具有毒性低、可控釋藥物、靶向性好、載藥量大、避免藥物降解與泄漏等特點(diǎn)[6-8]。其包載藥物后經(jīng)靜脈注射入血，能夠?qū)d的藥物濃集于肝、脾，降低藥物在其他組織中的分布。本課題組前期已經(jīng)成功制備了馬錢(qián)子堿NLC[9]，本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)其制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。

1? 儀器與試藥

Waters e2695-2698高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），AB265-S分析電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Autotune高強(qiáng)度超聲波細(xì)胞破碎儀（美國(guó)SONICS公司），DF-101Z恒溫磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司），SB-5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），WTC-1D/2D微機(jī)差熱天平（北京博飛儀器有限公司），Tecnai高分辨型透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司），HZS-HA水浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），透析袋（MW 8000～14 400，美國(guó)Sigma公司）。

馬錢(qián)子堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110706-200505，純度≥98%），馬錢(qián)子堿原料藥（日本和光純藥株式會(huì)社，批號(hào)059-17，純度≥98%），泊洛沙姆188（德國(guó)BASF公司，批號(hào)WOPG565B），磷鎢酸（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），Sephadex G-50葡聚糖凝膠（50～150 μm，上海浩然生物技術(shù)有限公司）;甲醇為色譜純，單硬脂酸甘油酯、油酸、無(wú)水乙醇等為分析純，水為蒸餾水。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備

稱取單硬脂酸甘油酯30 mg、油酸25 mg，置于燒杯中，加入無(wú)水乙醇2 mL，于60 ℃水浴條件下使其完全溶解，在恒溫磁力攪拌作用下加入馬錢(qián)子堿對(duì)照品1.28 mg，混勻，作為油相;量取濃度為1%的泊洛沙姆188 20 mL至另一燒杯中，于恒溫水浴中加熱到60 ℃，作為水相;將油相在60 ℃恒溫磁力攪拌作用下緩緩滴加到水相中，滴加完畢后，超聲3 min（功率750 W，頻率20 kHz），繼續(xù)室溫?cái)嚢?5 min，揮去無(wú)水乙醇，即得馬錢(qián)子堿NLC混懸液。

同時(shí)，以相同方法制備不含馬錢(qián)子堿的空白NLC混懸液。

2.2? 形態(tài)學(xué)觀察

取適量馬錢(qián)子堿NLC，用蒸餾水稀釋至適當(dāng)濃度，滴至覆蓋支持膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸去過(guò)量液體，放至自然干燥，滴加2%磷鎢酸染色約30 s，置于透射電鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，制備的馬錢(qián)子堿NLC呈完整的類球形實(shí)體粒子，粒子之間無(wú)明顯粘連，且分布較均勻。

2.3? 粒徑及Zeta電位測(cè)定

取馬錢(qián)子堿NLC適量，用蒸餾水稀釋至適宜濃度，輕搖振蕩，使其均勻分散，放入樣品池中，使用激光粒度分析儀測(cè)定樣品平均粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）和Zeta電位，各樣品平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，馬錢(qián)子堿NLC的粒徑為（137.20±1.11）nm，PDI為0.14±0.05，Zeta電位為（-34.40±0.32）mV，粒徑呈正態(tài)分布。

2.4? 包封率及載藥量測(cè)定

參考本課題組前期建立的方法[10]測(cè)定馬錢(qián)子堿NLC包封率和載藥量，結(jié)果顯示，平均包封率為（67.96±3.11）%，平均載藥量為（1.81±0.04）%。

2.5? 差熱分析

分別取適量馬錢(qián)子堿對(duì)照品、空白NLC、馬錢(qián)子堿NLC、馬錢(qián)子堿和空白NLC的物理混合物，于WTC-1D/2D微機(jī)差熱天平，設(shè)置升溫速度為10 ℃/min，從室溫升至500 ℃，進(jìn)行差熱分析實(shí)時(shí)監(jiān)控掃描，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯觯R錢(qián)子堿對(duì)照品的特征熔點(diǎn)峰為178 ℃，馬錢(qián)子堿和空白NLC的物理混合物出現(xiàn)馬錢(qián)子堿特征熔點(diǎn)峰，而馬錢(qián)子堿NLC的馬錢(qián)子堿特征熔點(diǎn)峰消失，表明馬錢(qián)子堿以非結(jié)晶態(tài)存在于馬錢(qián)子堿NLC內(nèi)，可能為分子態(tài)或不定形狀態(tài)。

2.6? 體外釋放介質(zhì)考察

2.6.1? 透析袋前處理

戴手套將透析袋剪為適宜長(zhǎng)度的小段，先用大量50%乙醇煮沸1 h，再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA（pH=8.0）溶液洗滌，最后用蒸餾水徹底洗凈，放入含50%乙醇的蒸餾水中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，保存過(guò)程中確保透析袋完全浸沒(méi)在溶液內(nèi)，使用前于釋放介質(zhì)中浸泡24 h。

2.6.2? 釋放介質(zhì)選擇

文獻(xiàn)報(bào)道馬錢(qián)子堿在PBS中的溶解度隨著乙醇含量的增加而增加[11-12]，故選擇分別含10%、20%、40%乙醇、pH 7.4的PBS，以及含0.1%吐溫-80、pH 7.4的PBS，進(jìn)行穩(wěn)定性和溶解度的考察。結(jié)果表明，馬錢(qián)子堿在40%乙醇、pH 7.4的PBS中溶解度最高，但是考慮到乙醇可使馬錢(qián)子堿NLC混懸液破乳，若乙醇含量過(guò)高則可能影響馬錢(qián)子堿NLC的穩(wěn)定性，最終選擇含20%乙醇、pH 7.4的PBS作為釋放介質(zhì)，既可達(dá)到漏槽條件，又不影響馬錢(qián)子堿NLC混懸液的穩(wěn)定性。

2.6.3? 釋放介質(zhì)穩(wěn)定性考察

精密量取5 mg馬錢(qián)子堿對(duì)照品，溶于50 mL含20%乙醇、pH 7.4的PBS，置于具塞溶出瓶中，設(shè)置恒溫水浴振蕩器溫度為（37.0±0.2）℃，振搖速度為（100±2）r/min，在0～48 h時(shí)間段內(nèi)抽樣測(cè)定藥物的峰面積，結(jié)果峰面積RSD=0.98%（n=9），表明在設(shè)定的溫度與時(shí)間內(nèi)，藥物與釋放介質(zhì)的穩(wěn)定性均滿足測(cè)定要求。

2.7? 體外釋放分析方法的建立

2.7.1? 色譜條件

采用Dikma C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水-乙酸-三乙胺（230∶2.4∶0.3）=30∶70，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

2.7.2? 對(duì)照品貯備液制備

精密量取馬錢(qián)子堿對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶中，用釋放介質(zhì)溶解并定容，即得132.00 μg/mL的馬錢(qián)子堿對(duì)照品貯備液。

2.7.3? 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密吸取馬錢(qián)子堿對(duì)照品貯備液，用釋放介質(zhì)稀釋，配制成濃度分別為132.00、66.00、33.00、16.50、8.25、2.45 μg/mL系列馬錢(qián)子堿對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程：Y=37 195X-2813.7，r2=0.999。結(jié)果表明，馬錢(qián)子堿在2.45～132.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.4? 回收率試驗(yàn)

在空白釋放介質(zhì)中分別加入馬錢(qián)子堿對(duì)照品各3份，使其濃度分別為66.00、16.50、8.25 μg/mL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果低、中、高濃度馬錢(qián)子堿平均回收率分別為98.22%、99.00%、98.50%，RSD分別為1.25%、1.45%、1.28%，符合含量測(cè)定要求[12]。

2.7.5? 精密度試驗(yàn)

精密吸取馬錢(qián)子堿對(duì)照品貯備液10 ?L，于同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)進(jìn)樣6 d，測(cè)定峰面積，計(jì)算日內(nèi)精密度及日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD=1.30%，日間精密度RSD=1.73%，表明日內(nèi)精密度及日間精密度均良好，符合含量測(cè)定要求[12]。

2.7.6? 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 ?L，分別于0、2、4、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果RSD=0.50%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.7? 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品6份，按“2.7.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果RSD=0.90%，表明本方法重復(fù)性良好[13]。

2.8? 體外釋藥行為研究

2.8.1? 體外釋藥曲線繪制

采用動(dòng)態(tài)膜透析法進(jìn)行馬錢(qián)子堿NLC體外釋放研究。精密稱取馬錢(qián)子堿NLC凍干品（相當(dāng)于馬錢(qián)子堿5 mg），用5 mL生理鹽水稀釋，確保使馬錢(qián)子堿NLC處于均勻混合狀態(tài)，轉(zhuǎn)入處理過(guò)的透析袋中，扎緊透析袋兩端，放入具塞錐形瓶中，精密量取50 mL釋放介質(zhì)（含20%乙醇、pH 7.4的PBS），放入具塞錐形瓶中，調(diào)整透析袋位置，使透析袋完全浸沒(méi)在釋放介質(zhì)中，放入恒溫水浴震蕩器中（溫度37.0 ℃±0.2 ℃，振搖速度100 r/min）。釋放開(kāi)始后，分別于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、10、12、18、24、36、48、60、72、84 h，用移液槍量取1 mL透析含藥外液，同時(shí)補(bǔ)充相同體積的透析空白外液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，計(jì)算馬錢(qián)子堿NLC的藥物累積釋放率。各時(shí)間點(diǎn)的藥物累積釋放率（Q）計(jì)算公式為：

式中，V0為釋放介質(zhì)的總體積（mL），Ct為各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度（?g/mL），V為每次取樣體積，W為投入藥物總質(zhì)量（mg）。

另精密稱取相同質(zhì)量的馬錢(qián)子堿原料藥，按上述方法操作，進(jìn)行體外釋藥研究。以累積釋放率對(duì)釋藥時(shí)間作圖，馬錢(qián)子堿原料藥與馬錢(qián)子堿NLC的藥物累積釋放曲線見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，在含20%乙醇pH 7.4的PBS釋放介質(zhì)中，馬錢(qián)子堿原料藥釋藥相對(duì)較快，12 h馬錢(qián)子堿已基本全部釋放，累積釋放率為94.66%，而馬錢(qián)子堿NLC前4 h釋藥較快，累積釋放率為30.86%，之后釋藥曲線漸趨平穩(wěn)，藥物緩慢釋放，48 h藥物基本釋放完全，72 h累積釋放率為86.74%?？梢?jiàn)，將馬錢(qián)子堿制成NLC具有一定的緩釋效果。

2.8.2? 體外釋藥動(dòng)力學(xué)擬合

采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi模型對(duì)馬錢(qián)子堿NLC的釋藥曲線進(jìn)行擬合[14]，回歸方程見(jiàn)表1。R2越接近1，表明方程的擬合效果越好。結(jié)果顯示，馬錢(qián)子堿NLC體外釋放擬合最好的是Higuchi方程（R2=0.965 9），屬于典型的緩釋模型，表明馬錢(qián)子堿NLC具有一定的緩釋作用。

3? 討論

NLC進(jìn)入體內(nèi)后，其行為表現(xiàn)及藥效作用的發(fā)揮很大程度上取決于自身的制劑學(xué)性質(zhì)，因此，制劑學(xué)性質(zhì)考察是對(duì)NLC進(jìn)行安全性、有效性、穩(wěn)定性評(píng)估的基礎(chǔ)。本課題制備的馬錢(qián)子堿NLC呈完整的類球形實(shí)體粒子，粒子之間無(wú)明顯粘連，粒徑較小，Zeta電位測(cè)定結(jié)果顯示粒子表面帶負(fù)電，存在電子斥力，粒子間不會(huì)發(fā)生聚集，其絕對(duì)值較高，體系較穩(wěn)定，可用于后續(xù)研究。

目前對(duì)納米粒釋藥機(jī)制的評(píng)價(jià)較單一，大多數(shù)情況采用模擬人體內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行體外釋藥試驗(yàn)研究，并據(jù)此推測(cè)藥物的體內(nèi)釋放行為。鑒于馬錢(qián)子堿在PBS中的溶解度隨著乙醇含量增加而增加的特點(diǎn)，本研究釋放介質(zhì)選擇含10%、20%、40%乙醇pH 7.4的PBS，及含0.1%吐溫-80、pH 7.4的PBS對(duì)馬錢(qián)子堿的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇20%乙醇pH 7.4的PBS作為馬錢(qián)子堿NLC的釋放介質(zhì)。體外釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，將馬錢(qián)子堿NLC具有緩釋特性，其釋放規(guī)律符合Higuchi方程。馬錢(qián)子堿NLC前期有突釋現(xiàn)象，推斷為部分藥物聚集在外層;后期藥物釋放緩慢，可能為被包埋的藥物通過(guò)納米粒微孔擴(kuò)散變得困難，藥物釋放主要取決于脂質(zhì)的溶蝕。馬錢(qián)子堿NLC在體內(nèi)以先快后慢的方式釋放藥物，先釋放的藥物可迅速起效，緩慢釋放的藥物可以持續(xù)作用，從而取得更好的治療效果。將馬錢(qián)子堿制備成納米制劑后通過(guò)靜脈注射給藥，可以避免口服給藥帶來(lái)的自身誘導(dǎo)代謝作用，提高靶向性。

藥物從NLC內(nèi)釋放的實(shí)際過(guò)程很復(fù)雜，與諸多因素有關(guān)，除藥物在納米粒中所處的位置因素外，還涉及載體材料、表面電荷、粒子密度、藥物與粒子間的物理化學(xué)作用，以及釋藥環(huán)境等諸多因素[15-18]。盡管NLC體外釋藥情況與體內(nèi)存在差別，但仍可在一定程度上反映體內(nèi)釋藥情況，為預(yù)測(cè)馬錢(qián)子堿NLC體內(nèi)釋藥情況提供依據(jù)，指導(dǎo)其處方設(shè)計(jì)和制備工藝的改進(jìn)。

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（收稿日期：2018-09-20）

（修回日期：2018-10-16;編輯：陳靜）