許倩倩，包貝華，張 麗**，趙學龍，談瑄忠，李 文南京中醫(yī)藥大學，南京 003；南京市中醫(yī)院，南京 000

烏蘞莓 Cayratia japonica（Thunb.） Gagnep 為雙子葉葡萄科植物，藥用部位為烏蘞莓的全草或根，主要功效為清熱利濕、解毒消腫[1]。研究報道，烏蘞莓對肛周膿腫、急性扭挫傷、痛風性關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎等病癥具有較好的臨床治療效果[2，3]。現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗癌、抗菌、抗凝、增強免疫功能、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛[3，4]等作用。烏蘞莓中主要含有黃酮類的成分，如木犀草素、芹菜素、槲皮素等[5]。研究表明，木犀草素具有抗炎[6]、抗癌[7]、抗氧化[8]、抗菌[9]等藥理作用，與烏蘞莓的臨床作用相契合。

烏蘞莓軟膏為烏蘞莓單味藥方，其臨床藥效明確，現(xiàn)有的軟膏制備工藝為飲片機械取粉，加入基質(zhì)制備而得。此法藥物利用度低，為提高利用率對烏蘞莓原料進行醇提工藝研究，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken Design（BBD）響應面法設(shè)計優(yōu)化試驗[10]，以醇提干浸膏得率和木犀草素含量為指標，采用綜合評分法，優(yōu)選烏蘞莓軟膏原料的最佳醇提工藝，為其優(yōu)化制備與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜儀 （日本島津公司）；電子天平（Mettler Toledo）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A）；減壓干燥箱（XMTD-8222）上海精宏實驗設(shè)備有限公司；超聲清洗器 （KH-500B，功率500W，頻率40Hz，昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)。

1.2 藥品與試劑

烏蘞莓飲片購自安徽亳州（20170214），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學吳啟南教授鑒定確認；木犀草素對照品（純度99.6%，批號111520-201605，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；超純水。

2 方 法

2.1 樣品提取

取烏蘞莓飲片以粉碎機粉碎，過篩，得最粗粉。取一定量的粉末，置于具塞錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，加熱回流提取2次，過濾，合并濾液并定容。取提取液20mL，干燥，恒重，計算干浸膏得率。

2.2 色譜條件[11]

色譜柱：Agilent 5 HC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2%甲酸水（60∶40）；檢測波長：360nm；柱溫：30℃；流速：0.8mL·min-1；進樣量：10μL。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取木犀草素對照品適量，置于100mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，配制成0.009 7mg·mL-1對照品溶液。

2.4 單因素試驗

2.4.1 乙醇濃度 稱取烏蘞莓飲片粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，加8倍量乙醇，提取1 h、共2次，在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%條件下進行考察。計算干浸膏得率，HPLC法測定木犀草素的提取含量，平行2份。下同。

2.4.2 醇倍量 稱取烏蘞莓飲片粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，加70%乙醇8倍量，提取1 h，共2次，分別在加醇量為 6、8、10、12、14倍條件下進行考察。

2.4.3 提取時間 稱取烏蘞莓飲片粉末5 g，置于具塞錐形瓶中，加8倍量70%乙醇，提取2次，分別在提取時間為1、2、3h條件下進行考察。

2.5 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、醇倍量和提取時間三個因素，采用Design-Expert.V8.0.6軟件對這三個因素分別在3個水平上對其提取參數(shù)進行優(yōu)化，以干浸膏得率和木犀草素含量為指標，并根據(jù)以下方法計算兩個指標的綜合評分值[12]：2個指標分別以最高值為1，其余各組以其與最高值比值為得分，綜合得分：Z=X×0.5+Y×0.5（X 為各組干浸膏得率的得分，Y為各組木犀草素含量的得分）。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果與分析

3.1.1 乙醇濃度對干浸膏得率和木犀草素含量的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，木犀草素含量逐漸增加，而干浸膏得率在乙醇濃度為70%時達到最高值。綜合考慮確定BBD實驗設(shè)計乙醇濃度的水平為60%、70%、80%。

圖1 乙醇濃度對干浸膏得率、木犀草素含量的影響

3.1.2 醇倍量對干浸膏得率和木犀草素含量的影響 由圖2可知，在醇倍量逐漸增加，其干浸膏得率也逐漸增加；當醇倍量為10～12倍時，木犀草素含量達到高值。結(jié)合實驗結(jié)果并從大生產(chǎn)工藝考慮，確定BBD實驗設(shè)計的醇倍量水平為8、10、12倍。

圖2 醇倍量對干浸膏得率、木犀草素含量的影響

3.1.3 提取時間對干浸膏得率和木犀草素含量的影響 由圖3可知，隨著提取時間增加，干浸膏得率及木犀草素含量均逐漸增加，故確定BBD實驗設(shè)計提取時間的水平為 1、2、3 h。

圖3 提取時間對干浸膏得率、木犀草素含量的影響

3.2 響應面法優(yōu)化烏蘞莓醇提工藝

3.2.1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken設(shè)計出三因素三水平共17個試驗點的響應面試驗，其中12個析因點分別構(gòu)成三維頂點，5個零點為區(qū)域的中心點[13]，因素、水平及編碼值見表1；Box-Behnken試驗設(shè)計及響應值見表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計的因素和水平

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及響應值

3.2.2 響應面試驗數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert.V8.0.6軟件，以醇倍量A、提取時間B、乙醇濃度C為自變量，以雙指標綜合評分Y為響應值，對表2的數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到方差分析表3，對其數(shù)據(jù)進行多項式擬合，建立一個回歸方程：Y=+0.97+0.062A+0.015B-2.500E-003C+0.020AB+5.000E-003AC+0.030BC-0.035A2-0.040B2-0.066C2。方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果看出，該響應面回歸模型的 F 值為 21.34（P=0.000 3，P＜0.01），表明模型顯著，具有良好的擬合性。A、B、C三個因素的影響大小依次為 A＞B＞C，因素 A、A2、B2、C2及 BC 的交互作用對響應值的影響顯著，說明各因素與響應值之間并不是簡單的線性關(guān)系。該模型失擬項F值為1.79（P=0.289 0，P＞0.05），相關(guān)系數(shù) R2=0.964 8，表明建立的二次模型成立，該模型在本實驗研究范圍內(nèi)有統(tǒng)計學意義。

3.2.3 各因素及其交互作用對干浸膏得率和木犀草素含量的影響 利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行擬合，直觀了解各因素之間兩兩交互作用對烏蘞莓醇提工藝的影響。由圖4可知，提取時間、醇倍量、乙醇濃度3個因素的結(jié)果均呈先上升后下降的趨勢。其中醇倍量的降幅較小，僅略有降低。圖4中顯示了兩兩交互作用的影響結(jié)果，左邊均為等高線圖，不同因素之間的交互關(guān)系均為橢圓形，說明兩兩交互作用均較為顯著；右邊為三維曲面圖，均為山峰形，且曲面坡度均較為陡峭，同樣說明交互作用較為顯著，尤其B、C交互作用、即提取時間與乙醇濃度交互作用的曲面圖最為陡峭，說明交互作用較其他交互作用顯著。

圖4 各因素交互作用的等高線與響應面圖

3.2.4 提取工藝參數(shù)的驗證 根據(jù)軟件分析計算，烏蘞莓的最佳醇提工藝為：加醇量12倍，提取時間2.48 h，乙醇濃度71.29%，理論計算綜合評分為1.001 56；為方便實驗操作，將最佳工藝修正為：加醇量12倍，提取時間2.5 h，乙醇濃度70%。

稱取烏蘞莓飲片粉末5g，按照優(yōu)化的最佳醇提工藝提取，平行3份，得出干浸膏的得率分別為10.42%、10.44%、10.43%，平均得率為 10.43%；木犀草素含量分別為 0.32、0.32、0.32mg·g-1，平均含量為0.32mg·g-1；綜合得分為 0.98，與預測值的相對誤差為2.2%，證明了回歸模型較為準確可靠，優(yōu)化的醇提工藝具有可重復性和可操作性。

4 討 論

響應面法（response surface methodology，RSM）是一種綜合試驗設(shè)計和數(shù)學建模的優(yōu)化方法，可有效減少試驗次數(shù)，與正交試驗相比，響應面法可根據(jù)二次方程模型分別做出試驗因素間交互作用的等高線圖和三維立體響應曲面，使實驗結(jié)果更加直觀。BBD法是響應面優(yōu)化法常用的實驗設(shè)計方法之一，適用于2～5個因素的優(yōu)化，在因素相同時，BBD的實驗次數(shù)更少，更經(jīng)濟[12]。BBD設(shè)計法每個因素取3個水平，以-1、0、1編碼。其設(shè)計表安排以0為中心點，+1、-1分別是立方點相對應的高值和低值。BBD優(yōu)化求解出的最優(yōu)工藝水平值不會超出最高值范圍，對某些有特殊需要或安全要求的實驗尤為適用。

烏蘞莓軟膏在臨床長期應用于肛周膿腫、痛風性關(guān)節(jié)炎及其他消腫止痛抗炎疾病，但現(xiàn)有工藝采用直接打粉入藥的方式，處理工藝粗糙，使用舒適度較差，藥物利用度低，且衛(wèi)生學很難達標，反復滅菌又易致藥效成分不穩(wěn)定或損失，導致療效下降。本實驗對烏蘞莓粉末的醇提工藝進行研究，并采用BBD設(shè)計方法優(yōu)選烏蘞莓軟膏原料的最佳醇提工藝：加醇量12倍，提取時間2.5 h，乙醇濃度70%。希望通過優(yōu)化的提取方法改善以前工藝所存在的問題。

對烏蘞莓軟膏原料的醇提工藝進行優(yōu)選，改變其原打粉工藝，提高藥材的利用率，后期將進行藥效學研究、優(yōu)選軟膏劑的制劑工藝并對烏蘞莓軟膏的質(zhì)控標準進行研究，以期提高烏蘞莓軟膏的質(zhì)量。