陳鴻儒， 陳 聰， 曾懷才

(南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南 衡陽(yáng)，421001)

miRNA(microRNA)是一類廣泛存在于動(dòng)植物和某些病毒內(nèi)，長(zhǎng)度為19-25 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，序列具有高度保守性[1]。miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或者降解，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[2]。

has-miR-10a-5p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的miRNA，屬于miR-10基因家族，其聚集在染色體17長(zhǎng)度為22 bp的位置中，具體基因位點(diǎn)在chr17：48 579 838-48 579 947處。近年國(guó)內(nèi)外研究表明，通過(guò)與靶基因相互作用，has-miR-10a-5p作為癌基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[3-7]。目前研究miR-10a-5p與腫瘤抑制和發(fā)展的相關(guān)問(wèn)題越來(lái)越多，所以對(duì)miR-10a-5p進(jìn)行靶基因相關(guān)生物信息學(xué)分析對(duì)今后探索miR-10a-5p功能和作用十分必要。相較于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，生物信息學(xué)能對(duì)靶基因及相關(guān)通路進(jìn)行大量多樣高速的預(yù)測(cè)。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-10a-5p的靶基因，并對(duì)其靶基因集合進(jìn)行功能注釋(Gene Ontology, GO )和信號(hào)通路富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome Pathway, KEGG Pathway)，為后續(xù)對(duì)miR-10a-5p 的靶基因鑒定及生物學(xué)功能研究提供理論基礎(chǔ)和思路。

1 資料與方法

1.1 miR-10a-5p的基本生物學(xué)信息

使用在線工具miRbase(http://www.mirbase.org/)查找miR-10a-5p的染色體定位、堿基序列及不同動(dòng)物的成熟序列。并使用clustalx 2.1軟件分析物種保守性。

1.2 miR-10a-5p靶基因的預(yù)測(cè)分析

使用Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)查找已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-10a-5p靶基因的相關(guān)信息。采用Targetscan7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRDB(http://www. http://mirdb.org/)、 mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index_ confirm.jsp)和DIANA TOOLS(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php)4個(gè)在線靶基因預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)miR-10a-5p的靶基因，并用Venny 2.1 (http://bioinfogp. cnb. csic.es/tools/venny/index.html)繪制4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶基因的韋恩圖，取交集用于后續(xù)分析。

1.3 miR-10a-5p靶基因的GO功能注釋及KEGG富集分析

使用在線工具DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對(duì)交集靶基因進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析(GO分析)，細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)，用超幾何分布檢驗(yàn)，以P<0.05為顯著性閾值，得到具有統(tǒng)計(jì)意義前10個(gè)GO注釋分析。

用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中KEGG Pathway分析對(duì)交集靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，具有統(tǒng)計(jì)意義前10個(gè)信號(hào)通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-10a-5p的序列保守性分析

使用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miR-10a-5p的成熟序列，miR-10a-5p在已知的31個(gè)物種中存在成熟序列，并且使用數(shù)據(jù)庫(kù)下載了人(hsa)、小鼠(mmu)、大鼠(rno)、斑馬魚(dre)等15個(gè)物種的成熟序列(見圖1)。利用clustalx 2.1軟件，對(duì)其序列保守性進(jìn)行分析，結(jié)果表明miR-10a-5p在各物種之間具有高度的保守性的成熟序列為“uacccuguagauccgaauuugug”(見表1)。

表1 不同物種miR-10a-5p的成熟序列Table 1 Mature sequence of miR-10a-5p in different species

圖1 不同物種miR-10a-5p的成熟序列Fig.1 Mature sequence of miR-10a-5p in different species

2.2 miR-10a-5p的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

Pubmed檢索文獻(xiàn)表明，miR-10a-5p通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后(見表2)。選用TargetScan、miRDB、mirDIP和DIANA TOOLS 4個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶基因個(gè)數(shù)分別為341、233、660和472，用Venny 2.1對(duì)上述結(jié)果繪制韋恩圖取交集，得到79個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的數(shù)據(jù)集(見表3)。作為后續(xù)分析的基因總集合(見圖2)。

表2 miR-10a-5p調(diào)控的靶基因參與人類疾病Table 2 miR-10a-5p target genes involved in human disease

表3 miR-10a-5p調(diào)控的靶基因數(shù)據(jù)集Table 3 Target gene data sets regulated by miR-10a-5p

圖2 miR-10a-5p的預(yù)測(cè)靶基因個(gè)數(shù)Fig.2 Predicted number of target genes of miR-10a-5p

2.3 miR-10a-5p預(yù)測(cè)靶基因的GO功能注釋

將4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均能預(yù)測(cè)到的79個(gè)靶基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p的靶基因主要富集于核質(zhì)、突觸、細(xì)胞間粘附鏈接、核基質(zhì)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等10個(gè)細(xì)胞組分(P<0.05，見圖3)；參與肝臟發(fā)育、脂肪組織發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的起始、RNA聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄等10個(gè)生物學(xué)過(guò)程(P<0.05，見圖4)；顯著富集于染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活性激活、RNA聚合酶Ⅱ遠(yuǎn)端增強(qiáng)子序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等9個(gè)分子功能(P<0.05，見圖5)。

圖3 miR-10a-5p靶基因細(xì)胞組分的GO功能分析Fig.3 GO function analysis of cell components of miR-10a-5p target gene

圖4 miR-10a-5p靶基因生物學(xué)過(guò)程的GO功能分析Fig.4 GO function analysis of the biological process of miR-10a-5p target gene

圖5 miR-10a-5p靶基因分子功能的GO功能分析Fig.5 GO function analysis of molecular function of miR-10a-5p target gene

2.4 miR-10a-5p預(yù)測(cè)靶基因的KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中的工具Functional Annotation對(duì)靶基因集合進(jìn)行生物通路富集分析，其中79個(gè)靶基因具有相關(guān)的生物通路。以人類全基因組為背景，發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p的靶基因在cAMP信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及AMPK信號(hào)通路中顯著富集(見圖6)。

圖6 miR-10a-5p靶基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of predicted target of miR-10a-5p

3 討 論

近年來(lái)，與miRNA相關(guān)的內(nèi)容已成為研究的熱點(diǎn)之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA能夠通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)從而發(fā)揮其功能，包括重要的生命活動(dòng)，如細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞凋亡以及新陳代謝[9]，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移[10]，以及治療、預(yù)后[11]等方面都有重要作用。而生物信息學(xué)在miRNA靶基因的預(yù)測(cè)等研究中發(fā)揮了重要作用，本研究預(yù)測(cè)靶基因使用了四種計(jì)算方法不同的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行，考慮到miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的序列保守性、序列匹配、miRNA 與mRNA 雙鏈結(jié)合的熱穩(wěn)定性等因素來(lái)預(yù)測(cè)靶基因，具有高特異性和低假陽(yáng)性率，將預(yù)測(cè)的靶基因取交集后作為靶基因集合，因此它作為分析的靶基因集合具有很好的代表性。

本研究中預(yù)測(cè)得到總共79個(gè)miR-10a-5p的靶基因, 靶基因存在細(xì)胞的各個(gè)組分中，具有染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活性激活、RNA 聚合酶Ⅱ遠(yuǎn)端增強(qiáng)子序列特異性DNA結(jié)合和其它分子功能，并顯著富集于肝臟發(fā)育、脂肪組織發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；顯著富集于cAMP信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路及AMPK信號(hào)通路。大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a-5p在細(xì)胞增殖和分化[11-12]過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，有研究發(fā)現(xiàn)，阿茲海默癥(AD)中淀粉樣蛋白-β或TAU病理誘導(dǎo)的神經(jīng)元miR-10a-5p的升高[13]，推測(cè)miR-10a-5p能調(diào)控神經(jīng)元及突觸的轉(zhuǎn)錄[14]。研究還表明滑膜細(xì)胞中miR-10a-5p的下調(diào)有助于TBX5控制的關(guān)節(jié)炎癥[15]，并起到抑制各種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的作用。

大量研究表明，miR-10a-5p在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。例如，miR-10a-5p在宮頸癌和人胰腺導(dǎo)管腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[3,5]。然而，一些研究發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p在多種癌細(xì)胞中低表達(dá)，如膽管癌、腎細(xì)胞癌[4,7]。近年來(lái)，一些研究證實(shí)miR-10a-5p通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因在抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用，例如miR-10a-5p可通過(guò)抑制MAPK8IP1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移[6]。在細(xì)胞凋亡和其他腫瘤過(guò)程中,已經(jīng)鑒定了miRNA表達(dá)的雙相模式(上調(diào)和下調(diào))，因此miR-10a-5p未來(lái)或許可以考慮作為腫瘤的早期診斷[16]和預(yù)后[17]的分子生物標(biāo)志物及治療腫瘤的潛在靶標(biāo)[18-19]。

4 結(jié) 論

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-10a-5p的GO功能富集分析和Pathway通路富集分析等數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的挖掘，結(jié)果顯示miR-10a-5p在生長(zhǎng)發(fā)育及腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用不容忽視，且本研究結(jié)果與現(xiàn)有對(duì)miR-10a-5p調(diào)控作用的研究報(bào)道基本一致，說(shuō)明生物信息學(xué)分析具有可靠性。這些分析為有關(guān)miR-10a-5p在各生物學(xué)過(guò)程中的作用機(jī)制后續(xù)研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持和探索思路。但由于預(yù)測(cè)靶基因過(guò)程中仍存在不可避免的假陽(yáng)性率，因此，由本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出的靶基因還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其功能和相關(guān)信號(hào)通路也有待進(jìn)一步研究。