《中國(guó)心血管報(bào)告2018》指出，在我國(guó)心血管死亡率居首位，高于腫瘤等其他疾病，占我國(guó)居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，據(jù)此推算，目前我國(guó)冠心病病人近1 100萬(wàn)人[1]，造成了嚴(yán)重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。冠心丹參滴丸由三七、丹參、降香油組成，其主要化學(xué)成分包括三七皂苷R1[3-4]、人參皂苷 Rg1[5]、人參皂苷 Rb1[6]、丹參酮ⅡA[7-8]、丹酚酸B[9]、隱丹參酮、丹酚酸Ⅰ[10-11]等。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察缺血心肌的線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)及其通路的改變以評(píng)價(jià)冠心丹參滴丸對(duì)缺血心肌UCP2的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡普通級(jí)巴馬豬，雌雄不拘，體重18～23kg，由天津市百農(nóng)生物繁育科技有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和藥品 Ameroid縮窄環(huán)(美國(guó)Research Instrument SW)， 超聲儀(荷蘭 Philips EPIQ 7)， 高效液相色譜儀(美國(guó) Waters e2695-2489)， 光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS BX43)， 透射電子顯微鏡(日本 HITACHIH-7650)， 電泳儀(美國(guó) Bio-Rad)， 熒光定量PCR儀(美國(guó) Applied BiosystemsABI7500)，AMPK抗體(美國(guó) santacruz sc-25792)， pAMPK抗體(美國(guó) CST 2535)， 冠心丹參滴丸(黑龍江中發(fā)實(shí)業(yè)集團(tuán))， 鹽酸曲美他嗪片(天津施維雅制藥)， UCP2抗體(美國(guó)santacruz sc-6525)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 缺血心肌模型豬的建立 動(dòng)物禁食8 h后，地西泮0.5 mg/kg肌內(nèi)注射，丙泊酚2 mg/kg肌內(nèi)注射，心電監(jiān)護(hù)，異氟烷1%～3%吸入維持麻醉。消毒術(shù)野，開(kāi)胸，游離前降支近段，第一對(duì)角支下1 cm，置入2.5 mm Ameroid縮窄環(huán)。假手術(shù)組給予開(kāi)胸但不置入縮窄環(huán)。術(shù)后給予青霉素320 U 靜脈輸注，心電監(jiān)護(hù)至蘇醒，回籠，常規(guī)飼料飼養(yǎng)4周。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方案 4周后成活16只，其中假手術(shù)組4只，其余12只根據(jù)簡(jiǎn)單隨機(jī)法分為模型組；冠心丹參滴丸(GXDS) 組和曲美他嗪(TMZ) 組，每組4只。模型組和假手術(shù)組給予正常飲食；TMZ組在正常飲食基礎(chǔ)上加鹽酸曲美他嗪40 mg/d；GXDS組在正常飲食基礎(chǔ)上加冠心丹參滴丸800 mg/d。給藥周期共6周。

1.2.3 心功能檢測(cè) 給藥后，麻醉方法同上，在靜息狀態(tài)下通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)定各組的心臟功能指標(biāo)：左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、室壁增厚率(WT)。

1.2.4 取材 10%氯化鉀15 mL耳靜脈注射處死動(dòng)物，開(kāi)胸取心臟，生理鹽水沖洗干凈，取病變心肌。將1 mm3標(biāo)本固定在2.5%的戊二醛中，以備透射電子顯微鏡下觀察，10%的中性甲醛中固定，蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.2.5 三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量測(cè)定 動(dòng)物處死后，立刻應(yīng)用線粒體分離試劑盒進(jìn)行線粒體分離。ATP、ADP、AMP的含量通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定。磷酸腺苷總量(TAN) 和能荷(EC) 的計(jì)算公式如下：TAN=ATP+ADP+AMP；EC=(ATP+1/2ADP)/TAN[12]。

1.2.6 AMP活化蛋白激酶(AMPK)、pAMPK、UCP2表達(dá)水平 預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，1∶9比例加入裂解液，勻漿3次，4 ℃，13 000 r/min離心20 min，取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣20 μg，濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，將膜完全浸沒(méi)于3%BSA-TBST中，室溫輕搖30 min，一抗孵育，用3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，4 ℃過(guò)夜。AMPK稀釋比例1∶200，UCP2稀釋比例1∶200，次日二抗孵育，加入ECL反應(yīng)，曝光。

1.2.7 AMPK和UCP2 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 引物在北京Invitrogen公司合成。 AMPK上游引物：CAACAAGCCCACCTGATTCTTTTCT，AMPK下游引物：ATGCCATTTTGCTTTCCTTACACCT；UCP2上游引物：TCACCCAATGTCGCTCGTA，UCP2下游引物：GGCAGGGAAGGTCATCTGT；GAPDH上游引物：GGCTACACTGAGGACCAGGTTG，GAPDH下游引物：CCAGGAAATGAGCTTGACGAA。研磨組織，提取總RNA，進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。Realtime PCR反應(yīng)體系配置如下：2 × Master Mix10 μL，10 μmmoL 的PCR特異引物F 0.5 μL，10 μmmoL 的PCR特異引物R 0.5 μL，加水至總體積為18 μL。將混合液加到96-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，再加入對(duì)應(yīng)的2 μL cDNA，按以下程序進(jìn)行：95 ℃，30 s；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按 (95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 術(shù)后可見(jiàn)接受Ameroid 縮窄環(huán)的動(dòng)物活動(dòng)減少，毛發(fā)粗糙雜亂，飲食差，搖尾次數(shù)減少，叫聲低，掙扎力度減弱。

2.2 心臟功能檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，模型組EF和FS降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組相比，TMZ組EF升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GXDS組EF較模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TMZ組與GXDS組比較EF差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。假手術(shù)組與模型組比較，WT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)組與TMZ組、GXDS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與模型組相比，TMZ組和GXDS組WT升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組用藥干預(yù)后超聲心動(dòng)圖功能指標(biāo)比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.3 電鏡觀察 從心肌線粒體電鏡圖可以看出，假手術(shù)組心肌內(nèi)肌纖維排列緊密，線粒體形態(tài)正常，可見(jiàn)完整的、排列緊密的嵴；模型組心肌肌纖維排列紊亂、減少，可見(jiàn)非特異性細(xì)胞質(zhì)，線粒體可見(jiàn)水腫，嵴稀疏；TMZ組和GXDS組心肌結(jié)構(gòu)改變較模型組輕，可見(jiàn)少量非特異性細(xì)胞質(zhì)，肌纖維排列尚規(guī)律，線粒體水腫較模型組輕，線粒體嵴稍有稀疏紊亂，未見(jiàn)明顯斷裂。詳見(jiàn)圖1。

a為假手術(shù)組；b為模型組；c為T(mén)MZ組；d為GXDS組圖1 各組心肌線粒體電鏡圖

2.4 HE染色 心肌組織的HE染色可見(jiàn)，假手術(shù)組心肌細(xì)胞著色均勻，排列有序；模型組心肌可見(jiàn)心肌纖維數(shù)量減少，扭曲、排列不規(guī)則伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)明顯壞死灶；TMZ組和GXDS組可見(jiàn)輕度著色不均，心肌細(xì)胞排列、形態(tài)尚正常，少見(jiàn)炎性細(xì)胞。詳見(jiàn)圖2。

a為假手術(shù)組；b為模型組；c為T(mén)MZ組；d為GXDS組圖2 各組心肌組織切片HE染色(×200)

2.5 ATP、ADP、AMP含量 HPLC法測(cè)定各組的高能磷酸化合物水平，模型組與假手術(shù)組ATP、ADP、TAN、EC水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AMP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GXDS組與TMZ組在ATP水平上較模型組高，ADP水平較模型組降低，AMP、TAN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而EC水平較模型組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GXDS組ATP和EC水平雖較TMZ組高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。

表2 各組心肌能量參數(shù)和能量參數(shù)水平(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

2.6 AMPK、pAMPK、UCP2蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組相比，模型組AMPK蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TMZ組和GXDS組AMPK水平較假手術(shù)組升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組pAMPK水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組pAMPK較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而TMZ組和GXDS組pAMPK水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組pAMPK/AMPK較其余3組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4組UCP2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型組UCP2高于假手術(shù)組、GXDS組、TMZ組。詳見(jiàn)圖3。

與假手術(shù)組比較，*P0.05；與模型組比較，#P0.05圖3 AMPK、pAMPK、UCP2的蛋白表達(dá)水平

2.7 AMPK、UCP2 mRNA水平表達(dá) 與假手術(shù)組相比較，模型組AMPK和UCP2的基因表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TMZ組和GXDS組干預(yù)后，AMPK和UCP2基因水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在豬的前降支置入Ameroid縮窄環(huán)，建立豬的慢性心肌缺血模型，觀察其心肌收縮功能障礙、細(xì)胞能量?jī)?chǔ)備以及線粒體內(nèi)膜UCP2的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，缺血導(dǎo)致心肌的收縮功能障礙，模型組的EF、FS、WT均較假手術(shù)組降低，GXDS組和TMZ組的EF、WT較模型組增高，模型組心肌的ATP水平降低，AMP未見(jiàn)明顯降低，從而導(dǎo)致AMP/ATP升高，EC和TAN降低。GXDS組和TMZ組ATP、EC較模型組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組AMPK和UCP2的蛋白表達(dá)水平和mRNA水平均升高，AMPK的磷酸化程度增高，GXDS和TMZ可以改善缺血引起的UCP2、AMPK和pAMPK增高。

與假手術(shù)組比較，*P0.05；與模型組比較，#P0.05圖4 心肌AMPK、UCP2 mRNA表達(dá)水平

線粒體與細(xì)胞的能量生成和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[13-14]，線粒體使用細(xì)胞攝取的氧氣進(jìn)行氧化磷酸化，電子沿著電子傳遞鏈移動(dòng)，最終與氧氣結(jié)合[15-17]，這一過(guò)程伴隨著質(zhì)子由線粒體基質(zhì)向線粒體膜間隙移動(dòng)，使線粒體膜間隙的電位高于線粒體基質(zhì)，這種質(zhì)子梯度驅(qū)使質(zhì)子通過(guò)ATP合成酶轉(zhuǎn)移回線粒體基質(zhì)，這時(shí)將ADP磷酸化為ATP[18-19]。UCP2是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，介導(dǎo)跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子流，又叫作“質(zhì)子漏”，UCP2使通過(guò)線粒體呼吸鏈復(fù)合物進(jìn)入線粒體膜間隙的質(zhì)子直接進(jìn)入線粒體基質(zhì)，而不通過(guò)ATP合成酶，使氧化磷酸化解偶聯(lián)[20]，減少ATP的生成。其上游AMPK是細(xì)胞能量代謝的總開(kāi)關(guān)[21]，缺血心肌中AMP/ATP比值的升高導(dǎo)致AMPK的激活[22]，進(jìn)一步激活UCP2。這一系列的變化導(dǎo)致缺血心肌的高能磷酸化合物減少，能量?jī)?chǔ)備降低，導(dǎo)致心肌收縮功能的障礙，表現(xiàn)為EF和WT等參數(shù)的降低。

本研究結(jié)果顯示，冠心丹參滴丸可以改善處于缺血狀態(tài)心臟的心功能，提高射血分?jǐn)?shù)和室壁增厚率，其結(jié)果符合其他以人類(lèi)為研究對(duì)象的臨床研究結(jié)論[23]，其機(jī)制可能是冠心丹參滴丸可以增加心肌的高能磷酸化合物的含量，提高能荷，降低導(dǎo)致質(zhì)子漏的UCP2和其上游AMPK的基因水平和蛋白表達(dá)，減少AMPK的磷酸化。