吳明澤，劉國飛，王笑，李婷，王常瞵，高鵬，代龍*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355;2.山東禹澤藥康產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，山東 德州 251200)

秦艽是我國重要的傳統(tǒng)中藥之一，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的作用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品[1]。秦艽(GentianamacrophyllaPall.)屬于龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana(Tourn.) L.) 植物[2]?，F(xiàn)代研究表明，秦艽主要含有環(huán)烯醚萜苷類、木脂素類、黃酮類、三萜類等化學(xué)成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝臟、免疫抑制、降血壓、保護(hù)腦組織、抗流感病毒、抗腫瘤等藥理作用[3]。其中龍膽苦苷和馬錢苷酸在藥材中含量較高，2015版《中國藥典》將這兩個成分作為藥材質(zhì)量評價的指標(biāo)成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，除龍膽苦苷、馬錢苷酸之外，其他多種環(huán)烯醚萜類成分也具有良好的藥理活性，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷以及6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷均對fMLP誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧化物的生成有抑制作用[4]。所以，本實驗對馬錢苷酸、龍膽苦苷進(jìn)行含量測定，在指紋圖譜中指認(rèn)馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷5種成分，對秦艽藥材及飲片進(jìn)行質(zhì)量控制。

2019年3月，《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報資料要求(征求意見稿)》[5]中提出了藥材、飲片和對應(yīng)實物標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控項目之間應(yīng)具有較好的相關(guān)性。應(yīng)以浸出物(出膏率)、含量測定、指紋圖譜等指標(biāo)，全面考察藥材-飲片-中間體-對應(yīng)實物的相關(guān)性，即質(zhì)量傳遞性。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下以臨床實際應(yīng)用為參考，使用現(xiàn)代中藥提取方法并通過標(biāo)準(zhǔn)化工藝規(guī)程制備而成的單味中藥飲片水煎液。標(biāo)準(zhǔn)湯劑可以標(biāo)化以水為溶媒的新型用藥形式，較大程度上解決了中藥配方顆粒等新型用藥形式與臨床中藥湯劑間存在質(zhì)量和療效差異的問題。在國家出臺的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》中則明確要求有關(guān)中藥配方顆粒的所有研究均應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對比研究[6-8]。秦艽飲片炮制方法為除雜、洗凈、潤透、切厚片、干燥，因此，本實驗將藥材與飲片炮制方法相結(jié)合，將藥材干切至飲片狀，按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮，與飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行比較，為經(jīng)典名方中藥材、飲片的質(zhì)量傳遞性提供了一定的研究基礎(chǔ)。

本實驗擬建立同時適合于秦艽藥材、飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，并結(jié)合含量測定、出膏率，進(jìn)行秦艽的藥材、飲片質(zhì)量傳遞性研究，為秦艽的質(zhì)量控制以及中藥配方顆粒和經(jīng)典名方研究提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀(日本株式會社島津制作所，含Labsolution色譜工作站))；XS105型1/10萬電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TDl-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥

15批秦艽藥材購自不同產(chǎn)地，詳見表1，經(jīng)濟(jì)南市藥品檢驗所主任藥師宋希貴鑒定，為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.的干燥根。經(jīng)檢驗，均符合2015年版《中國藥典》秦艽項下的各項規(guī)定。15批秦艽飲片為上述15批藥材按照藥典標(biāo)準(zhǔn)炮制所得[2]，均為實驗室自制。對照品龍膽苦苷(批號 110770-201716，w≥97.6%)、馬錢苷酸(批號111865-201704，w≥97.4%)、獐牙菜苦苷(批號110785-201404，w≥98.3%)購于中國食品藥品檢定研究院；獐牙菜苷(批號PN1125SA13，w≥98%)、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(批號P26M6S1，w≥98%)購于上海源葉生物技術(shù)有限公司；水為娃哈哈純凈水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

表1 秦艽藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 秦艽藥材、飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[9]及《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》[10]中相關(guān)規(guī)定，確定工藝：稱取干切至飲片狀的藥材(無洗、潤步驟，直接干切)、飲片各100 g，加7倍量水浸泡30 min，加熱回流30 min，趁熱200目濾布過濾；藥渣再加6倍量水，加熱回流20 min，趁熱過濾，合并兩次濾液，備用。按此法制備秦艽藥材、飲片各15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑[11]。

2.2 HPLC指紋圖譜的研究

2.2.1 供試品溶液的制備

取藥材、飲片各15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，取3 mL標(biāo)準(zhǔn)湯劑加甲醇定容至10 mL，5000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

取馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.399 3 mg/mL、0.104 1 mg/mL、0.251 0 mg/mL、0.477 6 mg/mL、0.236 2 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件

Cosmosil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相乙腈(A)-0.1%醋酸(B)，梯度洗脫(0～60 min，3%～15%A)；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長為254 nm。

2.2.4 精密度實驗

取秦艽藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S5)按2.2.1項下制備方法制備樣品，按2.2.3項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以龍膽苦苷色譜峰為參照峰，計算得各共有峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于3.0%、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性實驗

取秦艽藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S5)6份，按2.2.1項下制備方法平行制備6份樣品，按2.2.3項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以龍膽苦苷色譜峰為參照峰，計算得各共有峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于3.0%、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗

取秦艽藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S5)，按2.2.1項下制備方法制備樣品，按2.2.3項下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h時測定，記錄色譜圖，以龍膽苦苷色譜峰為參照峰，計算得各共有峰的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于3.0%、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于5.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 供試品測定

取2.1項下制備的藥材、飲片各15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑(S1～S15)，按2.2.1項下制備方法制備樣品，按2.2.3項下色譜條件進(jìn)行測定。

2.3 指紋圖譜質(zhì)量傳遞性分析

2.3.1 指紋圖譜的相似度評價及色譜峰歸屬

將15批秦艽藥材、飲片的色譜圖數(shù)據(jù)文件分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)軟件，設(shè)參照圖譜、峰匹配，采用平均數(shù)法生成指紋圖譜與對照指紋圖譜，見圖1～3。圖譜中共有5個共有峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，表2可見，藥材、飲片的相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于20%，說明不同產(chǎn)地、不同批次藥材質(zhì)量參差不齊，含量相差較大。采用全譜峰自動匹配計算相似度，由表3可見，15批秦艽藥材、飲片與各自生成的對照指紋圖譜相似度分別為0.996～0.999，0.990～0.998，說明各產(chǎn)地不同批次藥材物質(zhì)群接近。秦艽藥材、飲片的對照指紋圖譜相似度為0.999，對藥材、飲片中的物質(zhì)群進(jìn)行歸屬分析，15批藥材、飲片中都含有5個共有峰，根據(jù)對照品可指認(rèn)峰1～5為馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷，說明炮制對藥材的物質(zhì)群不會造成太大改變。

1 馬錢苷酸； 2 獐牙菜苦苷；3 6’-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；4 龍膽苦苷；5 獐牙菜苷圖1 對照品HPLC圖Fig.1 High-performance liquid chromatography (HPLC) chart of reference substance

圖2 15批秦艽藥材、飲片的HPLC指紋圖譜比較Fig.2 High-performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint spectra among 15 batches of Radix Gentianae Macrophyllae medicinal herbs and standard decoction of medicinal slices

圖3 秦艽藥材、飲片對照指紋圖譜Fig.3 Referance fingerprint spectrum of Radix Gentianae Macrophyllae medicinal herbs and standard decoction of medicinal slices

峰號秦艽藥材相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相對峰面積秦艽飲片相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相對峰面積10.6110.0890.6110.08820.8210.0590.8200.05930.8520.1010.8520.09941.0001.0001.0001.00051.0780.0211.0780.021

表3 15批秦艽藥材、飲片指紋圖譜與各自對照指紋圖譜的相似度

2.4 出膏率及轉(zhuǎn)移率

按2.1項下方法制備藥材、飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測定各15批樣品的出膏率，公式為：出膏率=m/M×100%，其中，m為烘干后樣品質(zhì)量，M為藥材、飲片的取樣量，結(jié)果見表4。15批藥材、飲片出膏率平均值為20.43%、19.71%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.0%、9.6%，出膏轉(zhuǎn)移率平均值為96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(均不超過平均值±30%)。

2.5 馬錢苷酸、龍膽苦苷轉(zhuǎn)移率

按2015年版中國藥典一部秦艽含量測定項[2]對15批藥材及飲片進(jìn)行測定，按轉(zhuǎn)移率=w/W×100%進(jìn)行計算，其中，w為飲片中馬錢苷酸、龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，W為藥材中馬錢苷酸、龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5。馬錢苷酸、龍膽苦苷從藥材到飲片的轉(zhuǎn)移率平均值分別為80.98%、80.56%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%、10%，均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(均不超過平均值±30%)。

表4 秦艽藥材、飲片出膏率及其轉(zhuǎn)移率

表5 秦艽藥材、飲片有效成分轉(zhuǎn)移率

3 討論

本文參照國家藥典委員會公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》[10]和衛(wèi)生部、國家中醫(yī)藥管理局共同下發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[9]，選取 15 批質(zhì)量合格的秦艽，將藥材與飲片炮制方法相結(jié)合，將干切至飲片狀的藥材與飲片，以水為溶劑，進(jìn)行規(guī)范化煎煮，制備的秦艽標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量傳遞性更好，更加標(biāo)準(zhǔn)化。

本文針對指紋圖譜方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過全波長掃描確定254 nm下色譜圖基線平穩(wěn)、分離度良好、峰信息更多，并考察不同流動相0.1%磷酸、0.1%甲酸、0.1%醋酸，確定0.1%醋酸峰形更好；柱溫會影響保留時間及分離度，所以考察了25、30、35 ℃的柱溫，確認(rèn)柱溫為30 ℃時分離度更好，且保留時間適宜。由15批藥材、飲片的指紋圖譜的各共有峰的相對峰面積可以看出，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于20%，說明不同批次的成分含量一致性較差，這與不同產(chǎn)地、氣候、土壤、采收時間、加工方式等都有關(guān)，所以購買藥材盡量挑選道地產(chǎn)地、主產(chǎn)區(qū)或GAP基地，這也側(cè)面反映出中藥材的規(guī)范化種植任重道遠(yuǎn)。

利用HPLC指紋圖譜、出膏率、含量測定，對藥材、飲片進(jìn)行質(zhì)量傳遞性分析，是經(jīng)典名方及中藥配方顆粒所提倡的方法，這種整體控制的方法具有良好的科學(xué)性和合理性[12]。該方法的建立將為經(jīng)典名方研究提供借鑒，后期將應(yīng)用到藥材-飲片-中間體-對應(yīng)實物的相關(guān)性分析中。