肖志友，司恒丹，王建文，張 鑫，肖茹嶧，劉益飛

(貴州理工學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003)

半胱氨酸(Cysteine)是人體內(nèi)不可缺少的一種含巰基氨基酸，它在人體中許多重要的細胞功能如蛋白質(zhì)合成、解毒、新陳代謝等方面起著非常重要的作用[1-2]。半胱氨酸的缺乏可能會導(dǎo)致許多癥狀，如兒童生長緩慢、頭發(fā)褪色、肝臟損害、嗜睡等[3]。然而，過高的半胱氨酸水平也可能會引起心血管疾病、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥和妊娠胎兒神經(jīng)管缺陷等[1,3-4]。因此建立簡單、靈敏測定半胱氨酸的傳感器具有重要意義。

DPPZ(dipyridophenazine)類金屬釕(Ⅱ)配合物，如Ru(phen)2(dppz)2+,Ru(phen)2(dppx)2+,Ru(bipy)2(dppz)2+和Ru(bipy)2(dppx)2+(其中phen= 1,10-phenanthroline; dppz= dipyridophenazine; dppx= 7,8-dimethyldipyrido phenazine; bipy= 2,2-bipyridine)等，在水溶液中熒光被猝滅；當溶液中含有雙鏈DNA時，由于配體DPPZ插入堿基對中，疏水環(huán)境阻礙水分子對其熒光淬滅，熒光發(fā)射強度增加達104倍,具有良好的核酸分子“光開關(guān)”效應(yīng)[5-7]。利用釕配合物這一特性，該熒光探針廣泛應(yīng)用于金屬離子測定[5,8]，DNA單堿基錯配識別[9]，金納米粒子修飾DNA密度探測[10]等。我們在前面的研究中，利用釕配合物具有核酸分子“光開關(guān)”特性和Ag+穩(wěn)定含C- C錯配堿基的雙鏈DNA建立了測定銀離子的DNA熒光傳感器[5]。

最近有很多研究報道利用半胱氨酸能與銀離子發(fā)生強烈相互作用構(gòu)筑了測定半胱氨酸的傳感器[2,11-13]，這些傳感器雖然具有較好的靈敏度和選擇性，但很多需要對DNA末端進行熒光基團修飾，或需要利用其他納米粒子作為輔助傳感平臺。這里我們擬在前面基于釕配合物測定銀離子傳感器的基礎(chǔ)上，利用半胱氨酸與銀離子相互作用誘導(dǎo)銀離子穩(wěn)定的雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，被雙鏈DNA保護的釕配合物熒光發(fā)生淬滅，建立一種測定半胱氨酸的新型DNA熒光傳感器。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津RF-5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司)，北京普析TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)， pHS-3C pH計(上海雷磁儀器廠)，DC-1020低溫恒溫槽(寧波賽福實驗儀器有限公司)。

L-半胱氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硝酸鈉、硝酸銀(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，所有試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。含錯配胞嘧啶堿基C的寡聚脫氧核苷酸序列(Probe-1，5'-TAC ATA CTA TAC TAT CTA-3')購自上海生工生物工程有限公司。實驗所用核酸分子“光開關(guān)”試劑Ru(phen)2(dppx)(BF4)2·2H2O按照參考文獻合成[14](該釕配合物中phen為1,10-菲羅啉；dppx為7,8二甲基-吡啶并[3，2-a：2',3'-c]吩嗪)。

1.2 實驗方案

實驗方案如圖1所示，沒有半胱氨酸(Cysteine)存在時，含C-C錯配堿基對的自互補單鏈DNA(Probe-1)通過Ag+穩(wěn)定形成雙鏈DNA，釕配合物熒光探針Ru(phen)2(dppx)2+的熒光受到雙鏈DNA的保護，熒光發(fā)射較強；當溶液中有半胱氨酸存在時，其與銀離子發(fā)生強烈相互作用，失去銀子輔助穩(wěn)定的雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，釕配合物Ru(phen)2(dppx)2+的熒光得不到保護而明顯減弱，據(jù)此建立測定半胱氨酸的DNA熒光傳感器。

圖1 基于釕配合物熒光探針測定半胱氨酸DNA熒光傳感器的原理示意圖

Fig.1 Schematic diagram of DNA fluorescence sensor for the determination of cysteine based on Ruthenium complex as fluorescence probe

1.3 熒光發(fā)射光譜的測定

往500 μL含2.0 μmol/L Ru(phen)2(dppx)2+、120.0 mmol/L NaNO3、150.0 nmol/L Probe-1的20 mmol/L PBS(pH值 7.5)緩沖溶液塑料離心管中，加入200.0 nmol/L Ag+保留2 h。所得溶液加入不同濃度的半胱氨酸，再保留40 min，于RF-5301PC型熒光分光光度計上測定混合溶液的熒光發(fā)射光譜。熒光光譜儀的掃描參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長為460 nm，發(fā)射波長掃描范圍為500 ～700 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為5 nm。

1.4 解鏈曲線的測定

將兩支含3.0 μmol/L Probe-1、 9.0 μmol/L Ag+和120.0 mmol/L NaNO3的20 mmol/L PBS(pH值7.5)緩沖溶液的離心管，在水浴中加熱至93℃，該溫度下保持5 min，然后緩慢冷卻至室溫。往其中一支離心管中加入9.0 μmol/L半胱氨酸，反應(yīng)半小時后，將兩支離心管于4℃冰箱上層冷藏待用。取上述兩支離心管溶液加入微量石英比色皿中(比色皿厚度為1 cm)，通過紫外可見分光光度計測量不同溫度時加與不加半胱氨酸溶液在λ= 260 nm處的吸光度值，測量溫度范圍為10～60℃，每升溫2℃(恒溫5 min)記錄1次吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗可行性分析

為了檢驗該方法的可行性，我們對含銀離子、Probe-1和熒光探針Ru(phen)2(dppx)2+的混合溶液加半胱氨酸前后的熒光光譜進行對比分析。如圖2所示，不含半胱氨酸溶液的熒光發(fā)射強度較大(圖2a)，因為Ru(phen)2(dppx)2+插入到銀離子穩(wěn)定的自互補雙鏈DNA中，熒光得到保護而較強；當加入400.0 nmol/L半胱氨酸后，混合溶液的熒光發(fā)射強度(圖2b)明顯低于未加之前的熒光強度。實驗結(jié)果表明該方法可用于半胱氨酸的測定。

為進一步探討半胱氨酸的加入導(dǎo)致熒光強度降低的機理，我們采用紫外可見分光光度計測定加半胱氨酸前后Probe-1的解鏈曲線。如圖3所示，加半胱氨酸之前含銀離子Probe-1能看到約25℃的解鏈溫度(圖3a)，說明Probe-1通過銀離子的穩(wěn)定作用形成了雙螺旋結(jié)構(gòu)；而相同實驗條件下，加入半胱氨酸后，解鏈曲線(圖3b)上看不到明顯的解鏈溫度，說明加入半胱氨酸與銀離子發(fā)生作用后，Probe-1不再形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。該結(jié)果與上述熒光強度變化相吻合。

圖2 加半胱氨酸前(a)和后(b)含銀離子、Probe-1和 Ru(phen)2(dppx)2+混合溶液的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of the solutions containing Ag+, Probe-1 and Ru(phen)2(dppx)2+ in the absence(a) and presence (b) of 400 nmol/L cysteine

圖3 加(b)與不加(a)半胱氨酸Probe-1的解鏈曲線Fig.3 Melting curves of the solution containing 9.0 μmol/L Ag+and 3.0 μmol/L Probe-1 in the presence (b) and absence (a) of 9.0 μmol/L cysteine

2.2 線性范圍與選擇性

我們在前面測定銀離子傳感器[5]有關(guān)實驗條件基礎(chǔ)上，記錄加入不同濃度半胱氨酸時混合溶液的熒光發(fā)射光譜。如圖4所示，溶液的熒光強度隨著半胱氨酸濃度的增加而降低，半胱氨酸濃度與溶液在610 nm處熒光強度在0.0 ～160.0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：If= - 0.122 c + 57.09，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9928，檢出限(3δ/S)為13.8 nmol/L。

圖4 存在不同濃度半胱氨酸溶液的熒光光譜(A)和線性關(guān)系圖(B)

Fig.4 Fluorescence spectra (A) and linear diagram (B) of the solutions containing Ag+,Probe-1 and Ru(phen)2(dppx)2+

in the presence of different concentration of Cysteine (a-j): 0.0,20.0,40.0,80.0,120.0,160.0,200.0,300.0,400.0 nmol/L

為了檢驗該方法的選擇性，我們對160.0 nmol/L半胱氨酸(Cysteine，Cys)和1600.0 nmol/L 8種其他氨基酸 { L-異亮氨酸(Isoleucine,Ile)、組氨酸(Histidine,His)、L-賴氨酸(Lysine,Lys)、甘氨酸(Glycine,Gly)、L-胱氨酸(L-Cystine,Cysti)、L-丙氨酸(L-Alanine,Ala)、L-絲氨酸(L-Serine,Ser)、亮氨酸(Leucine,Leu)}進行對比分析，考察加氨基酸前后溶液的熒光強度改變值(ΔI)。如圖5所示，加半胱氨酸前后溶液的熒光變化值ΔI遠大于10倍其濃度的其他氨基酸，說明該方法用于半胱氨酸測定具有較好的選擇性，其他氨基酸對其測定不會有干擾。

圖5 方法的選擇性Fig. 5 Selectivity of the assay

3 結(jié)論

本文以釕配合物Ru(phen)2(dppx)2+作為熒光探針，以銀離子穩(wěn)定的含錯配胞嘧啶堿基的自互補DNA序列(Probe-1，5'-TAC ATA CTA TAC TAT CTA-3')作為傳感元件，當溶液中沒有半胱氨酸，熒光探針Ru(phen)2(dppx)2+插入銀離子穩(wěn)定的雙鏈DNA中，其熒光得到保護而有較強的熒光發(fā)射；當溶液中有半胱氨酸存在時，其與銀離子發(fā)生強烈相互作用，導(dǎo)致銀離子穩(wěn)定的雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，失去保護的Ru(phen)2(dppx)2+熒光強度明顯減弱。基于這一原理，我們建立了一種測定半胱氨酸的新型DNA熒光傳感器。在上述實驗條件下，溶液在610 nm處的熒光強度與半胱氨酸的濃度在0.0 ～160.0 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：If= - 0.122 c + 57.09，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9928，檢出限(3δ/S)為13.8 nmol/L。該方法僅需要一條DNA序列，無需對DNA進行熒光基團的修飾，方法操作簡單靈敏，具有較好的選擇性。