李 雷， 蔣林華

(上海理工大學(xué) 現(xiàn)代光學(xué)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200093)

過(guò)去的20年里，斑馬魚(yú)逐漸成為研究人類基因功能的重要模式動(dòng)物。因?yàn)樗鼈兊膲勖鄬?duì)較短，但與人類一樣，它們?nèi)匀粫?huì)逐漸老化。并且，由于它的生命周期短，適合做生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。此外，它的保守分子的廣泛表征細(xì)胞生理學(xué)使斑馬魚(yú)成為揭示老化，疾病和修復(fù)的潛在機(jī)制的極好模型。了解斑馬魚(yú)衰老基因的分子機(jī)制，例如氧化蛋白質(zhì)在肌肉中的積累都至關(guān)重要[1-2]。盡管沒(méi)有現(xiàn)成的斑馬魚(yú)衰老基因組，但大多數(shù)的性狀都需要涉及到一個(gè)復(fù)雜的分子之間相互作用，因此，衰老也不例外。

最近，有了更多關(guān)于斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)老化的消息，使得對(duì)于它的衰老分子機(jī)制的研究更加明朗。斑馬魚(yú)尤其有可能在老年學(xué)研究中具有很大的價(jià)值，因?yàn)榘l(fā)展 - 精神和基因研究的豐富性已經(jīng)推動(dòng)了基本斑馬魚(yú)生物學(xué)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的廣泛特征化。這種小型脊椎動(dòng)物具有幾個(gè)獨(dú)特的特征，為該領(lǐng)域提供許多優(yōu)勢(shì)。此外，大多數(shù)斑馬魚(yú)因組已被測(cè)序，并被證明與人類具有高度相似性，具有許多人類基因的直系同源物。一個(gè)復(fù)雜的哺乳動(dòng)物樣發(fā)育基因程序生成了一個(gè)整合的神經(jīng)系統(tǒng)，為此所有的主要腦區(qū)都被映射，并賦予這些斑馬魚(yú)高級(jí)認(rèn)知功能和社會(huì)行為[3]。此外，斑馬魚(yú)專用實(shí)驗(yàn)程序(獲得和喪失功能方法，體內(nèi)成像技術(shù))和資源(克隆，抗體)的廣泛可用性將進(jìn)一步支持老化。在之前的斑馬魚(yú)研究中，衰老一直被認(rèn)為是微不足道的，因?yàn)樗鼈兘?jīng)歷了不確定的生長(zhǎng)并具有非常強(qiáng)大的再生能力。過(guò)去二十年的不斷努力，已經(jīng)開(kāi)始研究出斑馬魚(yú)內(nèi)潛伏老齡化途徑，說(shuō)明了與其他脊椎動(dòng)物物種的許多相似之處。它們表現(xiàn)出相同的典型標(biāo)記和降低的β-半乳糖苷酶表達(dá)，并顯示出通常類似于人類中已知的年齡相關(guān)病理學(xué)的衰老表型和骨關(guān)節(jié)炎[13]。

研究表明，由于斑馬魚(yú)復(fù)雜和多效的性質(zhì)，其衰老狀態(tài)難以用少數(shù)特征來(lái)表征。越來(lái)越明顯的是，許多老齡驅(qū)動(dòng)因素相互關(guān)聯(lián)并產(chǎn)生相互影響。不幸的是，到目前為止，對(duì)于斑馬魚(yú)衰老分子機(jī)制的分子相互作用很少，所以高度需要斑馬魚(yú)衰老蛋白質(zhì)分子相互作用交互圖。在這種情況下，使用不同的動(dòng)物模型系統(tǒng)進(jìn)行精確的遺傳或藥理學(xué)操作確實(shí)可以在不同的生理系統(tǒng)和/或功能中鑒別衰老劑。因此，似乎只有將不同模型中的數(shù)據(jù)組合起來(lái)才有助于破譯造成老齡化的主要因素。

1 數(shù)據(jù)來(lái)源和分析

數(shù)據(jù)來(lái)源National Center of Biotechnology Information(NCBI)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，GPL1319平臺(tái)([Zebrafish] Affymetrix Zebrafish Genome Array)應(yīng)用于表達(dá)式陣列。本平臺(tái)的斑馬魚(yú)數(shù)據(jù)集包含12個(gè)樣本，下載這些數(shù)據(jù)(CEL表單)和注釋文件以進(jìn)行進(jìn)一步分析。由于智人與斑馬魚(yú)具有很高的同源性，最后從47 036個(gè)斑馬魚(yú)基因中，選擇了67個(gè)與智人具有同源性、具有代表性的斑馬魚(yú)衰老相關(guān)基因[4-7]。使用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后將獲得的67個(gè)基因放入NCBI的GEO數(shù)據(jù)集中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)85.38%的基因被用于功能基因組學(xué)研究，因此我們有理由相信這些數(shù)據(jù)可以作為斑馬魚(yú)衰老機(jī)制的基因。獲得原始數(shù)據(jù)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，使得GEO數(shù)據(jù)集中斑馬魚(yú)基因與人類基因之間的同源性系數(shù)在0到1之間，然后進(jìn)行單樣本T檢驗(yàn)方法鑒定Hgs(同源性基因)，得出GEO中與人類同源性高的斑馬魚(yú)基因。選擇置信區(qū)間為99%作為截止標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表1)。

表1 來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的同源化基因的分析結(jié)果Table 1 Analysis of homologous genes from the GEO database

2 同源性基因的功能性富集分析

KEGG(京都基因與基因組百科全書(shū))是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫(kù)。它是一個(gè)公認(rèn)的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)它是一個(gè)系統(tǒng)的分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫(kù)，它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究,包括各種生物化學(xué)途徑[5-8]。因此，在這項(xiàng)工作中，我們對(duì)Hgs應(yīng)用了KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)研究Hgs的富集分析，尋找可能影響斑馬魚(yú)衰老發(fā)生的生物化學(xué)途徑。DAVID用于進(jìn)行KEGG通路富集分析，p值<0.05，基因計(jì)數(shù)>2。為了進(jìn)一步了解Hgs的功能，DAVID應(yīng)用于識(shí)別顯著失調(diào)的KEGG途徑。來(lái)自所有衰老相關(guān)基因的p值<0.05和基因計(jì)數(shù)> 2獲得的途徑分別顯示在表2中。根據(jù)富集結(jié)果，顯著富集FoxO singaling pathway、ErbB singaling pathway、p53 singaling pathway、Focal adhesion等。其中也不乏一些之前預(yù)測(cè)像細(xì)胞新陳代謝之類的通路，我們有理由相信通過(guò)這些蛋白質(zhì)相互作用，可以得出或者預(yù)測(cè)之前不曾考慮到的斑馬魚(yú)致衰老因素[6]。

3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

由于蛋白質(zhì)很少獨(dú)立發(fā)揮其功能，因此通過(guò)研究蛋白質(zhì)的較大功能群來(lái)了解這些蛋白質(zhì)的相互作用是重要的[9-10]。所以在這項(xiàng)研究中，STRING在線工具被用來(lái)分析Hgs的PPIs，其綜合得分> 0.15的截止標(biāo)準(zhǔn)。從以前的研究中，大多數(shù)獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)服從無(wú)標(biāo)度歸因[16-18]。同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度被分析并用于獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中的中樞蛋白質(zhì),選擇連接度>35作為中樞節(jié)點(diǎn)，并預(yù)測(cè)可能在斑馬魚(yú)的衰老研究進(jìn)展中占重要比重。STRING工具被用來(lái)獲得Hgs的PPI關(guān)系[11-12]。綜合得分> 0.4時(shí)，共獲得767個(gè)PPI關(guān)系。在濾除了度數(shù)≤5的節(jié)點(diǎn)后，我們最終構(gòu)建了包含78個(gè)節(jié)點(diǎn)和478個(gè)邊的網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖1)。計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)的連通度，輸出見(jiàn)圖2。高連接度>35的這些基因(kita、mapk3、mapk1、ptneb、kras、mtor、jak2b、hrasb、sirt1、myca、pickc3、arf1)被選為影響斑馬魚(yú)衰老的重要因素。

表2 同源性基因的KEGG通路分析Table 2 Analysis of the KEGG pathway of homologous genes

圖1 通過(guò)STRING在線工具獲取網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)選定的一些中心基因進(jìn)行標(biāo)記Fig.1 Network map obtained through the STRING online tool with some selected central genes marked

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的連通度Fig.2 Connectivity of each node in PPI network

4 同源性基因的網(wǎng)絡(luò)模塊分析

由于PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)和邊緣非常復(fù)雜，我們需要使用ClusterONE Cytoscape插件進(jìn)行富集分析。在運(yùn)行ClusterONE Cytoscape以披露PPI網(wǎng)絡(luò)的豐富功能模塊之前，設(shè)置參數(shù)最小尺寸> 5且最小密度<0.05。我們還對(duì)模塊基因進(jìn)行了GO(基因本體論)功能富集分析，以分析分子水平上的基因功能。此外，我們還使用DAVID進(jìn)行最佳富集模塊KEGG通路富集分析，同時(shí)進(jìn)行了Kmeans聚類。PPI網(wǎng)絡(luò)富集是研究和鑒定功能蛋白質(zhì)的主要方法之一[23]。在這項(xiàng)研究中，有8個(gè)重要模塊(p值<1×10-3)通過(guò)ClusterONE Cytoscape插件進(jìn)行富集，參數(shù)最小> =5，最小密度<0.05。最重要的富集模塊A(p=1.0×10-3)，模塊B(p=9.083×10-5)和模塊C(p=1.2×10-3)如圖3所示。根據(jù)圖3，顯然模塊A可能是最好的模塊，因?yàn)樗?2個(gè)節(jié)點(diǎn)和487條邊，而模塊B有10個(gè)節(jié)點(diǎn)和44條邊，模塊C有7個(gè)節(jié)點(diǎn)和21條邊[15]。為了進(jìn)一步研究腫瘤進(jìn)展過(guò)程中的功能變化，我們?cè)谀KA中進(jìn)行了GO功能注釋[19-20]。模塊A的 GO富集分?jǐn)?shù)分別為18.28。因此，模塊A可能是進(jìn)一步功能分析最合適的模塊。模塊A中有42個(gè)基因(見(jiàn)圖3)，它們和之前我們所假設(shè)的中樞基因不謀而合，所假設(shè)的中樞基因也在圖一中標(biāo)注出來(lái)。因此模塊A可能是進(jìn)一步功能分析最合適的模塊。模塊A有42個(gè)基因，它們?cè)诩?xì)胞老化、細(xì)胞周期、代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程功能富集，然后通過(guò)KEGG富集分析研究結(jié)果。

5 結(jié) 果

本項(xiàng)目介紹了斑馬魚(yú)這種模式生物衰老機(jī)制，涵蓋了衰老相關(guān)的87個(gè)蛋白質(zhì)之間的767個(gè)相互作用。這不僅包含準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的PPI，還包含從文獻(xiàn)收集以及實(shí)驗(yàn)所得的那些分子相互作用。然后進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)化，找到中樞基因(mapk1、mtor、tp35、kita、pik3cs、myca、sirt1、kras、mapk3、arf1、jak2b)，與后面的模塊富集得出的重要基因不謀而合。在對(duì)斑馬魚(yú)衰老過(guò)程進(jìn)行模塊A分析的過(guò)程中，得出生物調(diào)節(jié)、生物過(guò)程、分子代謝過(guò)程等功能富集，說(shuō)明端粒磨損、細(xì)胞老化對(duì)斑馬魚(yú)衰老過(guò)程中起到重要的作用[21-22]。同時(shí)，參考López-Otín等人(2013年)描述衰老與生物體的基本功能相關(guān)的九個(gè)主要參數(shù)，并且通常與衰老過(guò)程相關(guān)，進(jìn)一步佐證我們的預(yù)測(cè)。

圖3 Hgs的PPI模塊化分析中的模塊AFig.3 Module A in PPI modular analysis of Hgs

6 討論與展望

斑馬魚(yú)已成為脊椎動(dòng)物基因功能研究的熱門(mén)生物。該物種幾乎透明的胚胎以及通過(guò)基因敲低或過(guò)表達(dá)加速基因研究的能力已經(jīng)導(dǎo)致斑馬魚(yú)在脊椎動(dòng)物基因功能的詳細(xì)研究中的廣泛使用，并且越來(lái)越多地研究人類遺傳疾病[27-29]。但是，為了有效模擬人類遺傳疾病，了解斑馬魚(yú)基因和基因結(jié)構(gòu)與直系同源人類基因的相關(guān)程度很重要。在這項(xiàng)研究中，根據(jù)斑馬魚(yú)與人類的同源性，從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)47 036個(gè)斑馬魚(yú)基因中，選擇了67個(gè)具有代表性的斑馬魚(yú)衰老相關(guān)基因。這些基因大多富含生物過(guò)程和生物調(diào)節(jié)，部分基因富含細(xì)胞代謝過(guò)程等。

通過(guò)分析網(wǎng)絡(luò)中的功能富集，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有很多重要的生物過(guò)程[24-26]。P53是許多的腫瘤類型起著腫瘤抑制劑的作用，根據(jù)生理情況和細(xì)胞類型誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯或細(xì)胞凋亡。作為反式激活因子參與細(xì)胞周期調(diào)控，通過(guò)控制該過(guò)程所需的一組基因來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂。其中一個(gè)激活的基因是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)似乎是通過(guò)刺激bax和fas抗原表達(dá)或通過(guò)抑制Bcl-2表達(dá)來(lái)介導(dǎo)的。

此外，使用STRING工具獲得Hgs的PPI關(guān)系，并獲得了具有87個(gè)節(jié)點(diǎn)和767個(gè)邊緣的網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，選擇kita、mapk3、mapk1、ptneb、kras、mtor、jak2b、hrasb、sirt1、myca、pickc3、arf1作為集線器節(jié)點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兊倪B通度> 35。最后，我們進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)的模塊分析。含有42個(gè)基因的模塊A被證明與斑馬魚(yú)衰老密切相關(guān)[14-15]。通過(guò)GO分析，模塊A中的基因在生物調(diào)節(jié)、生物過(guò)程,分子代謝過(guò)程等功能富集，說(shuō)明端粒磨損、細(xì)胞老化對(duì)斑馬魚(yú)衰老過(guò)程中起到重要的作用。

7 結(jié) 論

作為研究的結(jié)果，我們證實(shí)斑馬魚(yú)衰老機(jī)制與FoxO singaling pathway、ErbB singaling pathway、p53 singaling pathway、Focal adhesion、分子代謝過(guò)程有關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)mapk1、mtor、tp35、kita、pik3cs、myca、sirt1、kras、mapk3、arf1，jak2b等基因可能在衰老機(jī)制中發(fā)揮重要作用，并且它們是預(yù)測(cè)的源基因。