李 潔，馬甜甜，剡轉轉，閆 啟，周利斌，余 玲，張吉宇

（1. 蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統國家重點實驗室 / 蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 / 蘭州大學草地農業(yè)教育部工程研究中心 / 蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2. 中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000）

誘變育種的主要目的是提高遺傳變異頻率，從而創(chuàng)造新種質，它是解決常規(guī)育種中某些特殊問題和培育新品種的重要方法之一。1986年，我國首次發(fā)現的水稻注入重離子的誘變效應開創(chuàng)了離子束生物技術[1]。作為植物新的誘變源的重離子束受到了越來越多的重視，重離子輻照誘變育種已成為獲得植物新遺傳資源、選育新品種的重要途徑之一。利用離子束注入技術已經獲得了一些較好的新品系或新材料。趙連芝等[2]培育出了我國首次通過重離子輻射育成的小麥(Triticum aestivum)優(yōu)良新品種隴輻2號。鄭冬官等[3]對去種皮的陸地棉(Gossypium hirsutum)種子進行離子注入，獲得了早熟、株型改善、抗倒伏等不同性狀的棉花新品系。羅紅兵等[4]利用Li離子輻射玉米(Zea mays)雜交種農大108的種子，從中獲得雄性不育突變材料。官梅和李栒[5]對油菜(Brassica campestris)種子進行C離子輻照，從而獲得瘤狀根、矮莖、雙生角果和黃色種子等性狀的突變體。頡紅梅等[6]對豆科和禾本科的牧草種子進行了20Ne10+離子束貫穿處理，篩選出了葉片變厚、葉色深綠、生長勢增強的禾本科牧草新株系。

航天誘變育種可利用空間特殊環(huán)境(高真空、微重力、高能輻射、強磁場等)，使種子產生遺傳變異，獲得有益的突變體，再返回地面用常規(guī)育種方法培育新材料、新種質[7]。我國是全世界繼前蘇聯和美國后第3個掌握了返回式衛(wèi)星技術的國家。近年來，多國在空間站開展了生物實驗，已經培育出一百多種太空植物，為航天誘變育種打下堅實的基礎[8]。我國利用航天誘變技術已經研究了水稻(Oryza sativa)、小麥、大豆(Glycine max)、陸地棉、番茄(Lycopersicon esculentum)、黃瓜(Cucumis sativus)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、一串紅(Salvia splendens)、靈芝(Ganoderma lucidum)等植物，涉及糧、油、棉、蔬菜、瓜果、牧草、花卉和藥材等，培育出水稻“WS31”、小麥“宇航2號”、甜椒“87-2”、太空黃瓜“96-1”、番茄“TF873”等許多新品種(系)[8-11]。我國的航天育種主要集中于農作物、蔬菜、花卉的研究[6]，而對牧草航天育種的研究起步較晚，目前處于初始階段。

無芒隱子草(Cleistogenes songorica)為多年生禾本科植物，主要分布于中國內蒙古、陜西、寧夏、甘肅、青海及新疆等地，是我國西北地區(qū)荒漠草地重要的牧草之一[12]，其飼用價值高，抗熱性、抗旱性、耐寒性極強，對荒漠生態(tài)系統的恢復和保育具有重要作用[13-14]。已有研究報道了無芒隱子草的萌發(fā)[15]、種子生產技術[16]以及秋水仙素和60Co-γ射線對其種子和幼苗生長的影響[17]等，但對于12C6+重離子輻照及航天誘變影響其種子萌發(fā)、幼苗生長和葉綠素熒光特性未見報道。本研究以騰格里無芒隱子草 (Cleistogenes songorica ‘Tenggeli')種子為材料，研究12C6+重離子輻照及航天誘變對其種子萌發(fā)、幼苗生長和葉綠素熒光特性的影響，以期為創(chuàng)制無芒隱子草新種質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘭州大學選育的新品種騰格里無芒隱子草，2015年于甘肅民勤采集種子，貯藏在蘭州大學草地農業(yè)科技學院4 ℃恒溫種質庫中待用。2016年8月取部分無芒隱子草分為3份，一份用于12C6+輻照誘變，一份用于航天誘變，另一份作為對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘變處理

12C6+輻照誘變：將用于12C6+輻照的材料分為8份，用封口膜包裹。于2017年2月24日在中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器國家實驗室(NL-HIAL)重離子研究裝置(HIRFL) TL2終端上進行輻照誘變，在室溫和正常大氣條件下，初始能量為100 MeV·u-1的12C6+離子束，經過束流管道的鎳窗、電離室、空氣和降能片后照射樣品(無芒隱子草種子)，輻照劑量分別為25、50、100、150、200、300、400 和 500 Gy，劑量率為 45 Gy·min-1。誘變后的種子保存在4 ℃恒溫種質庫中。

航天誘變：將用于航天誘變的無芒隱子草種子從4 ℃恒溫種質庫中取出，按要求密封送往中國甘肅酒泉衛(wèi)星發(fā)射基地，搭乘神舟十一號飛船，于2016年10月17日07:30發(fā)射升空，衛(wèi)星軌道距地面393 km，經33 d的航行，于11月18日13:59返回地面。飛行過程中樣品置于飛行返回艙，待返回地面后取出樣品，將處理后的種子送回蘭州大學草地農業(yè)科技學院，保存在4 ℃恒溫種質庫中。

對照為4 ℃恒溫種質庫中的未作任何誘變處理的種子。

1.2.2 種子發(fā)芽試驗

2018年3月13日，從恒溫種質庫中取出對照和不同誘變處理后的種子各500粒，用5.25%[18]的次氯酸鈉表面消毒5 min，蒸餾水至少沖洗3次，后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃下培養(yǎng)(16 h光照，8 h黑暗)[19]。每處理每皿100粒種子，5個重復，每天加等量蒸餾水以保濕。每天統計各培養(yǎng)皿的發(fā)芽種子數量。培養(yǎng)14 d后，統計最終發(fā)芽數[17]并測定幼苗胚芽胚根長及生物量。之后選取長勢一致的各處理無芒隱子草幼苗移植至54 cm × 28 cm的48孔穴盤中(基質為草炭土∶蛭石=3∶1，質量比)在溫室培養(yǎng)(自然光照)，測量株高，測定葉綠素熒光參數并統計各處理無芒隱子草幼苗的存活率。

1.3 測定指標及方法

發(fā)芽指數的測定：第7天計算發(fā)芽指數，發(fā)芽指數(GI)的計算公式[20]為：GI = ∑(Gt/Dt)，其中：Gt代表發(fā)芽第t天的種子發(fā)芽率，Dt為相應的種子發(fā)芽天數。

幼苗胚芽胚根長及生物量的測定：第14天每皿隨機取10個正常發(fā)芽的種子，先用蒸餾水沖洗干凈，經吸水紙吸干后，測定幼苗的胚芽胚根長度以及生物量。胚芽胚根長度用刻度尺測量，生物量用1/10 000分析天平稱量(生物量一次測10個幼苗)。

幼苗株高的測定：移栽穴盤后，第10天每處理隨機選20株幼苗測量株高。

葉綠素熒光的測定：移栽穴盤后的第15天，利用調制葉綠素熒光成像系統MAIX-IMAGING-PAM(WALZ，德國)進行葉綠素熒光參數的測定，測定前先將穴盤在室內放置4～6 h，待其充分適應室內環(huán)境后，用黑布遮住整個穴盤，暗處理30 min后進行測定。每處理分別測定3個長勢相同的葉片。經充分的暗適應后，先用弱的測量光照射葉面，測出初始熒光(F0)，此時，再打開一次飽和光脈沖使熒光上升到Fm，并測得可變熒光(Fv= Fm-F0)。當熒光從Fm快回落到F0時，立即打開光化光和IMAGING-PAM提供的測量光。然后等熒光下降到穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)時，再打開一次同樣強度的飽和脈沖光，測定Fm'。根據給出的參數，計算出充分暗適應下PSⅡ的潛在最大光化學量子效率Fv/ Fm= (Fm-F0) /Fm，由儀器直接導出光化學淬滅系數(qP)、非光化學淬滅系數(NPQ)和電子傳遞速率(ETR)。

幼苗成活率的測定：移栽穴盤后的第14天和第35天分別測定幼苗的成活率，其計算公式為：幼苗成活率 = (成苗數/發(fā)芽的種子數) × 100%。

1.4 數據處理

用EXCEL 2016對不同處理后的數據進行統計和制圖。運用SPSS 21進行方差分析(ANOVA)，當P ＜ 0.05時，認為差異有統計學意義。利用Imaging Win軟件(WALZ，德國)采集熒光參數。

2 結果與分析

2.1 12C6+重離子輻照及航天誘變對無芒隱子草種子萌發(fā)的影響

不同劑量12C6+重離子輻照無芒隱子草后的種子發(fā)芽率呈現出先降低后增高的趨勢，但均低于對照(91.8%)。其中，150、200、300和400 Gy輻照劑量處理的種子發(fā)芽率分別為85.2%、84.6%、80.6%和83.0%，顯著低于對照(P ＜ 0.05)。除25 Gy外，種子的發(fā)芽指數均顯著低于對照(P ＜ 0.05)。在300 Gy輻照劑量時，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數均最低。經航天誘變后無芒隱子草的種子發(fā)芽率顯著低于對照(P ＜ 0.05)，第14天的最終發(fā)芽率為65.2%，較對照組的發(fā)芽率降低了26.8%，發(fā)芽指數也顯著低于對照 (P ＜ 0.05) (圖 1、圖 2)。

2.2 12C6+重離子輻照及航天誘變對無芒隱子草幼苗生長的影響

經不同劑量12C6+重離子輻照處理后的無芒隱子草種子，發(fā)芽14 d的幼苗胚芽胚根長各不同。幼苗的胚芽長均低于對照，其中，150、300、400和500 Gy輻照劑量處理的幼苗胚芽長顯著低于對照(P ＜ 0.05)。500 Gy輻照劑量處理的幼苗胚芽長(4.49 mm)最小，300 Gy次之(5.27 mm)。就胚根長而言，所有處理的胚根長與對照均無顯著差異(P ＞0.05)，且300 Gy輻照劑量處理的幼苗胚根長達到最小(0.97 mm)。無芒隱子草種子經航天誘變處理后，發(fā)芽14 d的幼苗胚芽長顯著低于對照(P ＜ 0.05)，胚根高于對照，但差異不顯著(P ＞ 0.05) (圖3)。

圖 1 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草種子發(fā)芽的影響Figure 1 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on seed germination of Cleistogenes songorica

圖 2 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數的影響Figure 2 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on seed germination percentage and germination index of Cleistogenes songorica不同小寫字母表示同一指標不同處理間差異顯著(P ＜ 0.05)；Control：未作處理對照；SP：航天誘變。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments for the same indicator at the 0.05 level； SP: Space mutation； similarly for the following figures.

經12C6+重離子輻照處理后，300和500 Gy輻照劑量的幼苗生物量顯著低于對照(P ＜ 0.05)。25、100和150 Gy輻照劑量的生物量高于對照(P ＞ 0.05)，其中25和150 Gy輻照劑量處理的生物量與對照基本持平(對照為 9.0 mg，25 Gy為 9.3 mg，150 Gy為9.1 mg)。300 和500 Gy 輻照劑量的生物量顯著低于對照(P ＜ 0.05)，且300 Gy輻照劑量的生物量最低，為6.4 mg。不同劑量12C6+重離子輻照無芒隱子草后株高各不相同。150、200和500 Gy輻照劑量處理的幼苗株高與對照之間存在顯著差異(P ＜0.05)。其中，150 Gy劑量處理的幼苗株高最高，比對照高出3.91 cm。500 Gy劑量處理的幼苗株高最矮，比對照低3.2 cm。航天誘變明顯促進了無芒隱子草幼苗的生長，幼苗生物量高于對照，株高高于對照2.05 cm (圖4)。

圖 3 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草胚芽和胚根長的影響Figure 3 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on plumule and radicle length of Cleistogenes songorica

無芒隱子草經12C6+重離子輻照航天誘變和處理，各處理第35天的幼苗存活率均低于第14天(圖5)。在12C6+重離子輻照下，100 Gy輻照劑量處理的無芒隱子草第35天的幼苗存活率最高，為73.96%，500 Gy輻照劑量處理的無芒隱子草幼苗存活率最低，僅為10.14%。航天誘變后的無芒隱子草第35天的幼苗成活率略低于對照。

2.3 12C6+重離子輻照及航天誘變對無芒隱子草幼苗葉綠素熒光參數的影響

不同劑量12C6+重離子輻照和航天誘變后對無芒隱子草幼苗的Fv/Fm、qP、NPQ和ETR值有一定的影響。不同劑量12C6+重離子輻照無芒隱子草后幼苗的Fv/Fm值均顯著低于對照(P ＜ 0.05)，500 Gy輻照劑量處理時的Fv/Fm值最小(表1)。qP值和NPQ值均與對照無顯著差異(P ＞ 0.05)，且qP值與NPQ值的變化趨勢相反。除25和150 Gy輻照劑量外，無芒隱子草幼苗的ETR值均顯著低于對照(P ＜ 0.05)。300 Gy輻照劑量處理時幼苗的ETR值最小。航天誘變無芒隱子草后，幼苗的Fv/Fm值和ETR值均顯著低于對照(P ＜ 0.05)。幼苗的qP值低于對照，NPQ值高于對照，但二者均與對照無顯著差異(P ＞ 0.05)(表1)。圖6展示了利用MAXI-IMAGING-PAM測量不同劑量12C6+重離子輻照和航天誘變處理下無芒隱子草幼苗葉綠素熒光參數的部位和部分指標。

圖 5 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草幼苗存活率的影響Figure 5 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on the seedling survival rate of Cleistogenes songorica

圖 6 基于IMAGING-PAM測量不同處理下無芒隱子草幼苗的Fv / Fm值Figure 6 Fv / Fm values of seedlings of Cleistogenes songorica under different treatments based on IMAGING-PAM

表 1 12C6+輻照及航天誘變后對無芒隱子草幼苗Fv/Fm、qP、NPQ和ETR的變化Table 1 Changes of Fv/Fm, qP, NPQ, and ETR in Cleistogenes songorica after 12C6+ irradiation and space mutation

3 討論與結論

與X射線和γ射線等相比，重離子束照射對植物材料M1代生理損傷輕、M2代突變率較高、性狀穩(wěn)定、育種周期短。因此近年來，許多國內外科研機構都進行了重離子束照射突變育種[21-22]。前人研究表明，12C6+重離子輻照對不同種類的植物種子萌發(fā)與幼苗生長存在劑量型效應。侯歲穩(wěn)等[23]發(fā)現，低劑量12C6+重離子輻照對胡麻(Sesamum indicum)的發(fā)芽及株高等指標有促進作用，高劑量輻照則對其有抑制作用。此外，在菘藍(Isatis indigotica)的研究中顯示，其株高和根長隨輻照劑量的增加而降低[24]。本研究表明，12C6+重離子輻照無芒隱子草后，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數、胚芽胚根長整體均呈現出隨輻照劑量的增加而緩慢降低的趨勢，這與陸錫宏等[24]的研究結果相似。劉青芳等[25]用12C6+離子輻照小麥種子，以輻照劑量10 Gy為界限，發(fā)芽率、幼苗胚根長及株高呈現先上升后減小的趨勢。因此推測，在本研究中當初始劑量低于25 Gy時，無芒隱子草的發(fā)芽率、發(fā)芽指數、胚芽胚根長可能會出現先上升后降低的趨勢是未可知的。在本研究中，幼苗的生物量和株高整體呈現出隨著輻照劑量的增加先降低后增加再降低的“類馬鞍形”曲線。這可能是12C6+離子對無芒隱子草的輻照處理根據劑量的不同產生了低劑量的輕微刺激和高劑量的損傷效應導致的，這與余麗霞等[26]的研究結果基本一致。但杜艷等[27]的研究結果表明，經C離子束處理后幼苗的生物量和株高都隨輻照劑量的增加而降低。這與本研究的結果存在部分不同之處，可能與輻照材料、材料對輻照的敏感性以及輻照方式和輻照劑量的不同有關。12C6+離子輻照無芒隱子草種子后，在25～150 Gy輻照劑量之間時，除50 Gy幼苗的存活率略低于對照以外，其余輻照劑量均高于對照，在150 Gy時，幼苗的存活率急速下降，之后幼苗的存活率保持在10%～30%，說明在整體上離子束對幼苗存活具有一定程度的抑制作用。Du等[28]用0～600 Gy的12C6+離子輻照擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子，發(fā)現生長21 d的幼苗存活率隨輻照劑量的增加呈現出短暫上升，然后快速下降，最后基本保持穩(wěn)定的趨勢，這與本研究關于幼苗存活率的結果較一致。在升高過程中，50 Gy處理下幼苗存活率略低于對照，可能是由于外界復雜的環(huán)境因素造成的，例如水、光照條件等。

航天育種作為農作物誘變育種的新興領域，可以創(chuàng)造出更多新的種質資源，培育優(yōu)良的品種[29]。不同的植物材料由于對空間環(huán)境的敏感程度及空間飛行期間所處的環(huán)境不同，因此經空間飛行后的種子生活力各不相同[30]。本研究表明，航天誘變處理后無芒隱子草的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數、胚芽長顯著低于對照，幼苗胚根長和生物量略高于對照，但與對照無顯著差異。說明無芒隱子草的種子經航天搭載處理后種子活力整體上減弱。幼苗株高和生物量高于對照，說明航天誘變對無芒隱子草幼苗的生長有一定的促進作用。移栽穴盤后的幼苗存活率略低于對照，但與對照差異不大，說明航天搭載對無芒隱子草成苗后的幼苗適應性影響不大，這與何明霞等[31]的研究結果一致。但是，逄明達等[32]用神舟十號飛船搭載小麥品種濟麥22，對生長5 d的幼苗生長勢、苗高、鮮重和根長等主要指標進行對比分析，發(fā)現處理后的幼苗與地面對照相比生物量略有降低，胚芽鞘變長，根長變短，株高變高，這與本研究結果不太一致。這可能是因為航天誘變會因物種或者搭載的環(huán)境不同而對植物生長的影響產生差異。航天誘變由多因素綜合作用且存在未知的誘變因素，對植物的生長影響具有獨特性和復雜性[12,33-34]。但由于進行空間搭載的機會限制，目前空間環(huán)境對無芒隱子草生長影響的研究僅有此一例，搭載神舟十一號飛船對無芒隱子草種子發(fā)芽特性和幼苗生長的影響是只表現在搭載當代還是已經影響了遺傳而在后代繼續(xù)表達，是什么機制導致了其種子發(fā)芽和幼苗生長還有待進一步深入研究。

葉綠素熒光和植物的光合作用聯系緊密，植物的葉綠素熒光參數可以直觀地反映其最大的光合作用能力、抗脅迫能力及本身的生長狀態(tài)[35]。本研究結果表明，不同劑量的12C6+重離子輻照和航天誘變處理后幼苗的Fv/Fm和ETR值總體顯著低于對照，qP值與NPQ值與對照無顯著差異，這說明12C6+重離子輻照和航天誘變影響了幼苗的最大光合作用能力，降低了光合電子傳遞速率，但對幼苗葉片的光合活性和光能耗散程度基本無影響。對于12C6+輻照對植物葉綠素熒光的影響，在擬南芥中也有過類似的報道，輻照處理導致擬南芥幼苗光吸收效率降低，PSII反應系統受損，電子傳遞速率下降[36]。陸璃[37]與逄明達等[32]對小麥的航天誘變研究結果也表明，航天誘變會影響小麥光合系統活性中心的發(fā)育，對幼苗生長產生脅迫作用。

本研究表明，12C6+重離子輻照和航天誘變對無芒隱子草種子萌發(fā)、幼苗生長及葉綠素熒光參數整體上有抑制作用，但并未確定無芒隱子草的半致死劑量以及最適宜的輻照劑量，還有待進一步深入研究。結合生理代謝指標及細胞學效應等的研究，為12C6+重離子輻照和航天誘變有效運用于無芒隱子草誘變育種提供依據。