魏朝治 裘紀(jì)瑩 陳蕾蕾 陳相艷 劉孝永 辛雪

摘要：研究具有生物轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷活性的惡味乳桿菌B2的益生特性和安全性。結(jié)果表明，該菌具有較好的β-葡萄糖苷酶活性和體外脫除膽固醇能力，對酸和人工模擬胃液的耐受性較好，而對膽鹽和人工模擬腸液的耐受性一般;同時該菌對10種常見抗生素不具有耐藥性，并且不攜帶耐藥基因，不具備硝酸鹽還原酶、氨基脫羧酶活性，不產(chǎn)生吲哚等有害代謝產(chǎn)物，因此該菌安全性較高。

關(guān)鍵詞：惡味乳桿菌B2;β-葡萄糖苷酶;益生特性;安全性;耐藥性

中圖分類號： TS201.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0162-04

收稿日期：2017-12-11

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（編號：CXGC2017B06）;山東省泰山學(xué)者工程項目;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計劃;山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金（編號：ZR2014YL020、ZR2016YL022）。

作者簡介：魏朝治（1992—），男，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：wczwcz0220@163.com。

通信作者：辛 雪，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail：jasmine811201@126.com。

乳酸菌（lactic acid bacteria，簡稱LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。這類細(xì)菌在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，是公認(rèn)的安全性菌株（generally recognized as safe，簡稱GRAS）。乳酸菌不僅可應(yīng)用于食品發(fā)酵行業(yè)，同時也能調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡等，與機(jī)體的生命活動息息相關(guān)[1]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些乳酸菌具有抗生素抗性，甚至有些菌株出現(xiàn)了多重耐藥性[2]。

惡味乳桿菌B2是從手工泡菜中篩選到的1株能夠生物轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷的優(yōu)良菌株，其培養(yǎng)條件簡單，易存活，產(chǎn)酸能力適中，口感較好，可用于活菌型功能性銀杏花粉產(chǎn)品的研制。但目前文獻(xiàn)報道缺乏關(guān)于惡味乳桿菌益生特性和安全性方面的研究。因此，本試驗(yàn)以自主分離的1株惡味乳桿菌B2為研究對象，以β-葡萄糖苷酶活性、降解膽固醇能力以及耐酸、耐膽鹽、耐模擬腸胃液能力和耐藥性、有害代謝產(chǎn)物分析等為手段，開展其益生特性和安全性評價，旨在為進(jìn)一步開發(fā)惡味乳桿菌資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 試驗(yàn)用菌株為惡味乳桿菌B2，是由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自手工泡菜中分離得到的1株能夠轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷的優(yōu)良菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 乳酸細(xì)菌（MRS）培養(yǎng)基[3]用于菌株活化、培養(yǎng)，MRS-膽固醇（MRS-CHOL）培養(yǎng)基[4]用于體外降解膽固醇試驗(yàn)，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，對硝基苯酚（p-NP）、對硝基苯基β-D-葡萄糖苷（p-NPG）、磷酸氫二鈉、檸檬酸等均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司生產(chǎn);SHP-150生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn);Mettler AE240電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn);UV-160型紫外可見分光光度計，日本島津公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化與培養(yǎng) 將菌株劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單菌落活化傳代2次，經(jīng)革蘭氏染色觀察為純菌后，接種于5 mL MRS液態(tài)培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶活性的測定[5] 粗酶液的制備：將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，沉淀用pH值為6.0的磷酸氫二 鈉- 檸檬酸緩沖液洗滌2遍，離心去上清，沉淀溶于相同緩沖液中，在0 ℃條件下超聲間歇粉碎15 min后，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，上清液為粗酶液。對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精準(zhǔn)稱取0.139 mg對硝基苯酚純品，溶解于1 mL甲醇溶液中，用pH值為6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容到 100 mL，再稀釋為5.0、12.5、25.5、37.5、50.0、75.0 μmol/L等濃度梯度溶液;取100 μL稀釋后的pNP溶液，加入100 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液，測定其在405 nm處的吸光度，繪制對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-葡萄糖苷酶活性的測定：將20 μL 25 mmol/L的p-NPG加入到80 μL的粗酶液中，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)，30 min 后加入100 μL濃度為 1 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定其在405 nm處的吸光度。根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算生成的對硝基苯酚濃度。一個β-葡萄糖苷酶活性單位（U）定義為在一定的反應(yīng)條件下，每分鐘分解對硝基苯基β-D-葡萄糖苷底物生成1 μmol對硝基苯酚（p-NP）所需要的β-葡萄糖苷酶量。計算公式如下：

U=pNP濃度×反應(yīng)總體積反應(yīng)時間×酶液體積×稀釋倍數(shù)。

1.2.3 體外降解膽固醇能力試驗(yàn) 惡味乳桿菌B2體外降解膽固醇能力的測定參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。膽固醇工作液的配制：量取一定量的膽固醇配制膽固醇貯存液，并進(jìn)一步稀釋，使膽固醇工作液的終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取膽固醇工作液和鐵銨顯色劑各2.5 mL振蕩搖勻后，冷卻至室溫，以冰乙酸加顯色劑為空白對照，于560 nm處測定吸光度，以D560 nm為縱坐標(biāo)，膽固醇含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。膽固醇含量的測定采用硫酸鐵銨法。在MRS-膽固醇（MRS-CHOL）液體培養(yǎng)基中接入1%（體積比）的乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，離心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），獲取上清液;用5 mL去離子水洗滌菌體沉淀（2次），離心（8 000 r/min、4 ℃、10 min），獲得沉淀洗滌液;分別取上清液和沉淀洗滌液0.3 mL于離心管中，加入3.7 mL冰乙酸充分混勻，13 000 r/min離心 5 min;取上清液2.5 mL于試管中，沿管壁緩緩加入2.5 mL鐵銨顯色液，室溫靜置 20 min，然后充分振蕩搖勻，測定D560 nm。以未接種乳酸菌的MRS-CHOL培養(yǎng)基代替發(fā)酵液為空白。膽固醇的降解率按以下公式計算：

膽固醇的降解率=D空白-D樣品D空白×100%。

1.2.4 耐酸、耐膽鹽和耐模擬胃腸液試驗(yàn) 參照高盛等的方法[6-7]測定惡味乳桿菌B2的耐酸、耐膽鹽、耐模擬胃腸液能力。耐酸試驗(yàn)：將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，沉淀用0.85%生理鹽水洗滌2遍，離心去上清，沉淀重懸于等體積生理鹽水中，制成菌懸液。分別將上述菌懸液接種于pH值為1.5、2.5、3.5、4.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)0、2、4、6 h，培養(yǎng)后取一定量梯度稀釋涂布于MRS平板，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后活菌計數(shù)，每個稀釋度作3個平行。耐膽鹽試驗(yàn)：將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，沉淀用0.85%生理鹽水洗滌2遍，離心去上清，沉淀重懸于等體積生理鹽水中，制成菌懸液。分別將上述菌懸液接種于含不同濃度牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基（牛膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%）中，37 ℃條件下培養(yǎng)0、2、4、6 h，培養(yǎng)后取一定量梯度稀釋涂布于MRS平板，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h后活菌計數(shù)，每個稀釋度作3個平行。耐模擬胃腸液試驗(yàn)：將胃蛋白酶過濾除菌，加入到滅菌的0.5% NaCl溶液中，胃蛋白酶終濃度為3 g/L，分別調(diào)節(jié)溶液pH值至1.5、2.5、3.5，即為供試的人工胃液;將胰蛋白酶和牛膽鹽過濾除菌，加入到滅菌的0.5% NaCl溶液中，胰蛋白酶和牛膽鹽終濃度均為 1 g/L，調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，即為人工腸液;將發(fā)酵液在8 000 r/min條件下離心20 min，棄上清，沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中，加入等體積的人工胃液或人工腸液，37 ℃ 條件下培養(yǎng)0、2、4、6 h，培養(yǎng)后取一定量梯度稀釋涂布于MRS平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后活菌計數(shù)，每個稀釋度作3個平行。

1.2.5 耐藥性評價 藥敏試驗(yàn)：采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[8]。將100 μL待測菌液均勻涂布于MRS固體平板上，待菌液被完全吸收后放置藥敏紙片。供試藥敏紙片：購自杭州微生物試劑有限公司，紙片上附有抗生素分別為青霉素、萬古霉素、慶大霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、阿莫西林、諾氟沙星、卡那霉素。質(zhì)粒提取試驗(yàn)：取5 mL待測菌液，使用OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒;取提取好的質(zhì)粒液體5 μL加入1 μL 6×Loading buffer，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳液為1×TAE溶液，電壓為100 V，運(yùn)行 30 min，電泳結(jié)束后，置于254 nm紫外燈下觀察。

1.2.6 有害代謝產(chǎn)物試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)：將菌液以2%（體積比）接種量接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，滴加吲哚試劑，觀測顏色變化情況，以不接菌液的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對照，試驗(yàn)作3次平行。硝酸鹽還原酶試驗(yàn)：將菌液以2%（體積比）接種量接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，滴加碘化鉀溶液和淀粉溶液，觀察顏色變化情況，以不接菌液的硝酸鹽培養(yǎng)基為空白對照，試驗(yàn)作3次平行。氨基脫羧酶活性檢測：將菌株劃線于添加前體氨基酸（L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸）的脫羧酶篩選平板上，以未添加前體氨基酸的脫羧酶篩選平板為對照，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，試驗(yàn)作3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 惡味乳桿菌B2的β-葡萄糖苷酶活性

β-葡萄糖苷酶又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，釋放 β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。研究顯示，β-葡萄糖苷酶在生物轉(zhuǎn)化黃酮苷中有重要應(yīng)用，同時，很多生物轉(zhuǎn)化黃酮苷優(yōu)良菌株具有分泌β-葡萄糖苷酶能力[9-11]。惡味乳桿菌B2能夠高效轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷，因此檢測其β-葡萄糖苷酶活性，可為轉(zhuǎn)化機(jī)制研究提供參考。

2.1.1 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 以p-NP濃度為橫坐標(biāo)，D405 nm為縱坐標(biāo)，取3次測量的平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.010 9x+0.002 4，r2=0.999。

2.1.2 β-葡萄糖苷酶活性 惡味乳桿菌B2粗酶液經(jīng)3次平行試驗(yàn)后，測得的D405 nm值為0.283±0.002 7。將數(shù)據(jù)代入p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算得到，生成的對硝基苯酚濃度為（25.74±0.01） μmol/L。通過計算得到惡味乳桿菌B2的β-葡萄糖苷酶活性為16.09 U。

2.2 惡味乳桿菌B2的耐酸、耐膽鹽和耐模擬胃腸液能力

2.2.1 耐酸能力 人體胃液中胃酸的pH值一般在1.5～3.5 之間[7]。從圖2可以看出，惡味乳桿菌B2在pH值為35時表現(xiàn)出良好的酸耐受性，6 h內(nèi)活菌數(shù)無明顯變化;在pH值為2.5時，每隔2 h，活菌數(shù)下降2個數(shù)量級，6 h后活菌數(shù)下降了6個數(shù)量級;當(dāng)pH值為1.5時，2 h后活菌數(shù)下降了6個數(shù)量級，4 h后已無活菌檢出。說明該菌對酸的耐受性較好，在酸性環(huán)境下仍可存活較長時間并保持生長。

2.2.2 耐膽鹽能力 小腸中膽鹽濃度一般為0.1%～0.3%腸內(nèi)容物[12]。從圖3可以看出，惡味乳桿菌B2在膽鹽濃度為0.1%時表現(xiàn)出較好的耐受性，6 h內(nèi)活菌數(shù)與不加膽鹽相比無明顯差異;在膽鹽濃度為0.2%時，2 h后活菌數(shù)下降了3個數(shù)量級，6 h后無活菌檢出;在膽鹽濃度為0.3%時，2 h后無活菌數(shù)檢出。說明惡味乳桿菌B2的膽鹽耐受性一般，當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到0.3%時，該菌無法存活。

2.2.3 耐模擬胃腸液能力 胃液中含有胃蛋白酶和胃酸，所以胃液是一個富含蛋白酶并且低pH值的環(huán)境。人體攝入食物后，胃液的pH值會隨著胃酸的分泌和消耗在1.5～3.5之間波動。腸液里不僅富含胰蛋白酶和膽鹽，而且還是一個微堿環(huán)境。胃腸液中存在的酶、膽鹽以及酸堿環(huán)境對乳酸菌生長都有抑制作用。從圖4可以看出，在pH值為3.5的人工模擬胃液中，活菌數(shù)在6 h內(nèi)沒有明顯變化，都保持在同一數(shù)量級。在pH值為2.5的人工模擬胃液中，6 h后活菌數(shù)下降了5個數(shù)量級。在pH值為1.5的人工模擬胃液中，4 h后已無活菌檢出。而在pH值為8.0的人工模擬腸液中，活菌數(shù)呈現(xiàn)明顯下降趨勢，6 h后活菌數(shù)下降了6個數(shù)量級?？梢姡瑦何度闂U菌B2對人工模擬胃液具有較好的耐受性，但對人工模擬腸液的耐受性一般。

2.3 惡味乳桿菌B2的降膽固醇能力

2.3.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線 以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)吸光度（D560 nm）為縱坐標(biāo)，取3次測量的平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖5，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.000 9x-0.002 8，r2=0994。

2.3.2 體外降膽固醇能力 根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算惡味乳桿菌B2在MRS-CHOL培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后上清液以及沉淀洗滌液中的膽固醇含量。從表1可以看出，惡味乳桿菌B2培養(yǎng)24 h后對膽固醇的脫除率達(dá)到40.24%，具有較好的體外降膽固醇能力。但沉淀洗滌液中膽固醇含量較低，表明大量的膽固醇可能被乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)至菌株體內(nèi)，說明該菌株對膽固醇的清除能力主要依靠的是菌體吸收作用[13-14]。

2.4 惡味乳桿菌B2的耐藥性

惡味乳桿菌B2的耐藥性評價結(jié)果見表2。10種抗生素對惡味乳桿菌B2的的抑菌圈直徑均≥15 mm，抑菌效果比較明顯，因此認(rèn)為惡味乳桿菌B2不具有耐藥性。此外，質(zhì)粒提取試驗(yàn)結(jié)果顯示，惡味乳桿菌B2不含有質(zhì)粒，因此該菌株不攜帶耐藥基因。

2.5 惡味乳桿菌B2的有害代謝產(chǎn)物

色氨酸是人體必需氨基酸，如果菌株分解色氨酸生成吲哚，會引起人體代謝的紊亂。硝酸鹽還原酶可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，人體攝入過多亞硝酸鹽易引起中毒，同時在胃酸的條件下，亞硝酸鹽易與胺類物質(zhì)反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺。氨基脫羧酶可以將氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺，若菌株含有氨基脫羧酶，則可以將L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-賴氨酸分別轉(zhuǎn)化為腐胺、精胺、亞精胺、尸胺。過量的生物胺會使人出現(xiàn)惡心、腹痛等食物中毒癥狀[8，15]。由表3可知，惡味乳桿菌B2不產(chǎn)生吲哚，無硝酸鹽還原酶活性，因此不能還原硝酸鹽生成亞硝酸鹽。同時，惡味乳桿菌B2無氨基脫羧酶活性，不能以

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果顯示，惡味乳桿菌B2的β-葡萄糖苷酶活性較高，因此可降解銀杏花粉黃酮苷中的β-葡萄糖苷鍵，釋放出主要黃酮苷元山奈酚。β-葡萄糖苷酶的活性測定為惡味乳桿菌B2生物轉(zhuǎn)化銀杏花粉黃酮苷的機(jī)制研究提供依據(jù)。益生特性研究結(jié)果表明，惡味乳桿菌B2具有良好的體外脫除膽固醇能力，對酸和人工模擬胃液的耐受性較好，而對膽鹽和人工模擬腸液的耐受性一般，說明惡味乳桿菌B2可能具有良好的通過胃的能力，但在小腸中的存活性一般。總體來說，惡味乳酸菌B2擁有一定的消化道通過能力，可在消化道存活并行使生理功能。安全性研究結(jié)果顯示，該菌對10種常見抗生素不具有耐藥性，并且不攜帶耐藥基因，同時不具備硝酸鹽還原酶活性和氨基脫羧酶，不生成亞硝酸鹽、亞硝胺、腐胺、精胺和亞精胺、尸胺等有害成分，不分解色氨酸生成吲哚，安全性較高。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊 埔，孔文濤，孫芝蘭，等. 食源性乳酸菌安全性的評價[J]. 食品科學(xué)，2014，35（19）：169-173.

[2]孟祥晨，杜 鵬，李艾黎，等. 乳酸菌與乳品發(fā)酵劑[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009.

[3]徐瓏倩，胡凱弟，張艾青，等. 植物乳桿菌P158產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)，2017，38（22）：109-116.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膽固醇的測定：GB 5009.128—2016[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[5]金艷娓. 重組高溫β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及協(xié)同作用研究[D]. 長春：吉林大學(xué)，2013.

[6]高 盛，喬 宇，張宇微，等. 人母乳源乳酸菌的篩選、鑒定及益生活性的初步研究[J]. 食品工業(yè)科技，2017，38（10）：205-210.

[7]Huang Y，Adams M C. In vitro assessment of the upper gastrointestinal tolerance of potential probiotic dairy propionibacteria[J]. International Journal of Food Microbiology，2004，91（3）：253-260.

[8]顧旭峰，艾連中，宋 馨，等. 兩株干酪乳桿菌的安全性評價[J]. 食品與發(fā)酵科技，2015，51（2）：63-65.

[9]王銳麗，孫 偉，薛業(yè)敏. 嗜熱菌β-葡萄糖苷酶A基因的克隆表達(dá)及轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷[J]. 中國釀造，2016，35（3）：114-119.

[10]賴劍峰，楊榮玲，劉學(xué)銘. 黃酮類化合物的生物轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（4）：95-98.

[11]張 琴，李艷賓，李 華. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶甘草內(nèi)生菌的篩選及對甘草黃酮轉(zhuǎn)化的研究[J]. 食品科學(xué)，2013，34（1）：194-198.

[12]甘 敏. 雙歧桿菌胞外多糖益生功能及機(jī)理的初步探究[D]. 南昌：南昌大學(xué)，2015.

[13]李雪萍，李建宏，李敏權(quán)，等. 漿水中降膽固醇乳酸菌的篩選及其功能特性[J]. 微生物學(xué)報，2015，55（8）：1001-1009.

[14]Dambekodi P C，Gilliland S E. Incorporation of cholesterol into the cellular membrane of Bifdobacterium longum[J]. Journal of Dairy Science，1998，81（7）：1818-1824.

[15]Hammerman C，Bin-Nun A，Kaplan M. Safety of probiotics：comparison of two popular strains[J]. British Medical Journal，2006，333（7576）：1006-1008.謝冬娣，韋燕佩，宋慕波，等. 咪鮮胺添加納米TiO2對淮山貯藏品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（5）：166-169.