林 洋 崔天琦 呂欣然，2 白鳳翎* 勵(lì)建榮 沈 琳

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京100083 3 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116101）

嗜水氣單胞菌 （Aeromonas hydrophila）分布范圍廣，主要存在于土壤、淤泥、海水及淡水等環(huán)境中，是一種可以導(dǎo)致人-獸-水生動(dòng)物共患病發(fā)生的革蘭氏陰性條件致病菌，也可引起鯉魚、金錢魚、黃鱔和中華鱉等多種水生動(dòng)物出現(xiàn)敗血癥，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。嗜水氣單胞菌致病性與之產(chǎn)生的溶血素、蛋白酶及粘附素（菌毛和表面S 層蛋白）等毒力因子密切相關(guān)[2]。其毒力因子間通過協(xié)同作用產(chǎn)生毒性效應(yīng)且受細(xì)胞密度的調(diào)控，這種細(xì)胞密度依賴性調(diào)節(jié)被稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）[3]。QS 感應(yīng)之間的交流主要依靠信號(hào)分子的傳導(dǎo)，嗜水氣單胞菌的信號(hào)分子主要是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）[4]。同時(shí)，細(xì)菌QS 現(xiàn)象也是導(dǎo)致食品腐敗的主要方式之一，近年來已成為研究的熱點(diǎn)[5-6]。

細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm，BF）的形成、生物發(fā)光、毒性基因表達(dá)和胞外多糖的合成等都與QS 密切相關(guān)[7]。BF 是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中為適應(yīng)外界生存環(huán)境形成的一種生長(zhǎng)方式，形成生物膜的細(xì)菌具有極強(qiáng)的耐藥性[8-10]。如果利用傳統(tǒng)的抗生素來抑制BF 的形成，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生極強(qiáng)的耐藥性[11]。可從自然界中尋找生物源性群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitor，QSI），通過降低細(xì)菌生物膜的形成，抑制細(xì)菌QS 的方式，控制食品中腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)繁殖。

QSI 是只針對(duì)QS 系統(tǒng)具有抑制作用，而不干擾細(xì)菌體內(nèi)正常的生命活動(dòng)[12]。QSI 一般通過抑制信號(hào)分子合成，降低其受體蛋白活性或抑制信號(hào)分子合成酶，促進(jìn)信號(hào)分子的降解，與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體蛋白等4 種方式抑制細(xì)菌的群體感應(yīng)[13-14]。目前已從動(dòng)物、植物、微生物中獲得多種生物源性QSI[15]。其中，微生物源性QSI 主要來源于真菌和芽孢桿菌。Musthafa 等[16]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌（Bacillus sp.SS4） 代謝產(chǎn)物對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）生物膜和胞外蛋白酶的抑制率分別為33%和65%。Nakayama 等[17]發(fā)現(xiàn)放線菌（Streptomyces sp.）Y33-1 的次生代謝物siamycin I 可有效抑制糞腸球菌（Enterococcus faecalis）QS 系統(tǒng)所需明膠酶的產(chǎn)生，而不影響菌體的生長(zhǎng)。

乳酸菌廣泛分布于傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道及土壤淤泥等自然環(huán)境中，通過產(chǎn)生乳酸、雙乙酰、羅伊氏菌素以及乳酸菌素等方式抑制它種微生物的生長(zhǎng)繁殖[18]。乳酸菌生物防腐制劑具有安全、高效、綠色、無殘留等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品的防腐保鮮中。而對(duì)乳酸菌的代謝產(chǎn)物能否作為腐敗菌和致病菌的QSI 方面的研究國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。Park 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）NR28 能夠有效抑制大腸肝菌（Escherichia coli）ATCC43894 生物膜的形成，具有QS 抑制活性。

本文以水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌嗜水氣單胞菌為目標(biāo)菌株，以來源于傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的乳酸菌為供試菌株，從供試菌株乳酸菌中篩選可作為QSI 的菌株，并分析其產(chǎn)生的活性物質(zhì)，同時(shí)探究其對(duì)生物膜生成量和結(jié)構(gòu)的影響，為研發(fā)一種嗜水氣單胞菌QSI 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 乳酸菌菌株：AJS2-4（安徽績(jī)溪酸豆角）、AJX3-5 （安徽績(jī)溪腌雪菜）、LHJ1-5（遼寧葫蘆島腌芥菜）、LJS1-4（遼寧錦州酸菜）、LZH1-3（遼寧彰武酸黃瓜）、CY2-4（遼寧朝陽酸菜）、NNL1-5 （內(nèi)蒙古寧城酸辣椒） 和LDS513（遼寧大連酸黃瓜）。

指示菌株：紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026，自身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯（AHLs）類信號(hào)分子，僅當(dāng)外源AHLs 信號(hào)分子出現(xiàn)時(shí)，菌株才能夠產(chǎn)生紫色菌素，并檢測(cè)出環(huán)境中的信號(hào)分子C4-HSL～C8-HSL，保藏于本院微生物實(shí)驗(yàn)室。

目標(biāo)菌株：嗜水氣單胞菌 （Aeromonas hydrophila）LY-2，分離自腐敗大菱鲆體表，保藏于本院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑、儀器與設(shè)備

1.2.1 培養(yǎng)基和試劑 LB 肉湯、LB 瓊脂、MRS 肉湯、MRS 瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶（2.5×105U/g）、木瓜蛋白酶（2.0×105U/g）、中性蛋白酶（2.0×105U/g）、堿性蛋白酶（2.0×105U/g）、胃蛋白酶（1.5×105U/g），華藍(lán)化學(xué)有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、卡那霉素、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司。

1.2.2 儀器與設(shè)備 ABI stepone plus PCR 儀，德國(guó)Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；Imark 酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD；S-4800 掃描電鏡、E-1045 鍍金儀，日本日立公司；MM-80 顯微鏡，日本NIKON；DL-CJ-2N 超級(jí)潔凈工作臺(tái)，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；IKA Vortex GENIUS 3 振蕩器，德國(guó)IKA 公司；5804R 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；V3 全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，杭州訊數(shù)科技有限公司；GI54DS 立式高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Labconco Free Zone 2.5 臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO 公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌無細(xì)胞上清液 （cell free supernatants，CFS） 和嗜水氣單胞菌AHLs 的制備 將分離自傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的乳酸菌接種于MRS 肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，以2.0%的接種量傳代培養(yǎng)2 次。將發(fā)酵液于4 ℃6 500 r/min 離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾獲得CFS，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將-80 ℃保存的嗜水氣單胞菌接種于LB 肉湯中，以1.0%的接種量傳代培養(yǎng)1 次，將發(fā)酵液于4 ℃6 500 r/min 離心15 min，收集的無細(xì)胞上清液中含有AHLs 信號(hào)分子，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑制嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)乳酸菌的篩選將-80 ℃保存的紫色桿菌CV026 接種于LB 肉湯，30 ℃過夜培養(yǎng)。以2%接入量接種于10 mL 含有10 μg/mL 卡那霉素的LB 肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，移取2.5 mL 菌液于25 mL 含有25 μL AHLs信號(hào)分子的LB 軟瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，倒入擺有牛津杯的素瓊脂的平板中，待凝固后取出牛津杯，每孔加入180 μL 乳酸菌CFS，置于30 ℃培養(yǎng)24 h，用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀記錄孔周圍呈現(xiàn)的白色不透明的渾濁圈。同時(shí)以MRS 為對(duì)照組。

1.3.3 乳酸菌粗提物的制備 取100 mL 乳酸菌CFS 于500 mL 分液漏斗中，加入20 mL 乙酸乙酯進(jìn)行萃取。萃取5 次。加入溶劑后順時(shí)針緩慢震蕩，靜置5 min 后，收集合并上層及乳化層液體，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集萃取液于真空冷凍干燥，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?5 ℃下120 r/min 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無殘留的有機(jī)溶劑，收集萃取液，真空冷凍干燥，置-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響 將活化的嗜水氣單胞菌用LB 肉湯制成約106CFU/mL 菌懸液，將190 μL 菌懸液置于96 孔板中，加入10 μL QSI 粗提物，使其終質(zhì)量濃度分別達(dá)到32.0，16.0，8.0，4.0，2.0 mg/mL，以不加粗提物的LB 培養(yǎng)基作為對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定OD 值。

1.3.5 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

1.3.5.1 96 孔板法測(cè)定對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制率 利用96 孔板法[20]，將活化的嗜水氣單胞菌用LB 肉湯制成約106CFU/mL 菌懸液，移取180 μL 菌懸液于96 孔板中，加入20 μL 乳酸菌粗提物，同時(shí)以MRS 為對(duì)照組。30 ℃培養(yǎng)24 h后，緩慢移出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入200 μL 無菌水清洗5 次后，再添加200 μL 0.4%的結(jié)晶紫染色5 min 后，用200 μL 無菌水清洗3 次，置于干燥箱中干燥10 min。取出96 孔板，向孔中加入200 μL 95%乙醇，并移取150 μL 液體于新的96 孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀測(cè)其OD595nm。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行。

式中：ODcontrol——對(duì)照組OD 值；ODQSI——CFS處理組的OD 值。

1.3.5.2 光學(xué)顯微鏡觀察 在含有1.0 mL LB 肉湯的24 孔板中放入無菌蓋玻片（R=1.4 cm），再向孔中加入10 μL 過夜培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌菌懸液和100 μL 乳酸菌粗提物，同時(shí)以MRS 為對(duì)照組，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，用超純水將蓋玻片潤(rùn)洗3 次，再用0.4%結(jié)晶紫染色20 min，通過顯微鏡觀察生物膜。

1.3.5.3 掃描電鏡分析 采用光學(xué)顯微鏡觀察乳酸菌粗提物對(duì)生物膜形成的影響。加入2.5%戊二醛溶液，置于4 ℃下固定12 h，用無菌水將蓋玻片洗滌3 次除掉殘留的戊二醛，然后分別用40%，70%，90%，100%乙醇脫水處理15 min，將蓋玻片真空干燥，噴金，掃描電鏡觀察生物膜。

1.3.6 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌信號(hào)分子（AHLs）的降解 參照Romero 等[21]的方法稍作修改。將乳酸菌粗提物添加到1 mL 含有10 μL AHLs 信號(hào)分子粗提物的LB 肉湯中，使其終質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL 和8.0 mg/mL，同時(shí)以MRS 為對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)24 h。采用牛津杯打孔法測(cè)定其降解活性。

1.3.7 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌QS 抑制作用的影響因素 參考呂欣然等[22]的方法并稍作修改，測(cè)定蛋白酶、溫度和pH 值對(duì)乳酸菌粗提物的影響。

1） 蛋白酶 將乳酸菌粗提物pH 值分別調(diào)至胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶的最適pH 值，將蛋白酶添加到粗提物溶液中使其最終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，37 ℃下水浴2 h，再將pH 值調(diào)為初始值。以未處理的乳酸菌粗提物為對(duì)照，采用牛津杯打孔法測(cè)定其活性。

2） 溫度 將乳酸菌粗提物分別在40，60，80，100 ℃和121 ℃條件下處理30 min，以未處理的乳酸菌粗提物為對(duì)照，采用牛津杯打孔法測(cè)定其活性。

3） pH 利用1.0 mol/L NaOH 和1.0 mol/L HCl 將粗提物溶液的pH 值分別調(diào)為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 和6.0，采用牛津杯打孔法測(cè)定其降活性。

1.3.8 乳酸菌菌株鑒定

1.3.8.1 生理生化鑒定 挑選具有群體感應(yīng)抑制作用的乳酸菌菌株，參照東秀珠[23]、Bergey[24]和凌代文[25]等文獻(xiàn)對(duì)乳酸菌菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.8.2 16S rRNA 鑒定 參考馬歡歡等[26]的方法并稍作修改。移取1.0 mL 乳酸菌菌懸液于1.5 mL EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，利用DNA快速抽提試劑盒對(duì)菌株DNA 進(jìn)行提取，以16S rDNA 通用引物對(duì)PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物為27f （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物為1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’），引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA 模板1.0 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL、dd H2O 9.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR 擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，72 ℃保持10 min，循環(huán)30 次，4 ℃保溫。使用1%瓊脂糖對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送到上海生物工程股份有限公司測(cè)定序列。將獲得的序列與NCBI 的GeneBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對(duì)和分析，然后應(yīng)用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)平行3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用軟件Origin 8.0 繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制嗜水氣單胞菌QS 作用乳酸菌的篩選

當(dāng)外源AHLs 信號(hào)分子存在時(shí)，能夠誘導(dǎo)紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色素。當(dāng)某種群體感應(yīng)抑制劑存在時(shí)，其能夠抑制紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色素。本研究采用牛津杯打孔法共獲得8 株對(duì)嗜水氣單胞菌QS 有抑制作用的乳酸菌菌株。圖1顯示部分乳酸菌菌株對(duì)嗜水氣單胞菌QS 的抑制效果?？梢钥闯?，添加了乳酸菌代謝物的孔周圍出現(xiàn)渾濁不透明的抑制圈。在8 株抑制QS 的乳酸菌中，菌株 AJS2-4（安徽績(jī)溪酸豆角）和 LZH1-3（遼寧省彰武酸黃瓜） 對(duì)嗜水氣單胞菌QS 抑制作用較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為13.81 mm 和12.25 mm（圖1），因此選擇菌株AJS2-4 做后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 乳酸菌菌株AJS2-4 和菌株LZH1-3 對(duì)紫色桿菌CV026 產(chǎn)紫色素的抑制效果Fig.1 Inhibtion effecs of LAB strain AJS2-4 and LZH1-3 on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響

為了驗(yàn)證菌株AJS2-4 是通過影響嗜水氣單胞菌QS 系統(tǒng)而非抑菌的方式發(fā)揮作用，需研究菌株AJS2-4 粗提物對(duì)紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響。如圖2所示，乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度為32 mg/mL 和16 mg/mL 時(shí)，紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 的生長(zhǎng)被完全抑制；乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時(shí)，紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 的OD 值分別降低0.46 和0.42；乳酸菌粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL 和2 mg/mL 時(shí)，紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，說明菌株AJS2-4 粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL 和2 mg/mL 時(shí)，其對(duì)紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 沒有抑菌活性。質(zhì)量濃度4 mg/mL的粗提物被應(yīng)用于后續(xù)研究。

圖2 菌株AJS2-4 粗提物對(duì)紫色桿菌CV026 （a）和嗜水氣單胞菌LY-2 （b）生長(zhǎng)曲線的影響Fig.2 Effect of LAB crude extraction from strain AJS2-4 on growth curves of C.violaceum CV026 （a）and A.hydrophila LY-2 （b）

2.3 乳酸菌粗提物對(duì)生物膜形成的影響

圖3 菌株AJS2-4 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌LY-2 生物膜形成的影響Fig.3 Effect of crude extraction from strain AJS2-4 on biofilm microscopic of A.hydrophila LY-2

96 孔板法結(jié)果表明，4 mg/mL 的菌株AJS2-4粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的抑制率為32.25%。圖3是菌株AJS2-4 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜影響的光學(xué)顯微鏡圖片和掃描電鏡圖片?？梢钥闯?，采用光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，對(duì)照組嗜水氣單胞菌菌落濃密（圖3a），而經(jīng)菌株AJS2-4 粗提物處理的嗜水氣單胞菌菌落密度較稀疏（圖3b），表明菌株AJS2-4 粗提物可有效降低嗜水氣單胞菌生物膜的形成。應(yīng)用掃描電鏡觀察時(shí)，對(duì)照組細(xì)菌緊密聚集形成完整的生物膜，結(jié)構(gòu)較致密（圖3c），而經(jīng)菌株AJS2-4 粗提物處理后，細(xì)菌已不能聚集形成片狀的生物膜，結(jié)構(gòu)稀薄疏松，細(xì)胞的完整性被破壞，表明菌株AJS2-4 粗提物不僅降低嗜水氣單胞菌生物膜的生成量，也能使其生物膜結(jié)構(gòu)破裂變得疏松（圖3d）。SUN 等[27]研究發(fā)現(xiàn)水萊茵海默氏菌（Rheinheimera aquimaris）QSI02 提取物二酮哌嗪類化合物cyclo（Trp-Ser）質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)，對(duì)銅綠色假單胞菌PA01 生物膜抑制率達(dá)到59.9%，光鏡和掃描電鏡結(jié)果表明，二酮哌嗪類化合物cyclo （Trp-Ser） 使銅綠色假單胞菌PA01生物膜結(jié)構(gòu)疏松，與本研究結(jié)果相似。

2.4 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 信號(hào)分子的降解效果

當(dāng)外源AHLs 信號(hào)分子存在時(shí)，誘導(dǎo)紫色桿菌CV026 產(chǎn)生紫色菌素。圖4是菌株AJS2-4 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 信號(hào)分子降解效果圖。與對(duì)照組相比，菌株AJS2-4 粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時(shí)，使紫色暈圈變小且降解率為49.36%；用質(zhì)量濃度為8 mg/mL 菌株AJS2-4 粗提物處理時(shí)，紫色暈圈完全消失，信號(hào)分子被完全降解。結(jié)果表明，菌株AJS2-4 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌信號(hào)分子存在降解作用，從而抑制嗜水氣單胞菌的QS 系統(tǒng)。Torres 等[28]將分離自貝類的南極超微細(xì)菌（Alteromonas stellipolaris）PQQ-42 與C6-HSL（10mmoL/L）信號(hào)分子共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)C6-HSL 信號(hào)分子的降解率高達(dá)99.7%，進(jìn)而抑制地中?；【?VibC-Oc-097（V.mediterranei）的QS，與本研究結(jié)果相似。

圖4 菌株AJS2-4 粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌AHLs 降解效果Fig.4 Effect of crude extraction from strain AJS2-4 on AHLs-degradation

2.5 乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌群體感應(yīng)抑制作用的影響因素

圖5顯示菌株AJS2-4 粗提物對(duì)蛋白酶的敏感性?？梢钥闯?，菌株AJS2-4 粗提物經(jīng)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及胰蛋白酶處理2 h 后對(duì)嗜水氣單胞菌無QS 抑制活性，推測(cè)菌株AJS2-4 粗提物中對(duì)嗜水氣單胞菌QS有抑制活性的物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。

表1是不同溫度和pH 處理對(duì)菌株AJS2-4粗提物的影響?？梢钥闯?，菌株AJS2-4 粗提物經(jīng)40，60，80，100 ℃和121 ℃處理30 min 后，抑制活性未發(fā)生顯著性改變，表明菌株AJS2-4 中的蛋白類活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。此外，菌株AJS2-4 粗提物抑制QS 活性物質(zhì)隨著pH 的升高呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，在pH 5.0 時(shí)，抑制QS 的活性物質(zhì)活性完全喪失，表明菌株AJS2-4 粗提物中具有QS 抑制作用的蛋白類活性物質(zhì)在酸性條件下活性較好，受環(huán)境pH 影響較大。

2.6 乳酸菌菌株鑒定

菌株AJS2-4 的生理生化鑒定結(jié)果見表2，依照文獻(xiàn)[24]、[25]可初步斷定菌株AJS2-4 為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖5 蛋白酶對(duì)菌株AJS2-4 粗提物活性的影響Fig.5 Effect of protease on the activity of crude extraction from strain AJS2-4

表1 溫度和pH 處理對(duì)菌株AJS2-4 粗提物活性的影響Table 1 Effect of temperature and pH on crude extraction from strain AJS2-4

表2 菌株AJS2-4 的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test results of strain AJS2-4

圖6是菌株AJS2-4 的16S rRNA 基因擴(kuò)增電泳圖，結(jié)果顯示菌株AJS2-4 核酸序列在1 400 bp 左右被成功擴(kuò)增出一條特異性亮帶。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7）。由圖7可知，菌株AJS2-4 與植物乳桿菌（Lb.Plantarum）KF673529.1 在同一個(gè)分支上，置信度為99%。AJS2-4 被鑒定為植物乳桿菌（Lb.plantarum），該結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果相同。

圖6 菌株AJS2-4 的16S rRNA 基因擴(kuò)增電泳圖Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain AJS2-4

圖7 菌株AJS2-4 的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain AJS2-4

3 結(jié)論

從安徽績(jī)溪酸豆角中獲得1 株能夠抑制嗜水氣單胞菌QS 活性的乳酸菌菌株AJS2-4。該乳酸菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，并通過降解AHLs 信號(hào)分子的方式抑制嗜水氣單胞菌的QS 作用。初步分析菌株AJS2-4 粗提物中抑制QS 活性物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。通過生理生化試驗(yàn)和16S rRNA 序列分析菌株AJS2-4，被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。本文從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中獲得微生物源性QSI，對(duì)挖掘新的乳酸菌生物資源以及研發(fā)高效的微生態(tài)制劑提供借鑒作用。