王春陽 謝廣成 嚴(yán)琴琴 陳 敏 賀茂芳 杜向陽

(西安醫(yī)學(xué)院，西安270021)

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，單股正鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒手足口病的主要病原體之一，大部分重癥手足口病例是由EV71感染所致[1]。EV71主要感染5歲以下嬰幼兒，臨床上多為自限性疾病，少數(shù)重癥病例可進一步引發(fā)心肌炎、肺水腫、腦干腦炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重危及患兒的生命，給社會和家庭帶來巨大的損失和影響。目前臨床上針對EV71感染的治療主要為對癥治療和支持治療[2]。臨床上尚沒有有效的抗病毒藥物。常用的西藥病毒唑有一定療效，但不良反應(yīng)嚴(yán)重，長期應(yīng)用對患兒的身體不利，而且存在耐藥性[3]。中草藥具有安全、毒副作用小的特點。然而關(guān)于天然中草藥抗病毒活性的研究尚少，因此本研對魚腥草、薄荷、甘草、梔子、知母、牛蒡、黃芩、連翹、防風(fēng)、柴胡、川貝母以及海金沙12種中草藥抗EV71活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 魚腥草、薄荷、甘草、梔子、知母、牛蒡、黃芩、連翹、防風(fēng)、柴胡、川貝母以及海金沙12種藥材購于陜西省西安市醫(yī)府大藥房，經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院賀茂芳教師鑒定。水提物的制備：將烘干的藥材粉碎后，稱取10.0 g，加入100 ml蒸餾水，于60℃水浴鍋中孵育24 h。棄去藥渣，5 000 r/min離心10 min。取上清液，濃縮至20 ml，轉(zhuǎn)至減壓干燥機完全干燥，用含5% DMSO的細(xì)胞維持液配成10 mg/ml 母液，存于EP管中，放于-20℃冰箱備用。利巴韋林注射液(廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號：120201)。

1.1.2 細(xì)胞和病毒 非洲綠猴腎上皮Vero細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于包含高糖的熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺以及非必需氨基酸的完全DMEM中。 細(xì)胞于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。EV71病毒(阜陽株)由江蘇省疾病預(yù)防與控制中心惠贈。EV71在RD細(xì)胞培養(yǎng)擴增后分裝保存于-80℃冰箱。

1.1.3 試劑和儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司。StepOneTMReal-Time PCR 儀器為美國ABI公司產(chǎn)品。NANODROP 2000核酸定量儀為美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 12種中草藥水提物抗EV71活性檢測的細(xì)胞分組：空白對照組(Control)、僅有EV71感染組(EV71)、12種中草藥水提液處理組(水提液+EV71)、利巴韋林處理組(利巴韋林+EV71)。

1.2.2 實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)測定VP1的表達 根據(jù)RNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)說明書提取感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞的總RNA。用美國Thermo公司的Nanodrop測定RNA的濃度與純度。按照TaKaRa公司的2 Step Real Time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RRO36A)說明書，取500 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用獲得的cDNA作為模版按照TaKaRa的SYBR熒光定量Realtime PCR試劑盒(RR420A)的說明書配制PCR反應(yīng)液，然后在Applied Biosystems StepOnePlusTM儀器上進行熒光定量反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性30 s，然后95℃ 5 s，60℃ 30 s,進行40個循環(huán)。內(nèi)參基因選取磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因。每個做3個孔，每次實驗重復(fù)3次。基因的表達水平按照公式2ΔCt of Gene-ΔCt of GAPDH)進行計算。引物序列見表1。

1.2.3 12種中草藥水提物抗EV71活性檢測 EV71引起的細(xì)胞病變效應(yīng)可以通過MTT的方法定量檢測。將12種中草藥水提液提前2 h加入生長旺盛的單層Vero細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后EV71以MOI為0.1感染Vero細(xì)胞24 h。一方面用MTT測定細(xì)胞活力，讀取A570值，利巴韋林為陽性對照。按公式計算細(xì)胞相對于對照的存活率；一方面收集上清液，用TCID50的方法測定病毒滴度，以確定中草藥水提液對EV71子代病毒釋放的影響；一方面提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Realtime PCR的方法檢測VP1蛋白的表達情況。

1.2.4 病毒滴度的測定 將消化懸浮的Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)12～16 h。取10個EP管，每管各加入90 μl的無血清DMEM。將病毒原液吹打均勻后吸取10 μl加入到第一管中，用槍頭上下吹打混勻，從第一管中吸取10 μl加入第二管，上下吹打混勻，以此類推逐個稀釋至10-8，每一次稀釋都要更換槍頭。然后將各稀釋度的病毒加入到已培養(yǎng)好的Vero細(xì)胞中，每個稀釋度接種8個孔，每個孔10 μl。觀察并記錄細(xì)胞病變情況。按照Reed-Muench方法[4]，計算TCID50。

1.2.5 藥物抑制病毒感染的時間曲線 96孔板中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層后，用魚腥草水提液按圖3所示時間加入到細(xì)胞中，即在病毒感染前2 h，與病毒同時加入，以及病毒感染后2、4、6、8、10、12、16、24 h(-2、0、2、4、6、8、10、12、16、24 h)加入到細(xì)胞中，待病毒感染72 h之后，用MTT方法檢測藥物抑制病毒感染的抑制率。

1.2.6 檢測魚腥草水提液是否直接滅活病毒 將終濃度為0.1 mg/ml的魚腥草水提液與1×105TCID50的EV71于100 μl的無血清培養(yǎng)基中混合(Houttu-ynia cordata Thunb+EV71組)，37℃孵育60 min后，取混合液10 μl感染24孔板的Vero細(xì)胞，重復(fù)3個復(fù)孔，同時設(shè)置無處理的正常病毒組(EV71組)和去離子水處理的病毒組(ddH2O+EV71組)。待病毒吸附細(xì)胞2 h之后，將培養(yǎng)基去掉，用無血清DMEM洗3次，以去除未吸附的病毒和殘留的藥物。病毒感染48 h之后，收集感染的細(xì)胞和上清，用Reed-Muench法計算EV71病毒滴度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 12種中草藥水提物的細(xì)胞毒性檢測 MTT實驗結(jié)果顯示，12種中草藥水提物在0.1 mg/ml的濃度下細(xì)胞活力與對照組相差無幾(圖1)，說明12種中草藥水提物在此濃度以內(nèi)對Vero細(xì)胞生長沒有明顯的毒性和抑制作用。

2.2 12種中草藥水提液抗EV71作用 分別用12種中草藥水提液(終濃度為0.1 mg/ml)預(yù)處理Vero細(xì)胞2 h，然后EV71以MOI為0.1感染細(xì)胞24 h，利巴韋林作為陽性對照。應(yīng)用MTT實驗檢測細(xì)胞活力，與EV71感染組相比，魚腥草水提液能夠顯著提高細(xì)胞的存活率(P值為0.002 8)，表明其能夠顯著抑制EV71感染誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖2A)。陽性對照利巴韋林也能夠顯著抑制EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞

圖1 12種中草藥水提物的細(xì)胞毒性檢測Fig.1 Determination of cytotoxicity of water extracts of twelve Chinese herbs on Vero cellsNote: 1.Glyeyrrhiza uralensis Fisch；2.Gardeniu jasmionids Ellis；3.Anemarrhena asphodeloides Bunge；4.Arctium lappl L；5.Houttuynia cordata Thund；6.Forsythia suspens；7.Saposhnikovia divaricata(Trucz.) Schischk；8.Bupleurum chinense；9.Mentha haplocalyx.Briq；10.Lygodium japonicum(Thunb.)SW；11.Scutellaria baicalensis Georgi；12.Fritillaria cirrhosa,D.

死亡(P值為0.000 3)。由圖2A結(jié)果可知，魚腥草對細(xì)胞的保護作用明顯優(yōu)于陽性對照利巴韋林。與EV71感染組相比，薄荷水提液只能略微提高細(xì)胞的存活率。其他10種中草藥水提液的細(xì)胞存活率與EV71感染組并無差異，說明這幾種中草藥對細(xì)胞均沒有有效的保護作用。

收集細(xì)胞上清液，檢測病毒滴度發(fā)現(xiàn)(圖2B)，與病毒組相比，除了薄荷、魚腥草水提液分別將病毒滴度降低了0.9 logs和4.15 logs(P值分別為0.006 1，0.014 3)，其他10種中草藥水提液均對病毒滴度沒有明顯的影響。利巴韋林將病毒滴度降低了3.3 logs(P值為0.005 9)。以上結(jié)果說明薄荷和魚腥草水提物能夠抑制EV71子代病毒釋放的影響，并且魚腥草在0.1 mg/ml的濃度下，具有優(yōu)于陽性對照利巴韋林的抗病毒作用。

提前用0.1 mg/ml的水提物處理細(xì)胞2 h，EV71感染Vero細(xì)胞24 h后提取RNA，應(yīng)用Realtime PCR的方法檢測VP1的mRNA的表達。結(jié)果表明，魚腥草水提液和利巴韋林均能夠明顯降低EV71病毒蛋白VP1的表達(P值分別為0.000 8，0.009 1)，并且魚腥草對VP1表達的抑制作用比利巴韋林更加明顯(圖2C)。

魚腥草水提物檢測藥物抑制病毒感染的時間曲線結(jié)果顯示，魚腥草水提液預(yù)處理細(xì)胞2 h對EV71感染的抑制率為99.88%(圖3A)。但是，EV71感染Vero細(xì)胞2 h后加入的魚腥草水提液對病毒的抑制效果越來越差，說明魚腥草在EV71進入宿主細(xì)胞之前就能抑制EV71的感染。將終濃度為0.1 mg/ml 的魚腥草水提液與1×104TCID50的EV71預(yù)先共同孵育30 min后，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染48 h后檢測病毒滴度。結(jié)果顯示，魚腥草處理組能抑制病毒感染達5個log以上，即105倍以上(圖3B)，提示魚腥草水提液能直接滅活EV71病毒。綜上實驗結(jié)果表明，魚腥草水提液主要通過直接滅活EV71病毒，導(dǎo)致病毒失活不能繼續(xù)感染。

圖2 12種中草藥水提液抗EV71感染評估Fig.2 Evaluation of antiviral activity on EV71 by water extracts of twelve Chinese herbsNote: 1.Glyeyrrhiza uralensis Fisch；2.Gardeniu jasmionids Ellis；3.Anemarrhena asphodeloides Bunge；4.Arctium lappl L；5.Houttuynia cordata Thund；6.Forsythia suspens；7.Saposhnikovia divaricata(Trucz.) Schischk；8.Bupleurum chinense；9.Mentha haplocalyx.Briq；10.Lygodium japonicum(Thunb.)SW；11.Scutellaria baicalensis Georgi；12.Fritillaria cirrhosa,D；13.ribavirin.

圖3 魚腥草水提液能直接滅活EV71病毒顆粒Fig.3 Water extracts of Houttuynia cordata Thunb.directly inactivates EV71 viron

3 討論

手足口病是常見的傳染病，EV71是引起手足口病的主要病原，并且重癥手足口病多為EV71感染所致。目前尚無有效的抗病毒藥物。傳統(tǒng)中藥有抑制病毒復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫功能、改善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎等綜合功效[5]。目前，中西藥聯(lián)合是治療手足口病的重要手段之一。

在手足口病暴發(fā)期間，中草藥被用來臨床治療手足口病，能夠減輕患兒的癥狀，縮短病程[6]。因此，中草藥在提高臨床診治水平、控制疾病發(fā)生發(fā)展中有著積極作用，展現(xiàn)了其獨特的臨床優(yōu)勢與特點。然而，目前并沒有從實驗室水平系統(tǒng)評估這些中草藥的抗病毒作用。很多中藥被推薦來治療手足口病。我們通過篩選12種常用的中草藥，發(fā)現(xiàn)這12種中草藥中只有魚腥草和薄荷有直接抗病毒的作用。魚腥草具有清熱解毒的功能，在民間被用來治療痔瘡、痢疾、感冒等病癥。據(jù)報道，魚腥草能夠在體外抑制甲型流感病毒和單純皰疹病毒的復(fù)制[7,8]。我們發(fā)現(xiàn)，魚腥草能夠直接滅活EV71病毒顆粒，從而阻斷病毒感染。其他10種中草藥雖然沒有直接的抗病毒作用，但可能是通過其他機制，比如抗炎等，達到緩解患兒病情的作用。這一過程需要進一步證實。

需要注意的是，本實驗只研究了單味中藥的抗病毒作用，而臨床應(yīng)用的時候是混合制劑，甚至?xí)砑右恍┯袡C物一起用于治療手足口病。因此混合制劑既可能會增加療效，也有可能會影響單味中藥的抗病毒作用。雖然我們針對抗病毒藥物的篩選做了大量工作，但對其中的有效成分抗病毒作用的機制研究、復(fù)方中各成分之間的相互作用研究仍然任重而道遠(yuǎn)。綜合以上結(jié)果，本研究證實了中草藥在臨床治療手足口病的有效性，為將來針對手足口病的藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。