王 虹 尹顯華 胡水清

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿內科，遵義563000)

急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是危重患者常見并發(fā)癥，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示住院患者AKI發(fā)病率為5.0%～22.7%，死亡率高達10.8%，且死亡風險是非AKI患者的4倍[1,2]，因此一直倍受重視。約47%的AKI是由缺血再灌注損傷(Ischemical reperfusion injury，IRI)引起的[3]。炎癥反應在IRI過程中發(fā)揮重要作用。轉錄因子NF-κB(Nuclear factor kappa B)是Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)下游的關鍵因子，TLR-4/NF-κB信號通路可調節(jié)炎癥因子的表達進而調控炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，在IRI模型AKI大鼠的腎組織中TLR-4及NF-κB蛋白高表達，提示TLR-4/NF-κB信號通路參與了AKI的發(fā)生[4]。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是中藥黃芪的主要生物活性物質。研究發(fā)現(xiàn)，APS對脂多糖誘導的心肌細胞炎癥損害具有保護作用[5]，且在體內外證實其對IRI亦具有保護作用[6]。研究還發(fā)現(xiàn)，APS可抑制骨髓間充質干細胞及心肌細胞中TLR-4及NF-κB蛋白的表達[5,7]。本課題擬研究APS對IRI大鼠AKI是否具有保護作用，及其機制是否與抑制TLR-4/NF-κB信號通路有關。

1 材料與方法

1.1 材料 APS購自天津賽諾制藥有限公司；TRIzol試劑購自美國 Invitrogen公司；dNTP Mixture、RNA酶抑制劑、SYBR?Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；MMLV逆轉錄酶購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司；兔抗鼠TLR-4、NF-κB(p65)一抗購自美國Eptomics公司；兔抗鼠GAPDH一抗、山羊抗兔二抗、免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；引物設計合成由上海生工生物工程有限公司完成；實驗用SD雄性大鼠購自遵義醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 SD大鼠共96只，8～10周齡，體重250～300 g，隨機分為假手術組(對照組)、模型組、APS低劑量治療組和APS高劑量治療組，每組24只。根據(jù)參考文獻[3]建立動物模型:大鼠俯臥位，7%水合氯醛按0.3 g/kg腹腔注射麻醉。于背部正中偏右1 cm、近第12肋向下縱行切開皮膚，切開腰背筋膜暴露腎周脂肪組織。鈍性游離脂肪組織顯露右腎及腎蒂，銳性分離雙側腎動脈。辨認與腹主動脈關系后，動脈夾阻斷雙側腎動脈45 min 后松開，觀察腎灌注良好后逐層關閉切口。假手術組游離雙側腎動脈后不夾閉。

APS低劑量治療組與高劑量治療組在術前2 h及術后24 h分別在腹腔注射200 mg/kg及400 mg/kg的APS，模型對照組腹腔注射等量生理鹽水。

術前2 h給藥組在術后24 h進行取樣，術后24 h 給藥組在術后48 h進行取樣(每組兩時間點取各12只):大鼠同法麻醉后采集尾靜脈血送生化檢測，并切取右側腎臟，生理鹽水漂洗后，一部分腎組織在-80℃冰箱中保存以備提取mRNA，一部分用10%中性福爾馬林溶液固定。常規(guī)方法制備切片，用于免疫組織化學染色。

1.2.2 AKI傳統(tǒng)指標檢測 全自動生化檢測儀檢測各組術后24 h、48 h血肌酐(Creatinine，Cr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)表達水平。

1.2.3 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測mRNA相對表達 各組切除后的腎組織采用液氮研磨、Trizol法提取Total RNA，運用M-MLV逆轉錄酶及相關試劑進行逆轉錄反應，反應體系為20 μl，具體如下:RNA 2 μg+RT引物1 μl+DEPC水8 μl，65℃ 10 min，立刻冰浴2 min；隨后補加:5×buffer 4 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、dNTPs(10 mmol/L)1 μl、RNase Inhibitor 1 μl、M-MLV 1 μl，42℃ 30 min、70℃ 10 min。取0.5 μl逆轉錄產物運用SYBR?Premix Ex TaqTM進行RT-qPCR。以GAPDH為內參，反應條件如下:94℃ 4 min；94℃ 30 s、56℃ 60 s、72C 40 s,進行40個循環(huán)。引物序列見表1。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 各組切除后新鮮腎組織中加入適量冷組織蛋白裂解液后，將標本剪碎，置入超聲波細胞粉碎機勻漿超聲破碎。破碎后的樣本冰浴靜止裂解30 min,于4℃ 13 500 r/min離心10 min，取上清，放至新的EP管中于-80℃保存。配制5%與10%SDS-PAGE變性膠對目的蛋白進行電泳、濕法轉至PVDF膜、1×Blotto中封閉、加入一抗4℃搖床過夜、TBST液洗膜后加入二抗(HRP標記山羊抗兔IgG抗體)、ECL法發(fā)光拍照。最后采用Image-Pro Plus軟件對條帶的吸光度值進行分析，目的蛋白相對量用目的條帶吸光度值/內參GAPDH蛋白條帶吸光度值表示。

1.2.5 免疫組化檢測 組織石蠟切片后二甲苯中浸泡脫蠟；梯度乙醇浸泡脫水；3%H2O237℃孵育10 min滅活內源性過氧化物酶。接著在0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)中95℃左右對抗原進行熱修復；正常山羊血清封閉液封閉，按順序滴入一抗、二抗孵育。按DAB顯色試劑盒操作說明顯色，鏡下掌握顯色程度。自來水充分沖洗后，蘇木素復染、常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，晾干后顯微鏡下觀察棕褐色著色為陽性細胞。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstreamDownstreamTLR45'-TTCAGAACTTCAGTGGCTGGATTTA-3'5'-GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3'NF-κB5'-TCTGAACAGCAAGTCATCCATAACG-3'5'-AAGGAAGTGAGGTTGAGGAGTCG-3'GAPDH5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'5'-TGAGAAAGGAGACCCAGCAG-3'

2 結果

2.1 APS對大鼠模型血BUN、Cr指標的影響 與假手術組比較，術后24 h及48 h，模型組血BUN、Cr指標明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)，提示大鼠模型建立成功。與模型組比較，術后24 h及48 h，低劑量APS治療組及高劑量治療組血BUN、Cr均下降，低劑量治療組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高劑量治療組明顯降低(P<0.05)，見圖1。

2.2 腎組織中TLR-4、NF-κB mRNA表達 RT-qPCR檢測各組兩指標相對量，與假手術組比較，術后24 h及48 h，模型組TLR-4、NF-κB mRNA均顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，術后24 h及48 h，APS處理后TLR-4、NF-κB mRNA表達均有下降趨勢，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量組顯著下降(P<0.05)，見圖2。

2.3 腎組織中TLR-4、NF-κB蛋白表達 Western blot檢測各組兩蛋白表達結果，與假手術組比較，術后24 h及48 h，模型組TLR-4、NF-κB 蛋白均明顯增高(P<0.05)，TLR-4、NF-κB蛋白表達趨勢與mRNA水平一致，提示TLR-4/NF-κB通路參與了IRI大鼠AKI的發(fā)生。與模型組比較，術后24 h及48 h，APS處理后TLR-4、NF-κB 蛋白表達均有下降趨勢，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量組顯著下降(P<0.05)，見圖3，各組TLR-4、NF-κB蛋白表達趨勢與mRNA水平一致。

圖1 各組術后24 h、48 h血Cr、BUN檢測結果Fig.1 Levels of serum Cr and BUN test at 24 h and 48 h after operation in each groupNote: Model compared with sham operation,*.P<0.05;high dose treatment and low dose treatment compared with model,#.P<0.05.

圖2 各組腎組織中TLR-4與NF-κB mRNA相對表達Fig.2 Relative expression levels of TLR-4 and NF-κB mRNA detected by RT-qPCR in renal tissues of each groupNote: Model compared with sham operation,*.P<0.05;high dose treatment and low dose treatment compared with model,#.P<0.05.

2.4 免疫組化檢測各組腎組織TLR-4、NF-κB蛋白表達 假手術組中TLR4表達定位于腎小管細胞膜，僅有少量表達，模型組中TLR4表達明顯增高，呈棕色著色，與假手術組比較，術后24 h及48 h，模型組TLR4陽性細胞百分率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4；與模型組比較，術后24 h及48 h，低劑量組、高劑量組中TLR4陽性細胞百分率下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。NF-κB蛋白在腎組織中表達定位于胞漿內，術后24 h及48 h，模型組中NF-κB蛋白表達增強，對比假手術組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，術后 24 h及48 h，低劑量組與高劑量組中NF-κB陽性細胞百分率有下降趨勢，低劑量組降低無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量組則顯著下降(P<0.05)，見圖5。

圖3 Western blot檢測各組腎組織TLR-4和NF-κB蛋白表達Fig.3 Proteins expression of TLR-4 and NF-κB detected by Western blot in renal tissues of each groupNote: Model compared with sham operation,*.P<0.05;high dose treatment and low dose treatment compared with model,#.P<0.05.

圖4 免疫組化檢測各組腎組織中TLR-4蛋白表達

Fig.4 TLR-4 protein expression detected by IHC in renal tissues of each group

Note: Model compared with sham operation,*.P<0.05;high dose treatment and low dose treatment compared with model,#.P<0.05.

圖5 免疫組化檢測各組腎組織中NF-κB蛋白表達

Fig.5 NF-κB protein expression detected by IHC in renal tissues of each group

Note: Model compared with sham operation,*.P<0.05;high dose treatment and low dose treatment compared with model,#.P<0.05.

3 討論

IRI引起AKI后主要病理變化為急性腎小球壞死，并引起相關生理、病理學改變如內皮細胞損傷、血液動力學改變、炎癥反應及腎小管上皮細胞損傷與修復，其中炎癥反應是其最重要的病理生理改變，但相關作用機制及調控網絡尚未完全研究清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4調控其下游因子NF-κB參與免疫與炎癥反應[8]。TLR-4是Toll家族成員之一，在多種組織中表達，主要參與固有免疫。當腎臟組織發(fā)生感染或損傷時，TLR-4表達增加，通過識別相應的內外源配體介導機體免疫及炎癥反應[9]。NF-κB又稱核轉錄因子，幾乎存在于所有的細胞中，與其他細胞因子構成NF-κB信號通路在炎癥反應、免疫反應和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。其信號通路的激活分為兩種途徑:經典途徑以及非經典途徑。非經典途徑主要參與細胞分化、活化；經典途徑主要參與炎癥反應，其激活方式依靠抑制蛋白(IKBs)降解[10]。TLR-4可通過MyD88-IRAK-TRAF6-TAK1 NIK/MKK-IKK復合物途徑激活NF-κB經典信號通路[11]。Gao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4與NF-κB兩者在IRI大鼠AKI模型中高表達，提示TLR-4/NF-κB信號通路參與了AKI的發(fā)生。本研究也有相同的發(fā)現(xiàn)，本實驗采用雙側腎動脈夾閉的方式成功建立IRI大鼠AKI模型，與實施假手術的對照組比較，手術后24 h及48 h，模型組腎組織TLR-4、NF-κB在mRNA水平及蛋白水平均明顯增高。

研究發(fā)現(xiàn)，APS具有增強免疫功能、抗腫瘤活性、保肝、降血糖、抗病毒等功效[12]，此外在慢性腎衰動物模型實驗中發(fā)現(xiàn)，APS通過改善脂類過氧化導致的應激狀態(tài)，發(fā)揮抗氧化作用從而保護腎功能[13]。APS是否對AKI也具有保護作用，目前鮮見文獻報道。在本研究中，我們在手術前2h及術后24 h對造模大鼠分別給予腹腔注射低劑量及高劑量APS，結果發(fā)現(xiàn)，在術后24 h及48 h，與造模組比較，血BUN、Cr均下降，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義，高劑量組則顯著降低，表明APS對IRI大鼠AKI具有保護作用，且高劑量的APS保護作用更明顯。進一步研究發(fā)現(xiàn)，術后24 h及48 h，高劑量組腎組織TLR-4、NF-κB的mRNA及蛋白水平均顯著低于模型組，提示APS對IRI大鼠AKI具有保護作用可能與抑制TLR-4/NF-κB信號通路有關。

綜上所述，我們通過成功建立IRI大鼠AKI模型，一方面驗證TLR-4/NF-κB信號通路參與AKI的發(fā)生，另一方面發(fā)現(xiàn)APS對IRI大鼠AKI具有保護作用，且其作用機制可能與抑制TLR-4/NF-κB信號通路有關。