趙宏強 藍蔚青* 孫曉紅 劉書成 謝 晶

（1 上海海洋大學食品學院 上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術服務平臺 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學）上海201306 2 廣東海洋大學食品科技學院 廣東湛江524088）

鱸魚（Lateolabrax japonicus）又名鱸板、花鱸、四肋魚等，屬鱸形目鱸科鱸屬經濟魚類，主要分布于太平洋西部與中國沿海，其中又以我國黃海、渤海較多。鱸魚肉質鮮嫩，營養(yǎng)價值豐富，其體內富含蛋白質、VA、VB、鈣、鎂、鋅、硒等營養(yǎng)元素，具補肝腎、益脾胃、化痰止咳功效，深受廣大消費者喜愛[1]。然而，由于魚肉中的營養(yǎng)物質與水分含量較高，魚體組織易受內源酶與微生物的作用，會代謝產組胺、硫吲哚、醛等腐敗物質，使魚肉產生不可接受的氣味，影響其食用與銷售。

水產品優(yōu)勢腐敗菌為水產品貯藏期間，對其腐敗過程起著主導作用的特定菌，其致腐能力要明顯強于其它細菌，對水產品貨架期有著密切關系[2]。近年來，國內外部分學者開始定量研究腐敗菌致腐能力。如Dalaaard 等[3]利用腐敗菌產生的腐敗代謝產物作為其腐敗能力的定量指標。許振偉等[4-5]進行腐敗菌致腐能力定量研究時，將腐敗菌接種至無菌魚塊，由貯藏過程中的感官與腐敗產物變化，以腐敗代謝產物——揮發(fā)性鹽基氮（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）與微生物生長量間的比例關系，表征優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力?；诖耍疚耐ㄟ^前期冷藏鱸魚優(yōu)勢腐敗菌的分離篩選，結合菌落形態(tài)觀察、生理生化實驗與16S rDNA 分子鑒定技術等方法對其分離菌株進行鑒定，以TVB-N 值與菌落總數作為定量指標，致腐因子YTVB-N/CFU 為定量標準，綜合評價優(yōu)勢腐敗菌菌株致腐能力，為后期研究鱸魚優(yōu)勢腐敗菌的作用機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料

鮮活鱸魚購于上海農工商港城超市，將原料保持鮮活狀態(tài)在30 min 內運回實驗室。

1.2 主要藥品試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基、VRBDA-腸道菌瓊脂培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；瓊脂糖、PCR 擴增試劑與合成擴增引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；天根細菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR 產物回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司等。

1.3 主要儀器與設備

DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；PowerPac Basic 電泳儀、Universal Hood II 凝膠成像儀，BIO-RAD 公司；Mastercycler6325 PCR 擴 增 儀、5427R 離 心 機，EPPENDORF 公司；AUW320 型分析天平，日本島津公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；FJ200-S 數顯高速均質機，杭州齊威儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；Kjeltec2300 型凱氏定氮儀，丹麥FOSS 公司；LDZM-40KCS-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠等。

1.4 試驗方法

1.4.1 優(yōu)勢腐敗菌分離純化 在無菌工作臺中隨機選取10 g 腐敗末期的鱸魚樣品，將其置于無菌均質袋中，加入90 mL 無菌生理鹽水封口后拍打2 min。取上清液1 mL，10 倍梯度稀釋，選擇3 個合適的稀釋度，每個稀釋度做3 次重復，傾注于含有不同選擇培養(yǎng)基的平板中。培養(yǎng)基選擇及培養(yǎng)條件見表1。

表1 不同微生物的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Selective culture media and conditions of different bacteria

從上述培養(yǎng)基的平板中挑取各種典型生長的菌落，在TSA 培養(yǎng)基上反復進行平板劃線分離，至少3 次劃線分離后得到純化單菌落[6]。最后，于TSB 肉湯中培養(yǎng)，30 ℃搖床培養(yǎng)18 h，使其菌數達到108CFU/mL 后低溫保存。

1.4.2 優(yōu)勢腐敗菌篩選 將分離純化多次的菌株培養(yǎng)至對數期后，用無菌生理鹽水制成菌懸液，搖勻，利用血球計數板直接測定菌液濃度，調整菌液濃度為105～106CFU/mL[7]。用無菌手術刀將鱸魚背部肉分割成約40 g 大小均勻的肉塊，先用75%酒精噴其表面，靜置10 s 后用無菌超純水清洗，然后使用酒精燈對鱸魚表面進行滅菌，再將鱸魚魚塊浸泡于調整過的菌液30 s 后取出放入無菌自封袋中，每種菌株接種2 個肉塊，以2 個未接種菌液的肉塊為對照，置于4 ℃冰箱下貯藏。

同時，參照Parlapani 等[8]法，由10 名訓練有素的感官評價人員組成評定小組，分別從樣品外觀、氣味與彈性3 個方面進行感官評價，將腐敗最快肉塊所接種的菌株作為篩選出的優(yōu)勢腐敗菌[9-10]，選取其中的優(yōu)勢腐敗菌進行菌種鑒定與致腐能力測定。

1.4.3 優(yōu)勢腐敗菌鑒定

1.4.3.1 菌落特征與菌體形態(tài)觀察 在TSA 培養(yǎng)基上多次純化的細菌，選取長勢比較好的單菌落，通過革蘭氏染色等方法對其菌落特征與菌體形態(tài)進行觀察。

1.4.3.2 傳統(tǒng)生理生化試驗 根據 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]與《伯杰細菌鑒定手冊》[12]對菌株進行氧化酶、產硫化氫、葡萄糖發(fā)酵、過氧化氫酶、明膠與山梨醇生理生化鑒定。

1.4.3.3 16S rDNA 鑒定 挑取重新培養(yǎng)18 h 的單菌落至液體培養(yǎng)基中過夜，采用天根細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒直接提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 鱸魚感官評價表Table 2 Sensory evaluation standards of Lateolabrax japonicus

以提取的菌液總DNA 作為模板，采用通用引物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R （5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）來擴增目的基因片段。采用25 μL 體系進行PCR 擴增，即Taq PCR Master Mix （2×）12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、上、下游引物各1 μL 及模板DNA 1 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進行35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用1×TAE 緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠[13]，取5μL 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙錠（EB）對其染色后，在凝膠成像儀中觀察電泳結果并拍攝電泳圖譜。每種菌株均獲得長度1.5 kb 左右的條帶，將PCR 成功的樣品委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

登錄網站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將測序所得16S rDNA 序列與核酸序列數據庫中已知序列進行同源比對，從中選取若干個相似性高的菌株序列，使用MEGA5.1 軟件，通過最大似然法（Maximum-Likelihood）做1 000 次隨機抽樣構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4 優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力測定 將篩選所得的優(yōu)勢腐敗菌按照1.4.2 節(jié)方法制得一定濃度的菌懸液，接種于滅菌的肉塊后放入無菌自封袋中4℃貯藏。將篩選得到的優(yōu)勢腐敗菌菌株接種到無菌的鱸魚魚塊上，以未接腐敗菌肉塊作對照，貯藏在4 ℃冰箱中，定期進行TVB-N 和菌落總數的測定。將TVB-N 產量因子YTVB-N 作為各優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的定量指標[14]。

1.4.4.1 TVB-N 值 參照食品安全國家標準——GB 5009.228-2016 《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15]進行鱸魚肉TVB-N 值測定。

1.4.4.2 菌落總數 參照食品安全國家標準——GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數法》[16]進行鱸魚肉菌落總數測定。

1.4.5 數據分析 使用MEGA 5.1 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。數據采用3 次平行試驗的平均值，結果用平均值±標準偏差表示。采用OriginPro 9.0 繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)勢腐敗菌的分離篩選

2.1.1 優(yōu)勢腐敗菌分離 對菌液采用選擇性培養(yǎng)基，分別在不同的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)，然后根據菌落生長情況，共選取12 株長勢較好、形態(tài)典型的菌落，其中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1 株（T1），VRBDA-腸道菌瓊脂培養(yǎng)基2 株（E1、E2），鐵瓊脂培養(yǎng)基4 株（S1、S2、S3、S4），假單胞菌CFC 選擇性培養(yǎng)基3株（P1、P2、P3），MRS 瓊脂培養(yǎng)基2 株（L1、L2）。

2.1.2 優(yōu)勢腐敗菌篩選 將選取的12 株典型菌株進行24 h 搖床活化，制成適量菌液，分別接種在無菌鱸魚樣品上，以未接種菌液的滅菌樣品作為對照組，分別進行感官分析。結果如圖1所示。

由圖1可知，貯藏初期，鱸魚樣品表面色澤鮮亮，具有固有清香，肌肉彈性堅實，指壓后凹陷立即消失，樣品新鮮度較好，接種細菌與未接種細菌的鱸魚樣品無差別，樣品初期品質相對一致。隨著貨架期的延長，鱸魚魚塊品質下降，樣品表面色澤亮度降低，逐漸產生不愉快的氣味，其中接種過菌液的魚塊感官分值明顯下降。S1、S2、P1、P2 與P3樣品的感官分值顯著下降，第7 天時，S2 組樣品的感官分值已腐敗嚴重，樣品表面黏液豐富，色澤暗黃，腐臭味明顯，感官呈不可接受。不同的微生物由于其生物學特性不同，對營養(yǎng)物質的利用也有所差異，其選擇性消耗魚肉中的營養(yǎng)物質，造成魚肉肉質腐敗速度的差異[17]。綜合感官評價結果，篩選出使鱸魚魚塊腐敗速度較快的5 株優(yōu)勢腐敗菌，分別為S1、S2、P1、P2 與P3，后期分別進行菌種鑒定和致腐能力測定。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌鑒定

2.2.1 細菌形態(tài)觀察 通過對上述優(yōu)勢腐敗菌的形態(tài)觀察，并作革蘭氏染色后鏡檢，觀察結果如表3所示。

圖1 不同優(yōu)勢腐敗菌對冷藏鱸魚感官分值的影響Fig.1 Effect of different spoilage organisms on sensory scores of Lateolabrax japonicus during chilled storage

表3 主要腐敗菌的菌落特征與菌體形態(tài)Table 3 Characteristics of bacterial colony and shape of strains in spoilage organisms

2.2.2 細菌生理生化特征 對優(yōu)勢腐敗菌進行氧化酶試驗、明膠試驗、山梨醇試驗、硫化氫試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵、3%過氧化氫酶等6 種傳統(tǒng)生理生化試驗，結果如表4所示。

表4 主要腐敗菌的生理生化鑒定表Table 4 Physiological-biochemical characteristics of mainspoilage bacteria

根據食品微生物鑒定圖譜，并結合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》與《伯杰細菌鑒定手冊》，通過鏡檢結果與生理生化試驗綜合評價，初步鑒定S1、S2為希瓦式菌屬，P1、P2、P3 為假單胞菌屬。冷藏鱸魚貯藏末期的優(yōu)勢腐敗菌分別為希瓦式菌屬與假單胞菌屬。

2.2.3 分子鑒定 對篩選的5 株優(yōu)勢腐敗菌進行分子鑒定，以5 株優(yōu)勢腐敗菌的總DNA 為模板進行PCR 擴增，并作凝膠電泳檢測。

從圖2可見，樣品在1.5kb 附近可見清晰明亮條帶，表明其PCR 擴增成功，可用于后期測序。將PCR 產物送至上海生工公司進行分子檢測，將檢測結果通過NCBI 軟件選取同源性最高的菌株序列，用MEGA5.1 進行多重序列對比，并以Maximum-Likelihood 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖3發(fā)育樹并結合NCBI 網站最高相似度菌種可知，P1 與假單胞菌屬親緣關系最近，P2、P3與草莓假單胞菌親緣關系最近，S1 與腐敗希瓦氏菌親緣關系最近，S2 與波羅的海希瓦式菌親緣性最近。綜合菌落形態(tài)特征、生理生化鑒定與分子鑒定，可知5 株優(yōu)勢腐敗菌中有1 株假單胞菌屬，2株草莓假單胞菌，2 株希瓦式菌屬。在前人研究中，楊憲時等[18]對羅非魚冷藏過程菌群變化研究發(fā)現，假單胞菌是羅非魚在0～10 ℃冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌。郭全有等[19]對0 ℃和5 ℃貯藏條件下大黃魚貨架終點時菌相研究發(fā)現，假單胞菌與希瓦式菌是冷藏養(yǎng)殖大黃魚的優(yōu)勢腐敗菌。希瓦式菌屬為革蘭氏陰性菌，運動桿菌，嗜冷性，是水產品中常見的典型腐敗菌，其腐敗能力較強，具有一定的還原能力，可將氧化三甲胺還原成三甲胺，伴隨著硫化氫的產生[20]。在有氧冷藏中，魚、貝類和甲殼類的特定腐敗菌 （Specific Spoilage Organisms，SSO）多為假單胞菌或腐敗希瓦氏菌，其中腐敗希瓦氏菌多為海洋溫帶水域的SSO，假單胞菌多為熱帶淡水魚的SSO。王慧敏等[21]研究了鱸魚在冷藏條件下，不同貯藏時間的腐敗菌菌群變化，發(fā)現希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas spp.） 細菌在整個貯藏時間內均存在，且隨貯藏時間的延長逐漸成為優(yōu)勢腐敗菌。

圖2 5 種菌株的16S rDNA 電泳圖譜（Marker：200bp）Fig.2 16S rDNA electrophoresis map of 5 strains（Marker：200bp）

圖3 基于16S rRNA 序列同源性的5 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 5 strains base on 16S rRNA gene analysis

2.3 優(yōu)勢腐敗菌的致腐能力分析

2.3.1 TVB-N 值 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是指肉類及水產品在貯藏期間肉中的蛋白質等含氮物質細菌與酶的作用下，分解產生氨類和胺等揮發(fā)性堿性含氮物質，是評價水產品新鮮度的重要指標，可反映分解產物的數量，評價水產品的新鮮度[22]。由國標可知，鱸魚肉的TVB-N 值＜13 mgN/100 g 為一級鮮度，TVB-N 值＞30 mgN/100 g 為已腐敗[23]。

由圖4可知，樣品在貯藏初期的TVB-N 值為（8.16±0.26）mgN/100 g，無顯著性差異（P＞0.05），在一級鮮度水平，表明接種初期，樣品中的腐敗菌未見增多?？赡苡捎趧偨臃N至樣品表面，細菌還未適應生長環(huán)境，并未快速生長繁殖產生代謝產物。然而，隨著貨架期的延長，接種腐敗菌的魚塊在第3 天時開始出現顯著性差異，表明此時樣品腐敗加劇，代謝產物增多。貯藏第7 天時，P3 組樣品的TVB-N 值達（49.88±0.84）mg N/100 g，處于極度腐敗，產生不可接受的刺激性氣味，這與感官評價結果一致，表明P3 在貯藏期間，微生物生長繁殖較快，消耗鱸魚營養(yǎng)物質產生代謝產物增多。S1，S2 組樣品的TVB-N 值分別是 （42.72±1.09）mg N/100g 與（43.05±0.53）mg N/100 g，兩組間無顯著差異（P＞0.05），可能由于兩種細菌同為同一種屬，其致腐能力相似。

2.3.2 菌落總數 菌落總數變化可反映蛋白質和氨基酸分解代謝情況，測定菌落總數是衡量鱸魚腐敗程度的重要參數。Al-Daqal 等[24]提出水產品可食用的菌落總數上限是6.0 lg（CFU/g）。當TVC值超過上限值，表明魚肉腐敗。

由圖5可知，貯藏初期，對照組樣品的菌落總數為（2.02±0.01）lg（CFU/g），符合要求。隨著貯藏時間的延長，接種腐敗菌魚肉的菌落總數均明顯高于對照組。S1 處理組樣品在貯藏末期的菌落總數增長緩慢，可能由于營養(yǎng)物質的消耗，樣品中的菌落生長逐漸趨于穩(wěn)定，從而維持在相對穩(wěn)定的數量級。第5 天時，接種腐敗菌鱸魚樣品的菌落總數均超過6.0lg（CFU/g），樣品已腐敗。不同菌株的生長情況會隨貯藏時間呈現顯著差異（P＜0.05），這可能與不同菌種的致腐機制有關。P1 組樣品的菌落總數在貯藏末期達（9.1l±0.05）lg（CFU/g），處于高度腐敗狀態(tài)。從圖中還可看出，各接種腐敗菌樣品的菌落總數在5 d 后處于生長平緩期。這可能由于鱸魚魚肉中營養(yǎng)物質隨著貯藏時間的延長而逐漸消耗，導致有機酸、胺類物質等代謝產物的積累，從而抑制其生長[25]。

圖4 冷藏條件下接種腐敗菌的鱸魚肉的TVB-N 值變化Fig.4 TVB-N values of the Lateolabrax japonicus inoculated with spoilage bacteria during chilled storage

圖5 冷藏條件下接種腐敗菌的鱸魚魚肉的TVC 值變化Fig.5 TVC values of Lateolabrax japonicus inoculated with spoilage bacteria during chilled storage

2.4 腐敗能力分析

由于不同腐敗菌所需營養(yǎng)物質不同，即生長代謝存在一定差異，因此將菌落總數與揮發(fā)性鹽基氮相結合，通過產量因子Y（TVB-N/CFU）定量表征各優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力。

從表5可看出，通過YTVB-N可判斷希瓦式菌屬的致腐能力高于假單胞菌屬，這可能由于希瓦式菌屬在對冷藏淡水鱸魚魚肉的利用特性上強于假單胞菌屬，其分解魚肉中的蛋白質產生的代謝產物有所不同，魚肉腐敗程度也有所差異。現有研究表明，希瓦式菌屬（Shewanella sp）是水產品腐敗菌中的一種，其腐敗活性強，能把氧化三甲胺還原成三甲胺，產生硫化氫等揮發(fā)性氣體[26]。此外，S1的致腐因子是16.30×10-8mgTVB-N/CFU、S2 的致腐因子是14.84×10-8mgTVB-N/CFU，兩者無顯著差異，表明其同源性很近，這與分子鑒定結果相符合。冷藏鱸魚的優(yōu)勢腐敗菌中，假單胞菌屬中草莓假單胞菌屬的致腐能力要強于一般假單胞菌屬，從P1、P2與P3 的產量因子大小可分析得出。

3 結論

通過對冷藏鱸魚優(yōu)勢腐敗菌的分離、篩選與鑒定，觀察菌落菌落形態(tài)，做生理生化實驗與16SrDNA 序列分析。所篩選的優(yōu)勢腐敗菌中，有1株假單胞菌屬（Pseudomonas sp.WCS374），2 株草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi P121、Pseudomonas fragi B-727）和2 株希瓦式菌屬（Putrefaciens Shewanella、Shewanella baltica OS185）。

表5 各種腐敗菌的TVB-N 產量因子Table 5 Yield factors of TVB-N of different spoilage bacteria

將篩選所得5 株菌株分別接種到滅菌鱸魚魚塊上，置于4 ℃條件下貯藏，通過TVB-N 產量因子（YTVB-N）比較得出，冷藏鱸魚的優(yōu)勢腐敗菌中，希瓦式菌屬細菌的致腐能力強于假單胞菌屬；假單胞菌屬中，草莓假單胞菌的致腐能力強于一般假單胞菌。