王玉琳 霍婷婷 馮晨旭 張 旭 楊 潔 董發(fā)勤 鄧建軍

(西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,瀘州 646000)

PM2.5是霧霾的主要成分之一，因其粒徑小，隨呼吸進入體內(nèi)后部分可沉積于肺泡，還可透過肺血液屏障隨血液循環(huán)到達全身，對多個組織器官造成損傷[1,2]。呼吸系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查表明，PM2.5可刺激巨噬細胞、支氣管上皮細胞及肺泡上皮細胞釋放大量的炎癥因子，誘發(fā)或加重哮喘、支氣管炎和肺纖維化等肺部疾病，甚至和肺部腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3,4]。NLRP3炎癥小體是機體固有免疫的重要組成部分，病毒、寄生蟲和細菌等病原體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等均可活化NLRP3炎癥小體[5]。NLRP3炎癥小體過度激活可通過依賴caspase-1的分子途徑使IL-1β和IL-18大量釋放，并激活復(fù)雜的下游信號通路，引發(fā)一連串炎癥放大反應(yīng)，在多種炎癥相關(guān)性疾病中發(fā)揮極其重要的作用[6,7]。除了常見的病原體外，溫石棉、二氧化硅等礦物粉塵也可活化NLRP3炎癥小體，與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。PM2.5是以礦物顆粒為主要成分的復(fù)雜大氣污染物，是否可活化NLRP3炎癥小體引起并促進機體炎癥反應(yīng)尚不明確。最新研究表明，細胞自噬對NLRP3炎癥小體活化有一定的調(diào)控作用。自噬是機體重要的代謝過程，主要依靠清除老化的蛋白質(zhì)和受損的細胞器等維持細胞自穩(wěn)，參與細胞的多種應(yīng)激反應(yīng)如炎癥反應(yīng)，但自噬參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的分子機制尚未闡明[9,10]。NLRP3炎癥小體作為系列炎癥反應(yīng)的主要部分，自噬對NLRP3炎癥小體活化機制的研究可能成為PM2.5導(dǎo)致的炎癥性疾病防治的新靶點。因此，本研究以人支氣管上皮細胞為研究對象，在體外探討細胞自噬對PM2.5誘導(dǎo)的支氣管炎癥反應(yīng)的潛在影響機制，對PM2.5相關(guān)性炎癥疾病的預(yù)防和治療提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)；磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)、胰蛋白酶消化液、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素、噻唑藍(Methylthiazolyldi-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)、二甲基亞砜(碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-1β、IL-18炎癥因子檢測試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；兔抗LC3、Beclin1、NLRP3、caspase-1和GAPDH抗體(美國Abcam公司)；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；Lipofectamine 2000 (美國Thermo Fisher Scientific )；引物合成(上海杰李生物技術(shù)有限公司)；Real time PCR Master Mix(SYBR Green)(日本 ToYoBo QPR-201)。倒置相差熒光顯微鏡(Axio Observer A1，德國Zeiss公司)，紫外分光光度計(BioTek PowerWave XS2，美國BioTek公司)，熒光定量PCR儀器(7500 Fast，ABI)，Western 電泳儀(美國Bio-Rad，164-5051)，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國 Bio-Rad 170-4150)。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及PM2.5粉塵染毒母液配置 人支氣管上皮細胞(16HBE)購自上海子實生物科技有限公司，采用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基，在恒定溫度(37℃)和合適濕度的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

PM2.5組分因地域的不同而差異巨大，本實驗選取河北石家莊某地區(qū)PM2.5為研究對象。PM2.5樣本由西南科技大學(xué)研究人員采集、洗脫后使用臥式行星球磨機(轉(zhuǎn)速400 r/min)于乙醇中研磨8 h，再經(jīng)烘干后所得。因此，本實驗中所使用的PM2.5是自然環(huán)境中PM2.5的主要有形礦物成分，不包含少量負載的細菌、病毒和有機成分等。采用X射線衍射儀對樣本的主要物相分析結(jié)果為：PM2.5樣本中主要成分為石英，另含少量方解石和鈉長石。利用高溫高壓蒸汽滅菌法制得無菌粉塵，使用無血清培養(yǎng)基配制成 1 000 μg/ml 的母液于-20℃保存?zhèn)溆?，使用前?jīng)超聲振蕩30 min。

1.2 方法

1.2.1 MTT實驗測定細胞存活率 將處于對數(shù)穩(wěn)定增長期的16HBE細胞以每孔200 μl接種于96孔板中。待細胞密度約為80%時，把配制好的一系列濃度的PM2.5粉塵懸液(12.5、25、50、100、200、400 μg/ml)加入96孔板中，每孔200 μl。在共同孵育到特定時間點(12、24和48 h)時分別向各孔中加入MTT(5 mg/ml)試劑10 μl，繼續(xù)避光孵育4 h。輕輕棄掉上清液，向孔板中加入二甲基亞砜200 μl/孔，避光、室溫振蕩待結(jié)晶全部溶解后用分光光度計(490 nm)測定吸光度值(A)。每個實驗濃度設(shè)置6個平行孔。對照組：細胞無任何處理；PM2.5對照組：不接種細胞，只加入PM2.5粉塵懸液。根據(jù)吸光度值采用以下計算方式得出細胞相對存活率。細胞相對存活率(%)=[(A實驗組-A PM2.5對照組)/A對照組]×100%。

1.2.2 ELISA法檢測細胞炎癥因子的表達 將濃度為1×105個/ml的細胞懸液以每孔2 ml接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為陰性對照組(不加任何刺激物，conrtol組)，PM2.5對照組(加目的濃度PM2.5粉塵懸液，PM2.5組)，空白質(zhì)粒對照組(只轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒而不加任何刺激物，NC組)，ATG7干擾表達對照組(siATG7組)和實驗組(目的濃度PM2.5粉塵懸液染毒siATG7細胞，PM2.5+siATG7)。待細胞密度為80%左右時棄上清，向PM2.5對照組和實驗組孔板中加入100 μg/ml的PM2.5懸液2 ml培養(yǎng)24 h。染毒結(jié)束后收集細胞上清液，用ELISA法按照相應(yīng)試劑盒操作說明書通過酶標儀測定各孔的吸光度值，參照標準曲線計算出上清液中IL-1β、IL-18的濃度。每個實驗組設(shè)3個平行孔。

1.2.3 RT-PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染后ATG7表達 接種16HBE細胞于6孔板中，在恒溫、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)到細胞融合度為30%～60%。實驗分組如下：陰性對照組，NC組和siATG7組。稀釋ATG7 siRNA和Lipo2000：將250 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基分別加入到5 μl濃度為20 μmol/L siRNA貯存液和5 μl lipo2000中，分別混勻后室溫放置5 min；將稀釋的ATG7 siRNA和Lipo2000混勻后室溫孵育20 min；把ATG7 siRNA-lipo2000 混合液加入到細胞密度約為30%～60%培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。棄上清，PBS漂洗3次后分別向每孔中加入100 μg/ml的PM2.5懸液2 ml，共同孵育24 h后收集細胞。按照試劑盒使用說明書，收集提取細胞總RNA，用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀檢測ATG7的mRNA的表達。ATG7引物序列為：(上游引物5′-AGCGGCGGCAAGAA-ATAATG-3′；下游引物5′-AACCCAACATCCAAGG-CACT-3′)。PCR擴增結(jié)果用Ct值來表示，目的基因的相對表達率采用2-ΔΔCt方法計算。

1.2.4 Western blot檢測蛋白水平 16HBE細胞于6孔板中貼壁長至70%時，向各個實驗組加入2 ml濃度為50、100、200 μg/ml的PM2.5懸液，用于檢測Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的蛋白表達水平；向siATG7組和PM2.5+siATG7組加入2 ml濃度100 μg/ml 的PM2.5懸液，共同孵育24 h。消化、收集細胞，提取各實驗組總蛋白，根據(jù)BCA法測定各組蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉封閉1.5 h，再分別在4℃的環(huán)境中孵育兔抗Beclin-1抗體(1∶500)、兔抗LC3抗體(1∶1 000)、兔抗NLRP3抗體(1∶500)、兔抗caspase-1(1∶1 000)抗體和兔抗GAPDH抗體(1∶1 000)，孵育12 h，洗膜后和由辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)共同孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色，并進行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL整理后使用SPSS27.0進行數(shù)據(jù)處理和分析。根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點采用t檢驗、單因素方差分析或LSD檢驗進行組間、組內(nèi)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對16HBE細胞存活率的影響 不同濃度PM2.5染毒16HBE細胞12、24和48 h后，實驗結(jié)果如圖1所示。與對照組(0 μg/ml)相比，細胞存活率隨著PM2.5染毒濃度的增高和染毒時間的延長而降低；除12.5 μg/ml染毒16HBE細胞12 h時細胞存活率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P> 0.05)，其他濃度組細胞存活率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。當(dāng)PM2.5濃度為 400 μg/ml時，染毒12、24、48 h后存活率分別為(63.14±3.8)%，(52.83±2.1)%，(40.92±5.5)%。染毒24 h 時，PM2.5粉塵對16HBE細胞的半數(shù)抑制濃度為227.3 μg/ml。

2.2 PM2.5誘導(dǎo)16HBE細胞自噬相關(guān)蛋白的表達 PM2.5分別以50、100和200 μg/ml的濃度染毒16HBE細胞24 h后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達水平如圖2所示。與對照組(0 μg/ml)相比，隨著PM2.5染毒濃度的增加，Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平逐漸升高，LC3-Ⅰ蛋白表達水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)PM2.5濃度為200 μg/ml時， 三種蛋白表達水平與對照組相比差異最大，Beclin1和LC3-Ⅱ 蛋白表達水平分別增高3.4倍和5.375倍，LC3-Ⅰ 蛋白表達水平降低52.83%；當(dāng)PM2.5濃度為50 μg/ml、100 μg/ml的實驗組相比較，Beclin1、LC3-Ⅰ 和LC3-Ⅱ 的蛋白表達水平無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同濃度PM2.5染毒16HBE細胞不同時間后的細胞存活率Fig.1 Cell viability of 16HBE cells exposed to different concentrations of PM2.5 for different timesNote: *.P<0.05,**.P<0.01，compared with control group (0 μg/ml).

2.3 轉(zhuǎn)染ATG7 siRNA后對染毒組16HBE細胞自噬水平的影響 ATG7 siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細胞24 h后，采用RT-PCR檢測ATG mRNA的表達。結(jié)果顯示，siATG7組ATG7的 mRNA相對表達水平顯著低于NC組和陰性對照組(P<0.01)，而NC組和陰性對照組相比無明顯變化，表明siATG7能有效降低細胞ATG7的表達水平。siATG7細胞和正常無處理細胞分別與100 μg/ml PM2.5粉塵懸液共同孵育24 h后，PM2.5+siATG7實驗組自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達水平與PM2.5組相比降低44.64%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。以上結(jié)果說明siATG7能夠明顯降低PM2.5誘導(dǎo)的細胞自噬水平。

圖2 不同濃度PM2.5染毒16HBE細胞24 h后自噬相關(guān)蛋白的表達Fig.2 Expression of autophagy-related proteins after exposure to different concentrations of PM2.5 for 24 h in 16HBE cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with control group (0 μg/ml).

圖3 siATG7降低PM2.5誘導(dǎo)16HBE細胞的自噬水平Fig.3 siATG7 reduced PM2.5-induced autophagy levels in 16HBE cellsNote: a.P<0.01,compared with control group；b.P<0.01,compared with NC group；c.P<0.01,compared with siATG7 group；**.P<0.01,PM2.5 group compared with PM2.5+siATG7 group.

2.4 抑制細胞自噬對PM2.5誘導(dǎo)16HBE細胞NLRP3和caspase-1蛋白表達的影響 100 μg/ml PM2.5粉塵懸液染毒16HBE細胞24 h后，NLRP3和caspase-1蛋白表達如圖4所示。PM2.5組中NLRP3和caspase-1蛋白表達水平分別為0.27±0.01和0.39±0.05，與陰性對照組相比顯著升高(P<0.01)；而NC組和siATG7組的蛋白表達水平較陰性對照組無顯著差異。表明PM2.5可活化NLRP3炎癥小體，并激活了下游caspase-1蛋白。與PM2.5實驗組相比，PM2.5+siATG7組NLRP3和caspase-1蛋白表達水平分別降低44.44%和51.28%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。以上實驗顯示，抑制PM2.5誘導(dǎo)的細胞自噬可降低NLRP3炎癥小體活化的水平。

圖4 抑制細胞自噬后對PM2.5誘導(dǎo)NLRP3和caspase-1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of inhibition of autophagy on expression of NLRP3 and caspase-1 induced by PM2.5Note: a.P<0.01,compared with control group；b.P<0.01,compared with NC group；c.P<0.01,compared with siATG7 group；**.P<0.01,PM2.5 group compared with PM2.5+siATG7 group.

圖5 抑制細胞自噬后對炎癥因子IL-1β和IL-18表達的影響Fig.5 Effects of inhibition of autophagy on expression of inflammatory factors IL-1β and IL-18Note: a.P<0.01,compared with control group；b.P<0.01,compared with NC group；c.P<0.01,compared with siATG7 group；**.P<0.01,PM2.5 group compared with PM2.5+siATG7 group.

2.5 抑制細胞自噬對PM2.5誘導(dǎo)16HBE細胞炎癥因子表達的影響 100 μg/ml PM2.5染毒16HBE細胞24 h后細胞上清液中炎癥因子IL-1β和IL-18的含量如圖5所示。與陰性對照組相比，PM2.5實驗組中IL-1β和IL-18的含量分別增高166 pg/ml和453 pg/ml，siATG7組和NC組中的含量無明顯變化。與PM2.5實驗組相比，PM2.5+siATG7組的IL-1β和IL-18的分泌分別降低70 pg/ml和242 pg/ml，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此降低PM2.5誘導(dǎo)的自噬可顯著減少細胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。

3 討論

NLRP3炎癥復(fù)合體是NLRP炎癥小體家族的核心，不僅可識別病毒、寄生蟲和細菌等外源性病原體，還可被內(nèi)源性刺激物(如脂多糖、膽固醇結(jié)晶、尿酸結(jié)晶、 β-淀粉樣蛋白和氧化低密度脂蛋白等)激活，招募并激活下游蛋白caspase-1，促進IL-1β和IL-18的成熟和釋放[11-13]。研究報道，PM2.5暴露導(dǎo)致機體的炎癥反應(yīng)和免疫毒性是PM2.5重要的致病機制之一，炎癥反應(yīng)在疾病的進展中有著重要影響[8,14]。自噬對炎癥具有調(diào)控功能，PM2.5誘導(dǎo)的細胞自噬對炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制還有待進一步探索。

細胞自噬是一種依賴溶酶體的選擇性降解方式，在真核細胞中普遍存在，可選擇性降解受損的細胞器、蛋白質(zhì)以及外來入侵物來維持細胞穩(wěn)態(tài)。Beclin1和LC3等自噬相關(guān)蛋白在自噬發(fā)生的不同階段扮演著重要角色。LC3是存在于自噬體膜上的特征性蛋白，具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在狀態(tài)。當(dāng)自噬體形成后，均勻分布在胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ經(jīng)過一系列復(fù)雜過程轉(zhuǎn)化成 LC3-Ⅱ；LC3-Ⅱ蛋白性質(zhì)穩(wěn)定并和自噬體膜結(jié)合緊密，因此LC3-Ⅱ蛋白表達水平的高低可用來反映自噬體的數(shù)量和自噬程度[15]。本實驗中，不同濃度PM2.5染毒16HBE細胞后，隨著PM2.5染毒濃度的增加，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表達水平逐漸升高，LC3-Ⅰ蛋白表達水平逐漸降低；Deng等研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露可導(dǎo)致LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin1表達增加，且LC3-Ⅱ的表達量存在時間和濃度依賴性效應(yīng)，從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生[16]。此外，納米石英粉塵、溫石棉及大氣顆粒物被證明均能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，這些研究結(jié)果與本實驗的結(jié)果相一致。另有實驗表明，PM2.5暴露可引起并加重氣道炎癥，并伴隨細胞自噬水平的升高和中性粒細胞百分比的增加，而自噬水平與氣道炎癥嚴重程度密切相關(guān)，提示細胞自噬也可能參與調(diào)控PM2.5引起的炎癥反應(yīng)[17]。

支氣管上皮細胞是覆蓋于氣管表面的主要細胞，不僅可作為生理屏障保護支氣管，還可參與氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑。本實驗采用16HBE體外建立PM2.5暴露細胞模型，與對照組相比，細胞培養(yǎng)液中的IL-1β和IL-18的含量明顯升高，且NLRP3和caspase-1蛋白表達水平增加。表明PM2.5激活了支氣管上皮細胞中的NLRP3炎癥小體，通過caspase-1途徑促進了炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放。仝國輝等[18]通過體內(nèi)PM2.5單次染毒和3次染毒小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織IL-1β的含量和NLRP3 mRNA的表達量明顯升高。還有研究表明，PM2.5暴露的小鼠鼻灌洗液中Eotaxin、IL-5和嗜酸性粒細胞都升高，導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)[19]。

自噬是把雙刃劍，在不同的感染及免疫性疾病中自噬所起的作用有所不同。研究證實，適度自噬可減輕炎癥反應(yīng)來促進細胞穩(wěn)態(tài)恢復(fù)；過度自噬就會激活如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NLRP3炎癥小體和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的等信號通路引發(fā)炎癥損傷[20,21]。Nakahira等[22]研究表明，自噬缺陷小鼠血清IL-1β和IL-18水平顯著增高，同時活性氧的水平和NLRP3蛋白表達水平增高。本實驗中，通過siATG7降低自噬相關(guān)蛋白ATG7的表達，使自噬囊泡形成障礙，抑制PM2.5誘導(dǎo)的細胞自噬。降低細胞自噬水平能夠顯著抑制PM2.5誘導(dǎo)的16HBE細胞中NLRP3和caspase-1蛋白的表達，顯著減少細胞上清液中IL-1β和IL-18的分泌量。提示細胞自噬可參與PM2.5介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化而加重機體炎癥反應(yīng)。這可能是因為PM2.5使細胞發(fā)生過度的自噬反應(yīng)，消耗過多的線粒體自噬轉(zhuǎn)換蛋白P62。P62是細胞內(nèi)維持線粒體自噬的必要蛋白，不足的P62會導(dǎo)致功能受損的線粒體無法通過自噬而及時清除，使活性氧過度積累誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化，促進炎癥因子的成熟和釋放[23,24]。但具體活化機制還有待進一步研究。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明，抑制細胞自噬可明顯減輕PM2.5誘導(dǎo)的支氣管上皮細胞的炎癥反應(yīng)。其機制可能是PM2.5使細胞發(fā)生自噬紊亂，過度的細胞自噬可參與活化NLRP3炎癥小體，促進IL-1β和IL-18的分泌，導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)。