祝愛艷 梁 露 侯金雪 李昱昊 孫雪峰 楊延峰 王遠興

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

柑橘是世界上產(chǎn)量最大的水果，我國也是柑橘種植和產(chǎn)量大國之一[1]。贛南是中國臍橙主產(chǎn)區(qū)，贛南臍橙是屬于蕓香科、柑桔屬，特征為果頂有臍，像人的肚臍眼，故而得名，是江西省的一種名貴特產(chǎn)[2-3]。臍橙口感脆嫩，營養(yǎng)豐富，富含黃酮類、檸檬苦素類等多種活性成分[4]。大量研究表明，臍橙中的生物活性成分具有抗氧化，預(yù)防癌癥，調(diào)節(jié)免疫力，抗過敏，抗衰老等多種生理活性[5-7]。指紋圖譜是實現(xiàn)鑒別真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息量大，特征性強，整體性和模糊性等特點，已在環(huán)境保護、食品評價、中藥質(zhì)量控制[8-10]等許多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。紅外光譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用法、液-質(zhì)聯(lián)用法等方法均可生成指紋圖譜[11-17]。劉世堯[18]通過對奉節(jié)臍橙的指紋圖譜研究，對其質(zhì)量評價，建立了有效的指紋圖譜，并說明其具有偽冒果品鑒定的應(yīng)用價值。Wang 等[19]利用高效液相建立了龍葵的指紋圖譜，對其建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，進行質(zhì)量控制。主成分分析是一種多元統(tǒng)計分析技術(shù)，它是一種降維或者把多個指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標的一種方法[20]。唐會周等[21]通過主成分對市售臍橙的香氣成分進行分析，得到影響臍橙品質(zhì)的香氣成分，表明臍橙香氣成分的主成分分析可作為臍橙香氣品質(zhì)的評價方法。張曉麗等[22]利用熒光結(jié)合主成分對橙汁進行品質(zhì)鑒別，結(jié)果表明這兩種方法相結(jié)合可為橙汁品質(zhì)鑒別提供技術(shù)支持。超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)是復(fù)雜樣品中化學(xué)組成分析和鑒定的重要分析工具，能夠在缺少標品的情況下對粗提物中微量成分進行結(jié)構(gòu)分析、鑒定，具有高分辨率、高靈敏度、高選擇性、高質(zhì)量精度等優(yōu)點。

近年，隨著中國柑橘栽培面積的擴大，區(qū)域特色植物贛南臍橙受到周邊產(chǎn)區(qū)偽冒果品的嚴重影響。以其自身品質(zhì)特征為基礎(chǔ)，建立有效的真?zhèn)舞b定與品質(zhì)評價方法，可樹立贛南臍橙品牌，提高市場競爭力。本試驗中采用高效液相建立贛南臍橙指紋圖譜，通過比較相似度、共有峰分析其譜圖間差異性，利用主成分探討贛南臍橙在產(chǎn)地的分類情況，并用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）定性分析共有峰成分，以期完善贛南臍橙質(zhì)量評價體系，樹立贛南臍橙的品牌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用贛南臍橙采摘于瑞金、信豐和安遠等贛南和非贛南各地，見表1。采用新鮮、無病蟲害的贛南臍橙，每個地區(qū)在不同地方采集6 個點。每組樣品選取6 個大小均勻、無損傷的去皮、去核的果實，將其可食部分打碎混勻，用于試驗分析。

甲醇（色譜純），德國Merck 公司；甲酸（色譜純），ROE 公司；水，屈臣氏蒸餾水。

表1 贛南臍橙信息Table 1 The information of navel orange samples in Gannan

1.2 儀器與設(shè)備

AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，機械昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A 型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；料理機，九陽股份有限公司；Agilent1290高相液相色譜儀（四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD 檢測器），美國Agilent 公司；Agilent6538 高分辨率飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀 （配有Agilent1290 高效液相色譜儀、Agilent Mass Hunter 數(shù)據(jù)處理軟件與電噴霧離子源），美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備 精確稱取1.00 g 贛南臍橙果肉勻漿，加入2 mL 蒸餾水超聲提取20 min，置于離心機中5 000 r/min 離心20 min，將收集的上清液用0.22 μm 水系濾膜過濾，然后測定。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent-C18 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：以0.1%甲酸水溶液為流動相A 和甲醇為流動相B 進行梯度洗脫，洗脫梯度為0～12min，3%～30% B；12～27 min，30%～78% B；27～32 min，78%～95% B；32～37 min，95%～3% B。檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件 霧化氣壓力2.76×103Pa，干燥氣流速10.0 L/min，干燥氣溫度350 ℃，毛細管電壓4.0 kV，掃描方式為全掃正離子模式，掃描范圍（m/z）50～1 000。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用中國藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版”進行數(shù)據(jù)處理，對所得色譜圖進行比較，得到全面反映多個色譜圖特征的贛南臍橙的對照指紋圖譜，得到共有峰。將其共有峰中時間居中的峰作為參照峰，并以參照峰的峰面積為分母，各共有峰的峰面積為分子，求得其相對峰面積。利用SPSS22.0 軟件對共有峰進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗 按照樣品的制備方法隨機抽取同一批次的贛南臍橙制備樣液，1d 內(nèi)連續(xù)進樣6 次，測定液相色譜，考察色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結(jié)果表明：其色譜峰的相對保留時間和峰面積的比值基本沒有變化，各共有峰相對保留時間RSD≦0.39%，相對峰面積RSD≦2.39%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重現(xiàn)性試驗 隨機抽取同一批次的贛南臍橙樣品，按照制備方法平行制備6 份測試液，測定液相色譜，比較其相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間RSD≦0.62%，相對峰面積RSD≦2.56%，重現(xiàn)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批次的贛南臍橙制備的樣液，分別在制備后24 h 內(nèi)每隔4 h 進樣1 次，測定液相色譜，比較色譜峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果表明：各共有峰相對保留時間RSD≦0.28%，相對峰面積RSD≦1.76%，表明所制備的樣液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜的構(gòu)建

2.2.1 指紋圖譜的建立 將S1-S14 贛南臍橙樣品按1.3.1 節(jié)方法制備樣液，在1.3.2 節(jié)色譜條件下測定，得到各產(chǎn)地贛南臍橙的HPLC 圖。對其HPLC 圖經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)處理，獲得其高效液相對照指紋圖譜R，并建立14批贛南臍橙的指紋圖譜，見圖1[橫坐標為保留時間（min），縱坐標為所獲信號（mV）]。

圖1 14 批贛南臍橙的指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 14 batches of navel orange samples in Gannan

2.2.2 共有峰和參比峰的確定 根據(jù)14 批贛南臍橙指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的匹配功能，確定21 個色譜峰作為特征成分，組成其指紋圖譜，在對照指紋圖譜上標定21 個共有峰，見圖2。保留時間17.655 min即19 號共有峰峰面積相對穩(wěn)定，保留時間均一致，分離度良好，故選為參照峰，以其峰面積為1，計算其它各峰的相對峰面積。各產(chǎn)地臍橙的共有峰保留時間與相對峰面積見表2。由表2可知，各成分的色譜峰的相對峰面積有較大差異，說明其含量差別較大，可能是由于各產(chǎn)地贛南臍橙品種資源、生態(tài)環(huán)境、生長年限、地域性等條件的影響。

2.2.3 相似度評價 相似度作為中藥指紋圖譜的評價參數(shù)，可以最大限度地避免主觀因素影響，以實現(xiàn)對指紋圖譜整體相似性的客觀評價。采用中藥色譜指紋圖譜相似評價系統(tǒng)，以生成的對照指紋圖譜與其14 批樣品進行比較，結(jié)果見表3。

圖2 贛南臍橙的指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of the fingerprint of Gannan navel orange samples

表2 贛南臍橙指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 2 The relative peak areas of the flngerprints of common peaks of navel orange samples in Gannan

表3 14 批贛南臍橙的指紋圖譜間的相似度Table 3 The similarity of flngerprints from 14 batches of navel orange in Gannan

兩個n 維模式矢量夾角余弦越大 （接近1），它們越相似。由表3可知，14 批贛南臍橙樣品與對照指紋圖譜的相似度都在0.90 以上，表明所測樣品的組分具有很強的相似性，各組間成分較為一致。

2.3 贛南臍橙真?zhèn)蔚淖R別

實際應(yīng)用中，通常以相似度制定真?zhèn)舞b別標準，相似度低于該值的樣品可看作不合格的樣品，一般設(shè)置相似度0.8 為閾值。對樣品S15～S18 以同樣條件分析。以2.2 節(jié)建立的贛南臍橙紋圖譜為對照，利用中藥色譜指紋圖譜相似評價系統(tǒng)（2004.A）評價其相似度，結(jié)果見表3。根據(jù)相似度系數(shù)將樣品分2 類：第1 類是編號S15、S16 的樣品，相似度系數(shù)大于0.8；編號S17、S18 的樣品為第2 類，相似度系數(shù)小于0.8。根據(jù)相似度結(jié)果判定S15、S16 號樣品為贛南臍橙，S17、S18 號樣品非贛南臍橙，與檢測樣品本身屬性完全吻合。結(jié)果表明，本研究建立的贛南臍橙指紋圖譜可以很好地鑒別贛南臍橙和非贛南臍橙，進一步驗證所建立的贛南臍橙指紋圖譜的準確性，說明其具有鑒定偽冒果品的應(yīng)用價值。

2.4 主成分分析結(jié)果

SPSS22.0 軟件對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù)，對14 批不同產(chǎn)地贛南臍橙的21 個共有峰（變量）進行主成分分析，見表4。主成分的數(shù)目不僅要滿足數(shù)據(jù)降維的目的，而且要盡可能綜合多的信息，一般累積方差貢獻率不低于80%。由表4可知，可取前4 個作為主成分，其累計貢獻率達到85.75%，4 個主成分足以說明該數(shù)據(jù)的變化趨勢。

表4 4 個主成分的特征值及其貢獻率Table 4 Eigenvalues and cumulative contribution of 4 principal components

因子負荷反映各指標對主成分貢獻的大小，因子負荷的符號指各指標對改變主成分值的增減效果[23]。由表5可知，第1 主成分反映的指標主要有共有峰1，2，3，10，14，7，18，其中共有峰1 和共有峰2 對第1 主成分較強的逆負荷，說明其含量越高，第1 主成分值越少。共有峰3，10，14，17，18對第1 主成分有較強的正負荷，說明其含量越高，第1 主成分值較大，而剩下的共有峰對第1 主成分影響較小。同理可得第2 主成分和第3 主成分的主要影響指標。通過旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣表篩選共有的特征成分，發(fā)現(xiàn)決定性作用的化學(xué)成分。本試驗篩選出的特征成分未知，需要結(jié)合質(zhì)譜等手段進一步確定。

根據(jù)表2、表4和表5中2 的數(shù)據(jù)，以第1 主成分值為橫坐標，第2 主成分值為縱坐標，可得贛南臍橙在第1 和第2 主成分上的分布，還有21 個共有峰在第1 和第2 主成分上的分布，見圖3。

表5 旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣表Table 5 Load matrixes of postrotational common factors after spinning

由圖3a 可知，每個點都由原21 維空間的樣本點降維映射而來，反映14 個樣品的分類情況。由圖中各樣點的位置大致可將其分為4 類：Ⅰ類包括S10，S13；Ⅱ類包括 S3、S8、S11；Ⅲ 類包括S2；其余的歸為Ⅳ類。瑞金的地理位置和其他地方較遠，信豐、尋烏與剩下的地方相較遠，而剩下的地方較為相近，在主成分的得分圖上可以反映地理位置對其影響。由此可得地理位置相近，其各個成分的含量較為一致。由圖3b 可知，各共有峰對第1 和第2 主成分的影響，也可判斷主成分的主要影響指標。

圖3 贛南臍橙的主成分分析得分圖（a）和因子載荷圖（b）Fig.3 Score plot（a） and loading plot（b） from PCA of navel orange in Gannan

2.5 共有峰的鑒定結(jié)果

樣品經(jīng)1.3.1 節(jié)方法制備，在1.3.2 節(jié)色譜條件和1.3.3 節(jié)質(zhì)譜條件下測定，對其共有峰進行鑒定，結(jié)合離子碎片和相關(guān)文獻，可推斷3 個共有峰的化合物，見表6。

表6 贛南臍橙共有峰的UPLC-ESI-QTOF-MS 數(shù)據(jù)Table 6 UPLC-ESI-QTOF-MS data of common peaks of navel orange samples in Gannan

共有峰13 母離子[M+H]+m/z 為581.1829，共有峰18 母離子[M+H]+m/z 為581.1828，它們的二級質(zhì)譜都有m/z 為273.0758 即[M+H-308]+碎片離子峰，為丟失了m/z 308 的鼠李糖-葡萄糖的碎片離子。蕓香柚皮苷和柚皮苷為同分異構(gòu)體，相對分子質(zhì)量580，根據(jù)相關(guān)文獻[24]，[25]推斷：共有峰13 為蕓香柚皮苷，共有峰18 為柚皮苷。共有峰19母離子[M+H]+m/z 為611.1932，其二級質(zhì)譜特征碎片離子峰m/z 為465.1385，449.1434，431.1332，303.0856，二級質(zhì)譜特征碎片離子峰中的303.0856 是其丟失了m/z 為308 的鼠李糖-葡萄糖的碎片。根據(jù)文獻[26]推斷其可能為橙皮苷。

3 結(jié)論

利用高效液相譜建立了贛南臍橙不同產(chǎn)地臍橙的指紋圖譜，并對其化學(xué)模式進行識別。結(jié)果表明，樣品的出峰數(shù)目、分離度均較理想，并標定出21 個共有峰。通過其方法學(xué)考察和相似度計算，建立的指紋圖譜可較為全面地反映贛南臍橙的特征。同時準確鑒定了贛南和非贛南臍橙，為贛南臍橙的質(zhì)量控制提供了參考。利用主成分分析，將共有峰成功實現(xiàn)降維。由PCA 載荷得分結(jié)果，看前4個主成分累積貢獻率85.75%，由主成分的得分圖可以將贛南臍橙根據(jù)產(chǎn)地分為4 類。利用UPLCQ-TOF-MS 鑒別共有峰，結(jié)合質(zhì)譜信息和相關(guān)文獻，推斷3 個共有峰化合物分別是蕓香柚皮苷、柚皮苷和橙皮苷。

綜上所述，運用指紋圖譜和主成分分析可實現(xiàn)快速分析，發(fā)揮各自優(yōu)勢，互相驗證和補充，多角度綜合評判贛南臍橙的質(zhì)量。然而，對于共有峰未尚未全部鑒別。在今后的研究中，應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜對其它共有峰進行鑒別。同時擴大采樣范圍，加強研究的系統(tǒng)性和深入性，使研究結(jié)果更具實用價值。