王 靜 茅林春 楊 璐 李學(xué)文 張 輝呂 卓 劉彩虹 李 乾 侯琛元

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)試驗(yàn)室 杭州310058 2 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 烏魯木齊830000 3 新疆林業(yè)科學(xué)院林業(yè)測(cè)試中心 烏魯木齊830000）

新疆哈密瓜栽培歷史悠久，是當(dāng)?shù)氐闹饕?，其貯藏量位居新疆果品之首。哈密瓜果實(shí)屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，采后腐爛迅速，損失非常嚴(yán)重。低溫冷藏雖能有效抑制果實(shí)采后腐爛和品質(zhì)下降，但哈密瓜果實(shí)對(duì)低溫環(huán)境敏感，低溫貯藏易發(fā)生冷害。冷害的發(fā)生限制低溫貯藏技術(shù)在哈密瓜果實(shí)采后貯運(yùn)中的應(yīng)用。如何增強(qiáng)哈密瓜果實(shí)采后對(duì)低溫的耐受性，控制冷害的發(fā)生，已成為哈密瓜果實(shí)采后貯運(yùn)中急需解決的問題。

草酸是一種廣泛分布于動(dòng)、植物及真菌體中的有機(jī)酸，同時(shí)也是一種新型植物的非生物誘導(dǎo)劑，在調(diào)節(jié)植物的抗逆反應(yīng)中起著重要作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)草酸處理可降低芒果[2]、石榴[3-4]和竹筍[5]等果蔬的冷害現(xiàn)象；誘導(dǎo)桃果實(shí)[6-7]、茄子[8]抗氧化酶性活性提高；提高芒果脯氨酸代謝關(guān)鍵酶活性，降低冷害發(fā)生[9]；維持獼猴桃果實(shí)較高的ATP 和能荷，提高果實(shí)的抗氧化能力，增強(qiáng)其抗冷性[10]；保持桃果實(shí)較高酶活性與能量及高的不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸，減輕冷害的發(fā)生[11]。草酸處理是如何調(diào)控哈密瓜果實(shí)膜脂代謝影響冷害的？ 尚未見相關(guān)報(bào)道。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)15 mmol/L 草酸溶液處理哈密瓜果實(shí)10 min，可顯著降低冷害。在此基礎(chǔ)上，本文重點(diǎn)研究15 mmol/L 草酸溶液處理對(duì)哈密瓜冷害與膜脂代謝的影響，旨在為哈密瓜采后保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以“西州密25 號(hào)”哈密瓜（屬厚皮甜瓜亞種Cucumis melo var.reticulatus Naud.） 為原料，于2016年7月15日摘自吐魯番鄯善瓜商品瓜基地，單個(gè)平均質(zhì)量為2.70 kg，瓜中心平均糖度14%～15%，瓜皮呈青色，布滿灰色網(wǎng)紋，瓜瓤泛橙色。采后立即用泡沫網(wǎng)狀發(fā)套將果實(shí)單獨(dú)包裝，每個(gè)紙箱（40 cm×35 cm×28 cm）中放置4 個(gè)瓜，立即運(yùn)至試驗(yàn)室。選擇成熟度基本一致、大小適中、無任何機(jī)械損傷的果實(shí)作為試驗(yàn)材料。

草酸（OA），為分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；次氯酸鈉，國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；石英砂，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；海砂，漳州天然石英砂廠；石油醚、無水硫酸鈉、亞油酸鈉、Na2HPO4·2H2O 和NaH2PO4·H2O，鄭州萬瑞達(dá)化工產(chǎn)品有限公司；Triton X-100、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），上海江萊生物科技有限公司；冰醋酸、無水醋酸鈉，青島瑞升化學(xué)有限公司；牛血清蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)G-250，Sigma 公司；PLD 試劑盒，上海恒遠(yuǎn)生物有限公司；膽堿氧化酶、辣根過氧化物酶，南京杜萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SIGMA 3-18K 型低溫高速離心機(jī)，上海知信試驗(yàn)儀器有限公司；SP-752 型紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜有限公司；JF2004 型電子分析天平，上海麥聚瑞電子儀器有限公司；HH-4 型恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；原子分光光度儀PinAAcle99T，北京浩天暉儀器有限公司；日本島津氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010Plus，上海普迪生物技術(shù)有限公司

1.3 試驗(yàn)方法

將挑選好的“西州蜜25 號(hào)”哈密瓜擦拭干凈，置于濃度為15 mmol/L 草酸溶液（0.5 mL/L 吐溫-20）中浸泡10 min，以蒸餾水（0.5 ml/L 吐溫-20）浸泡10 min 作為對(duì)照。充分晾干后裝箱，貯藏于機(jī)械冷庫內(nèi)（3～5 ℃）（西州密25 號(hào)哈密瓜受冷害的溫度為3 ℃，依據(jù)劉同業(yè)等[12]研究結(jié)論）。每個(gè)處理各136 個(gè)瓜（每次處理4 個(gè)瓜，共計(jì)34 次），低溫冷藏，平均每隔6 d 取1 次樣，共取樣7 次。每個(gè)處理取3 個(gè)瓜，3 個(gè)重復(fù)，共計(jì)9 個(gè)瓜。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3 次，分別在瓜的前、中、后3 個(gè)部位取約2 cm 厚的瓜皮組織，混勻后用液氮冷凍并在-80 ℃冰箱中放置。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 冷害指數(shù)的測(cè)定 參照畢陽等[13]的方法，稍作改動(dòng)。將果實(shí)從貯藏冷庫轉(zhuǎn)移到室溫（25 ℃）放置1 d 后統(tǒng)計(jì)冷害情況。每個(gè)處理取5 個(gè)瓜，3個(gè)重復(fù)，共計(jì)15 個(gè)瓜。癥狀按嚴(yán)重程度分為5 級(jí)：0 級(jí)，果面光潔，沒有冷害癥狀；1 級(jí)，有輕微的下陷冷害斑，占果面總面積15%以下；2 級(jí)，冷害面積占果面的比例小于40%；3 級(jí)，冷害面積小于果面的70%；4 級(jí)，冷害面積占果面總面積的70%以上；5 級(jí)，冷害面積占果面總面積的100%，記錄3組的冷害級(jí)數(shù)，冷害指數(shù)=移（果實(shí)冷害級(jí)別×該級(jí)別的果實(shí)數(shù)）/（果實(shí)總數(shù)量×最高級(jí)別）。

1.4.2 脂肪酸組成及含量的測(cè)定 提取哈密瓜果皮300 g，打碎后放入三角瓶中，加入海砂后攪拌吸水拌干，按照1∶1.5 的體積比加入樣品和石油醚，在三角瓶中加入450 mL 石油醚后搖勻，靜止4 h 以上。將提取的上清液轉(zhuǎn)移至另一三角瓶中，提取時(shí)在漏斗頸部塞入脫脂棉，并在其上鋪一層無水硫酸鈉吸水，將提取好的上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮得到油層，將油層轉(zhuǎn)移至0.2 mL 的離心管中，冷凍儲(chǔ)藏。采用日本島津氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010Plus 測(cè)脂肪酸種類和含量，結(jié)果以相對(duì)百分含量%表示。

氣相色譜儀測(cè)定條件：進(jìn)樣口分流（1∶20），載氣為氦氣，進(jìn)樣口壓力120 kPa，進(jìn)樣口溫度240℃，進(jìn)樣體積0.5 μL。色譜柱升溫程序：在溫度180 ℃保留30 min，然后以10 ℃/min 的速度升溫到220 ℃保持2 min。肪酸組分定量分析采用對(duì)各組分峰面積積分，用歸一化法計(jì)算各組分的百分含量。

式中，si——膜脂不飽和脂肪酸相對(duì)含量，%；ti——該不飽和脂肪酸所含不飽和鍵的數(shù)量。

膜脂脂肪酸不飽和度=不飽和脂肪酸相對(duì)含量（UFA）/飽和脂肪酸相對(duì)含量（FA）。

1.4.3 脂氧合酶活性（LOX）的測(cè)定 按照陳昆松等[15]的方法并稍作改動(dòng)。取5.0 g 冷凍果皮組織，室溫（25 ℃）下反應(yīng)，于234 nm 處測(cè)定吸光度值。加酶液15 s 后開始計(jì)時(shí)，每隔30 s 記錄1 次，記錄3 min 內(nèi)OD234值變化，重復(fù)3 次。酶活性結(jié)果以ΔOD234·min-1·g-1蛋白表示。

1.4.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 按照Bradford[16]考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0053X+0.025，R2=0.992。

1.4.5 PLD 活性的測(cè)定 參照趙宇瑛[17]的方法。重復(fù)3 次，酶活性結(jié)果以ΔOD492·min-1·g-1蛋白表示。

1.4.6 Ca2+含量的測(cè)定 參照Yapa 等[18]的方法提取，采用原子分光光度儀PinAAcle99T 測(cè)定。結(jié)果以mg·kg-1表示。

1.4.7 RNA 提取，cDNA 合成與熒光定量PCR（Q-PCR） 引物分析 取貯藏在3 ℃條件中0，7，14，21，28，35 d 及42 d 的哈密瓜果實(shí)，在赤道周圍取約2 cm 厚的果皮組織用來提取總RNA，取2 μL 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后取2 μL cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。具體方法可參考Wang等[14]。

表1 熒光定量檢測(cè)特異性引物設(shè)計(jì)和合成Table 1 Specific primers for PLD and LOX in real time fluorescent quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸處理對(duì)哈密瓜果實(shí)冷害指數(shù)和冷害癥狀的影響

由圖1可知，哈密瓜果實(shí)貯藏至14 d 開始出現(xiàn)冷害，且隨著貯藏時(shí)間的延長冷害指數(shù)逐步增加，貯藏至42 d，冷害指數(shù)上升較明顯，對(duì)照果實(shí)的冷害指數(shù)始終高于草酸處理的果實(shí) （P＜0.05），說明草酸處理可以降低哈密瓜果實(shí)的冷害指數(shù)。隨著哈密瓜冷害指數(shù)的上升，冷害癥狀開始加劇，貯藏至21 d，對(duì)照果實(shí)的冷害凹陷斑多于草酸處理的果實(shí)（圖2a）。貯藏至42 d，對(duì)照果實(shí)冷害癥狀與草酸處理的果實(shí)相比，明顯嚴(yán)重（圖2b），且伴有失水現(xiàn)象發(fā)生。

以上結(jié)果表明，15 mmol/L 草酸處理可以作為減輕哈密瓜果實(shí)貯藏過程中冷害發(fā)生的條件之一。

圖1 草酸處理對(duì)3～5 ℃冷藏42 d 哈密瓜果實(shí)冷害指數(shù)的影響Fig.1 Effect of OA treatment on CI index of Hami melon fruits after cold storage at 3-5 ℃for 42 d

圖2 哈密瓜果實(shí)低溫（3～5 ℃）冷藏21 d（a）和42 d（b）的冷害癥狀圖Fig.2 Chilling injury symptom of Hami melon fruits after cold storage at 3-5 ℃for 14 days and 42 days

2.2 草酸處理對(duì)哈密瓜果皮飽和脂肪酸相對(duì)含量的影響

哈密瓜果皮中飽和脂肪酸主要有2 種：棕櫚酸（C16：0）和硬酯酸（C18：0）。由圖3a 可知，冷藏0～14 d 對(duì)照哈密瓜果皮棕櫚酸（C16：0）相對(duì)含量緩慢上升，冷藏14～35 d 急劇下降至最低點(diǎn)，冷藏35～42 d 又緩慢上升，第42 天棕櫚酸（C16：0）相對(duì)含量為22.1%。冷藏0～7 d 草酸處理果皮的棕櫚酸（C16：0）相對(duì)含量緩慢上升，7～42 d 草酸處理果皮的棕櫚酸（C16：0）相對(duì)含量降至最低點(diǎn)為20.78%。除第35天外，草酸處理的哈密瓜果皮棕櫚酸（C16：0）相對(duì)含量低于對(duì)照（P＜0.05），說明草酸處理可降低哈密瓜果皮棕櫚酸（C16：0）的相對(duì)含量。

由圖3b 可知，對(duì)照和草酸處理的哈密瓜果皮硬脂酸（C18：0）相對(duì)含量變化趨勢(shì)基本相似，冷藏0～35 d 果皮硬脂酸（C18：0）相對(duì)含量下降，冷藏35～42 d 上升，除第35 天外，草酸處理的哈密瓜果皮硬脂酸相對(duì)含量顯著低于對(duì)照（P＜0.05）。

圖3 草酸處理對(duì)3～5 ℃冷藏42 d 哈密瓜果皮棕櫚酸（C16：0）（a）和硬脂酸（C18：0） （b）相對(duì)含量的影響Fig.3 Effect of OA treatment on palmitic acid （C16：0） （a） and stearicacid （C18：0） （b） relative contents in pericarp of Hami melon fruits after cold storage at 3-5 ℃for 42 d

2.3 草酸處理對(duì)哈密瓜果皮不飽和脂肪酸含量的影響

哈密瓜果皮中不飽和脂肪酸主要有4 種：亞油酸（C18：2）、油酸（C18：1）、亞麻酸（C18：3）和二十碳四烯酸（C20：4）。

由圖4a 可知，冷藏0～28 d 草酸處理的哈密瓜果皮亞油酸（C18：2）相對(duì)含量緩慢上升且高于對(duì)照。貯藏至第35 天草酸處理與對(duì)照果皮的亞油酸（C18：2）相對(duì)含量接近，冷藏28～42 d 迅速升高，貯藏至第42 天對(duì)照和草酸處理的亞油酸（C18：2）相對(duì)含量達(dá)到最高值，分別為32.13%和38.14%。分析發(fā)現(xiàn)，除28 d 和35 d 外，草酸處理的哈密瓜果皮亞油酸（C18：2）相對(duì)含量均高于對(duì)照（P＜0.05），表明草酸處理可以有效提高果皮亞油酸（C18：2）相對(duì)含量，對(duì)提高膜脂的流動(dòng)性具有積極作用。

由圖4b 可知，冷藏0～7 d 對(duì)照和草酸處理的哈密瓜果皮油酸（C18：1）相對(duì)含量增加，冷藏7～42 d，出現(xiàn)不同程度的降低。除28 d 和35 d 外，草酸處理的哈密瓜果皮油酸（C18：1）相對(duì)含量顯著高于對(duì)照（P＜0.05），說明草酸處理可緩解哈密瓜果皮油酸（C18：1）相對(duì)含量下降，對(duì)果實(shí)抵抗低溫脅迫具有一定的幫助。

由圖4c 可知，冷藏0～28 d 對(duì)照和草酸處理的哈密瓜果皮亞麻酸（C18：3）相對(duì)含量大幅度增加，且草酸處理顯著高于對(duì)照（P＜0.05），冷藏28～42 d對(duì)照和草酸處理果皮的亞麻酸（C18：3）相對(duì)含量比較接近，貯藏至42 d 亞麻酸（C18：3）相對(duì)含量達(dá)到最高值，分別為27.18%和27.57%（P＞0.05），說明草酸處理提高貯藏前期（0～28 d）果皮亞麻酸（C18：3）相對(duì)含量。

由圖4d 可知，冷藏0～21 d 草酸處理的哈密瓜果皮二十碳烯酸（C20：4）相對(duì)含量緩慢下降，21～28 d 其相對(duì)含量迅速上升且第28 天達(dá)到峰值6.64%，之后緩慢下降，至42 d，與起始點(diǎn)相比提高9.8%。相比之下，對(duì)照果皮的二十碳烯酸（C20：4）相對(duì)含量則低于草酸處理，貯藏至42 d，對(duì)照與起始點(diǎn)相比其相對(duì)含量下降22%，表明草酸處理可提高哈密瓜果皮二十碳烯酸（C20：4）的相對(duì)含量 （P＜0.05）。

圖4 草酸處理對(duì)3～5 ℃冷藏42 d 哈密瓜果皮亞油酸（C18︰2）（a）、油酸（C18︰1）（b）、亞麻酸（C18︰3）（c）和二十碳四烯酸（C20：4）（d）相對(duì)含量的影響Fig.4 Effect of OA treatment on linoleic acid （C18：2） （a） ，oleic acid（C18：1）（b），linolenic acid （C18：3） （c）and arachidonic acid （C20：4） （d）relative contents in pericarp of Hami melon fruits after cold storage at 3-5 ℃for 42 d

2.4 草酸處理對(duì)哈密瓜果皮不飽和指數(shù)和不飽和度的影響

膜脂脂肪酸不飽和指數(shù)（IUFA）是衡量膜脂脂肪酸不飽和程度的重要指標(biāo)之一，能反映膜的流動(dòng)性[21]。由圖5a 可知，冷藏0～42 d 草酸處理的哈密瓜果皮不飽和指數(shù)持續(xù)明顯上升，而對(duì)照呈忽高忽低的變化趨勢(shì)。除第21 天外，草酸處理的哈密瓜果皮不飽和指數(shù)明顯高于對(duì)照（P＜0.05），表明草酸處理可提高哈密瓜果皮不飽和指數(shù)。

膜脂脂肪酸不飽和度是衡量膜脂脂肪酸不飽和程度的另一個(gè)重要指標(biāo)，它可反映膜脂脂肪酸的構(gòu)成和比例變化[21]。由圖5b 可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照和草酸處理的哈密瓜果皮不飽和度大體呈明顯上升趨勢(shì)，且草酸處理顯著高于對(duì)照（P＜0.05），說明草酸處理可提高哈密瓜果皮膜脂脂肪酸不飽和度。

2.5 草酸處理對(duì)哈密瓜果皮脂氧合酶 （LOX）和磷脂酶D（PLD）活性及Ca2+含量的影響

脂氧合酶（LOX）是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，它可催化植物中亞油酸和亞麻酸等多元不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，破壞磷脂雙分子層，從而引起細(xì)胞膜破壞[22]。由6a可知，對(duì)照果皮LOX 活性在冷藏第7 天和第21天出現(xiàn)峰值，值分別為36.14ΔOD234·min-1·g-1蛋白和36.24ΔOD234·min-1·g-1蛋白，冷藏21～42 d，出現(xiàn)持續(xù)下降至最低點(diǎn)。冷藏0～21 d 草酸處理的哈密瓜果皮LOX 活性持續(xù)下降，冷藏21～28 d 出現(xiàn)短暫上升，后出現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)，貯藏至第42 天下降到最低點(diǎn)。整個(gè)貯藏過程中草酸處理的哈密瓜果皮LOX 活性顯著低于對(duì)照（P＜0.05），表明草酸處理可降低哈密瓜果皮LOX 活性。

由圖6b 得知，冷藏0～14 d 對(duì)照和草酸處理的哈密瓜果皮PLD 活性緩慢上升，14～42 d 兩個(gè)處理的LOX 活性出現(xiàn)不同程度的下降，與起始點(diǎn)相比，貯藏至42 d 的草酸處理果皮PLD 活性下降39%，而對(duì)照則升高16%。在整個(gè)貯藏過程中草酸處理的哈密瓜果皮PLD 的活性顯著低于對(duì)照（P＜0.05），說明草酸處理可降低哈密瓜果皮PLD 活性。

由圖6c 發(fā)現(xiàn)，冷藏0～7 d 對(duì)照和草酸處理的果皮Ca2+含量急劇上升，冷藏7～42 d 兩個(gè)處理果皮的Ca2+含量變化趨勢(shì)基本相似，且大致為增加狀態(tài)。在整個(gè)貯藏過程中，與對(duì)照相比較，草酸處理提高哈密瓜果皮膜上結(jié)合的Ca2+含量。

圖5 草酸處理對(duì)3～5 ℃冷藏42 d 哈密瓜果皮不飽和指數(shù)（a）和不飽和度（b）的影響Fig.5 Effect of OA treatment on index of unsaturated fatty acids （IUFA） （a） and unsaturated degree of fatty acids （b） in pericarp of Hami melon after cold storage at 3-5 ℃for 42 d

圖6 草酸處理對(duì)3～5 ℃冷藏42 d 哈密瓜果皮LOX（a）、PLD（b）活性及Ca2+（c）含量的影響Fig.6 Effect of OA treatment on LOX（a），PLD（b） activities and Ca2+ content in pericarp of Hami melon fruits after cold storage at 3-5 ℃for 42 d

2.6 草酸處理對(duì)哈密瓜CmLOX 和CmPLD 表達(dá)的影響

由圖7a 得知，在整個(gè)貯藏過程中，草酸處理組哈密瓜的CmLOX 表達(dá)量（除第14 天）始終低于對(duì)照組（P＜0.05），表明草酸處理抑制CmLOX 表達(dá)量上升。與LOX 活性變化趨勢(shì)相似。

圖7b 顯示，兩組哈密瓜的CmPLD 表達(dá)量變化趨勢(shì)相似，先上升后下降，在整個(gè)貯藏過程中草酸處理組均低于對(duì)照組，與PLD 活性變化相近。貯藏0～14 d 草酸處理組的CmPLD 表達(dá)量緩慢上升，14～42 d 始終保持較低的水平，貯藏至42 d 降低至最低點(diǎn)。對(duì)照組CmPLD 表達(dá)量在貯藏0～21 d緩慢上升，在21～42 d 略微下降，然而顯著高于草酸處理組（P＜0.05），說明草酸處理可降低哈密瓜CmPLD 的表達(dá)水平。

圖7 草酸處理對(duì)哈密瓜CmLOX（a）和CmPLD（b）表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of OA treatment on the expression of CmLOX （a） and CmPLD （b） in Hami melon

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，“西周密25 號(hào)”哈密瓜低溫冷藏14 d，常溫下放置1 d 后出現(xiàn)不規(guī)則的水漬狀斑點(diǎn)冷害癥狀。隨著低溫冷藏時(shí)間的延長，斑點(diǎn)相連，發(fā)展成不規(guī)則的下陷斑塊，冷害凹陷斑面積逐漸增大，失水皺縮現(xiàn)象伴隨出現(xiàn)。與畢陽等[23]對(duì)哈密瓜冷害癥狀的研究報(bào)道基本相似。由圖2a 和2b可知，對(duì)照果實(shí)冷害癥狀與草酸處理相比，冷害凹陷斑數(shù)量增多，表明對(duì)照果實(shí)外表皮的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)已被一定程度的破壞。

諸多研究表明，細(xì)胞膜是生物體的重要組成部分，當(dāng)植物體遭受逆境脅迫時(shí)，膜完整性常會(huì)遭到破壞，膜透性增加，細(xì)胞離子泄露，導(dǎo)致生理生化代謝發(fā)生紊亂，引起細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)崩潰瓦解[24]。草酸處理降低哈密瓜果實(shí)細(xì)胞膜滲透率和果皮MDA 含量，對(duì)降低膜脂過氧化程度，保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性起到一定的作用。該結(jié)論在Wang等[14]的研究結(jié)果中得到證實(shí)。由于與膜結(jié)合的PLD 是植物體內(nèi)細(xì)胞膜氧化反應(yīng)的主要酶，也是重要的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，可作為信號(hào)分子催化膜脂中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)[25]。LOX 是以不飽和脂肪酸為底物，降低膜脂脂肪酸的不飽和程度，加劇對(duì)植物組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞[26-27]。在膜脂代謝途經(jīng)中PLD 與LOX 是起關(guān)鍵作用的酶[28]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正是由于15 mmol/L 草酸處理降低PLD 和LOX 活性（圖6a，6b），從而降低細(xì)胞膜的降解和過氧化速度，降低冷害的發(fā)生（圖1）。這可能與草酸處理提高哈密瓜果皮與膜結(jié)合的Ca2+含量有關(guān)（圖6c）。有研究表明，PLD 活性受到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微量的Ca2+濃度調(diào)控，且細(xì)胞質(zhì)中相對(duì)較高的Ca2+濃度，可激活細(xì)胞膜自身催化發(fā)生脂質(zhì)降解，從而提高LOX 活性[25]。作者認(rèn)為，草酸處理可能是通過提高哈密瓜果皮與膜結(jié)合的Ca2+含量，促進(jìn)CmLOX 和CmPLD 表達(dá)量下降（圖7a，7b）和活性降低（圖6a，6b），降低細(xì)胞膜的降解和過氧化速度，抑制細(xì)胞膜滲透率和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 含量上升，提高果實(shí)對(duì)低溫的耐受性[29]。而對(duì)照果實(shí)PLD 和LOX 活性較高，脂質(zhì)過氧化作用加劇，促進(jìn)膜降解的同時(shí)，伴隨自由基的介入，導(dǎo)致膜滲透率上升，離子發(fā)生泄漏，細(xì)胞膜完整性和區(qū)室化結(jié)構(gòu)被破壞，冷害加劇[28]。與荔枝果實(shí)貯藏期間果皮脂酶、PLD 和LOX 活性增加導(dǎo)致褐變和品質(zhì)劣變的結(jié)論有相似之處[30]。

脂肪酸是植物細(xì)胞膜的主要組成部分，細(xì)胞膜上脂肪酸組分的變化會(huì)改變細(xì)胞膜的功能[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，草酸處理的果皮中PLD 和LOX 活性保持較低（圖6a，6b），使得酶的底物——不飽和脂肪酸消耗量減少，因此亞油酸（C18：2）、油酸（C18：1）、亞麻酸（C18：3）和二十碳四烯酸（C20：4）等不飽和脂肪酸相對(duì)含量高于對(duì)照（圖4a，4b，4c，4d）。飽和脂肪酸棕櫚酸（C16：0） 和硬脂酸（C18：0）等相對(duì)含量則低于對(duì)照（圖3a，4b），表明草酸處理提高不飽和脂肪酸相對(duì)含量，降低飽和脂肪酸相對(duì)含量。同時(shí)草酸處理提高膜脂脂肪酸不飽和指數(shù)（IUFA）和膜脂脂肪酸不飽和度（圖5a，5b），增加膜脂的不飽和程度，促進(jìn)膜的流動(dòng)性，控制果實(shí)冷害和衰老癥狀的發(fā)展。有研究表明，熱空氣處理抑制枇杷果實(shí)細(xì)胞膜氧化相關(guān)PLD 活性上升，維持細(xì)胞膜較高的不飽和脂肪酸含量和細(xì)胞膜流動(dòng)性，降低果實(shí)衰老及褐變產(chǎn)生[32]。草酸處理降低桃果實(shí)冷害癥狀與脂肪酸不飽和度較高有關(guān)[5]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)照哈密瓜果皮LOX 活性（圖6a）與二十碳四烯酸（C20：4）相對(duì)含量（圖4d）呈顯著 （P = 0.037 ＜0.05） 負(fù)相關(guān) （相關(guān)系數(shù)R=-0.737），而與油酸（C18：1）、亞油酸（C18：2）和亞麻酸（C18：3）等不飽和脂肪酸相對(duì)含量沒有明顯的相關(guān)（P＞0.05），經(jīng)相關(guān)性分析LOX 的底物是二十碳四烯酸（C20：4）。與羅自生[33]對(duì)柿果、孔祥佳[24]對(duì)橄欖看法“LOX 的底物是亞麻酸”的結(jié)論不同。

綜上所述，15 mmol/L 草酸處理明顯抑制哈密瓜果皮PLD 和LOX 活性升高，可能與草酸處理提高哈密瓜果皮細(xì)胞膜的Ca2+濃度有關(guān)。細(xì)胞質(zhì)中相對(duì)較低的Ca2+濃度，減少與膜結(jié)合的PLD 和LOX 的量，從而降低果實(shí)細(xì)胞膜滲透率，促進(jìn)果皮MDA 含量降低，減少細(xì)胞膜發(fā)生氧化反應(yīng)，較好地維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。同時(shí)有效抑制果皮中棕櫚酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0）相對(duì)含量上升及油酸（C18：1）相對(duì)含量下降，提高 亞油 酸（C18：2）、亞麻酸（C18：3）和二十碳四烯酸（C20：4）的相對(duì)含量，提高果皮膜脂脂肪酸的不飽和指數(shù)和不飽和度，保持較高細(xì)胞膜不飽和度和流動(dòng)性，控制果實(shí)冷害和衰老癥狀的發(fā)展。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，草酸處理明顯抑制哈密瓜果皮PLD 和LOX 活性及蛋白表達(dá)升高，減少細(xì)胞膜發(fā)生氧化反應(yīng)，降低膜脂過氧化產(chǎn)物含量，較好地維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。同時(shí)有效抑制果皮中棕櫚酸（C16：0）和硬脂酸（C18：0）相對(duì)含量上升及油酸（C18：1）相對(duì)含量下降，提高 亞油 酸（C18：2）、亞麻酸（C18：3）和二十碳四烯酸（C20：4）的相對(duì)含量，提高果皮膜脂脂肪酸的不飽和指數(shù)和不飽和度，維持較高的膜脂脂肪酸不飽和程度和較大的膜流動(dòng)性，從而增強(qiáng)哈密瓜果實(shí)的抗冷性。