呂爽 包蕊 劉俊頻 袁元 全雪麗 吳松權(quán)

摘要：為了解膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累規(guī)律，為膜莢黃芪的種植和采收提供理論依據(jù)，測(cè)定了自然環(huán)境條件下膜莢黃芪生長(zhǎng)中的生物量，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，土壤溫度和濕度，并分析了毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累變化規(guī)律?？傮w而言，隨著生物量的增加，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在葉中呈下降趨勢(shì)，在莖中呈上升趨勢(shì)，而在根中表現(xiàn)出先下降再上升的趨勢(shì)、且與土壤溫度和水分呈顯著負(fù)相關(guān)，病蟲害的發(fā)生則明顯降低了生物量和毛蕊異黃酮苷的積累。研究得出的結(jié)論是膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累具有組織特異性，其在地上部和地下部的含量受不同機(jī)制的調(diào)控，適當(dāng)?shù)牡蜏睾退置{迫有利于根中毛蕊異黃酮糖苷的積累。

關(guān)鍵詞：膜莢黃芪;毛蕊異黃酮葡萄糖苷;積累規(guī)律;病蟲害

中圖分類號(hào)：S567.23+9.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）05-0103-03

收稿日期：2018-06-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21462044、30860036）。

作者簡(jiǎn)介：呂 爽（1993—），女，吉林松原人，碩士研究生，研究方向?yàn)樘胤N植物資源。E-mail：893226771@qq.com。

通信作者：全雪麗，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘胤N植物資源，E-mail：qxl2000@aliyun.com;吳松權(quán)，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘胤N植物資源，E-mail：arswsq@ybu.edu.cn。

黃芪為豆科（Leguminosae）植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao]或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus （Fisch.）Bge.]的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、脫毒排膿的功效[1]。黃芪含有多種化學(xué)成分，主要有皂苷類、多糖類和異黃酮類等[2-3]。其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中主要的異黃酮類活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、清除超氧陰離子、保護(hù)肝細(xì)胞、增加缺血再灌注大鼠腦細(xì)胞中膜的流動(dòng)性[4]、預(yù)防骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)骨質(zhì)再生等作用[5]，并且對(duì)糖尿病腎病的發(fā)展也具有潛在的調(diào)控作用[6]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷是評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量的“標(biāo)記化合物”之一[1]。目前，普遍采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）來檢測(cè)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，此法具有準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)[1，7-8]。

黃芪是名貴中藥材，由于長(zhǎng)期大量采挖導(dǎo)致野生資源急劇減少，野生黃芪已被列為國(guó)家3級(jí)保護(hù)植物[9]。膜莢黃芪主產(chǎn)于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、河北、山西等地[3]?！端幬锍霎a(chǎn)辨》（1920年）記載：“正芪產(chǎn)區(qū)有3處：1關(guān)東，2寧古塔，3卜奎”，其中寧古塔為黑龍江省寧安和吉林省延吉一帶（延邊朝鮮族自治州，即延邊地區(qū)）。但在延邊地區(qū)這一優(yōu)質(zhì)的道地藥材由于野生資源被過度利用而不能滿足人們的需求，且人工栽培黃芪還不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的野生黃芪[10]。延邊地區(qū)位于吉林省長(zhǎng)白山麓，屬中溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，春季干燥多風(fēng)，夏季溫?zé)岫嘤?，秋季涼爽少雨，冬季寒冷漫長(zhǎng)。由于其獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，形成了復(fù)雜的植被類型和豐富的野生植物資源，特別適合發(fā)展中草藥產(chǎn)業(yè)[11-12]。本研究的目的是以膜莢黃芪為植物材料，研究自然生長(zhǎng)條件下根、莖和葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累規(guī)律，為延邊地區(qū)膜莢黃芪栽培和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

黃芪種子和植株采自吉林省延吉市，經(jīng)延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室石鐵源教授鑒定為膜莢黃芪。憑證標(biāo)本留存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室。

1.2 試劑和主要儀器

對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：110907）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%;色譜級(jí)乙腈購(gòu)于美國(guó)Fisher公司;色譜級(jí)甲醇購(gòu)于美國(guó)邁瑞達(dá)科技有限公司;水為超純水;其他試劑均為分析純。

島津高效液相色譜儀（LC-10ATVP Plus），包括二元高壓梯度泵（LC-10ADVP）、紫外可見雙波長(zhǎng)檢測(cè)器（SPD-10AVP Plus）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-10A）、柱溫箱（CTO-10ASVP Plus）;C18反向色譜柱（華譜科儀科技有限公司）;RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）;RE-501型恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）;KQ-500D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超速儀器有限公司）;精密鼓風(fēng)干燥箱（上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）;RHP-600型高速多功能粉碎機(jī)（浙江榮浩工貿(mào)有限公司）;土壤溫濕度測(cè)定儀（順科達(dá)）。

1.3 方法

1.3.1 黃芪種植和采收 于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地（吉林省延吉市）進(jìn)行。2015年4月10日播種，6月10日后現(xiàn)真葉，10月枯萎;越冬后，次年4月下旬開始返青，10月枯萎。由此確定1年生采收期從7月開始，2、3年生采收期從5月開始，截止至10月，具體采樣日期為每月10日。每次采樣時(shí)取9株植株，3株植株為1次重復(fù)。采樣后，將樣品于50 ℃烘干箱中烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定生物量。將干燥樣品磨至粉末狀，過60目篩，用于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取。

1.3.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定

1.3..2.1 供試品溶液 參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》方法[1]。精確稱取黃芪樣品粉末0.5 g，放入圓底燒瓶中，加入分析級(jí)甲醇50 mL，于80 ℃水浴鍋中加熱回流4 h，冷卻至室溫，用沃特曼（Whatman）中速濾紙過濾后，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用5 mL色譜級(jí)甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，密封保存，待HPLC分析。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3..2.2 HPLC分析 采用Kim等的方法[13-14]。利用反向C18色譜柱（5 μm，100A，4.6 mm×250 mm）進(jìn)行試驗(yàn)，流動(dòng)相A為水，B為乙腈;流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 230 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。二元梯度洗脫條件：B泵濃度在0～30 min為15%～55%，30～35 min為55%～100%，35～40 min為100%～15%，40～45 min為15%。

1.3.2.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷產(chǎn)量 毛蕊異黃酮葡萄糖苷產(chǎn)量=毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量×生物量。

1.4 土壤溫度和濕度

用土壤溫濕度測(cè)定儀測(cè)定，探針深度為10 cm，取月平均值代表土壤溫度和濕度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件包，2個(gè)樣本之間顯著性差異利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P<0.05），相關(guān)性分析利用雙變量相關(guān)分析中的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，簡(jiǎn)稱Pearson）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期膜莢黃芪的生物量

在本研究過程中，隨著膜莢黃芪的自然生長(zhǎng)，1、2年生黃芪幾乎沒有發(fā)生病蟲害，而3年生黃芪在5月末受到蚜蟲侵害，6月初發(fā)生白粉病，8月初開始受根腐病危害，其生物量的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。隨著植株生長(zhǎng)，根生物量呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，1、2年生積累速度較快，3年生積累速度開始減緩，這可能與3年生黃芪發(fā)生病蟲害有關(guān);1、2年生莖生物量至9月份為止呈上升趨勢(shì)，10月份地上部開始枯萎時(shí)出現(xiàn)下降現(xiàn)象，而3年生莖生物量至9月份為止呈波動(dòng)升高，隨后降低;1、2年生葉生物量積累與莖相似，3年生葉生物量則在6月份明顯增加后，一直呈降低趨勢(shì)。2、3年生莖和葉的生物量在6月份快速積累，表明植株開始進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期?？傮w而言，1、2年生黃芪的生物量隨著植株生長(zhǎng)逐漸積累，而病蟲害的發(fā)生嚴(yán)重限制了3年生黃芪生物量的積累。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

毛蕊異黃酮葡萄糖苷在膜莢黃芪自然生長(zhǎng)中的各個(gè)時(shí)期、各個(gè)部位（根、莖和葉）均有分布（圖2）。其含量在1年生根中呈增長(zhǎng)趨勢(shì)（7—10月），在2年生根中呈先降低（5—7月）后升高（8—10月）趨勢(shì)，在3年生根中除8月明顯增加之外，變化趨勢(shì)與2年生相似，這可能與3年生根在8月受根腐病刺激有關(guān);1、2年生莖中含量一直保持上升趨勢(shì)，3年生莖中含量到8月為止也一直呈上升趨勢(shì)，之后開始下降;1、2年生葉中含量呈持續(xù)下降趨勢(shì)，3年生葉中除6月急劇增加之外，也一直保持下降趨勢(shì)?？偠灾?，1、2年生黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累規(guī)律相似，而病蟲害的發(fā)生干擾了3年生黃芪中較為規(guī)律的積累模式。

2.3 土壤溫度和濕度對(duì)根毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響

由于3年生黃芪受病蟲危害，本研究只分析了土壤溫度和濕度對(duì)1、2年生黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的影響。由圖3可知，黃芪土壤溫度和濕度變化趨勢(shì)與根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量變化趨勢(shì)（圖2）相反。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，土壤溫度和濕度與1年生根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.974（P<0.05）和 -0.988（P<0.05），與2年生根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量之間的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.952（P<0.01）和 -0.931（P<0.01），這表明土壤溫度和濕度與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.4 毛蕊異黃酮的葡萄糖苷產(chǎn)量

由圖4可見，毛蕊異黃酮葡萄糖苷總產(chǎn)量（包括根、莖和葉）在1、2年生黃芪中整體呈上升趨勢(shì)，10月時(shí)最高，而病蟲害的發(fā)生則抑制了3年生黃芪總產(chǎn)量增長(zhǎng)。值得一提的是，除5月外，2年生莖中的產(chǎn)量明顯高于同時(shí)期根和葉中的產(chǎn)量。

3 討論

毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中主要的活性成分之一，由本研究結(jié)果可知，其組成型表達(dá)發(fā)生在膜莢黃芪生長(zhǎng)的各個(gè)部位和各個(gè)時(shí)期， 這表明它在膜莢黃芪的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起重要的作用。在不發(fā)生病蟲害時(shí)，無論是1年生還是2年生黃芪，隨著植株的生長(zhǎng)和生物量的積累，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在莖中呈上升趨勢(shì)，在葉中則保持下降趨勢(shì)，說明地上部毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量受植物本身生長(zhǎng)發(fā)育水平的調(diào)控，

在嫩葉和成熟莖中含量較高。特別是2年生成熟莖（8、9、10月）中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[1]（>0.02%，即>200 μg/g），產(chǎn)量高，可成為獲取毛蕊異黃酮葡萄糖苷的有效途徑。

根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量與土壤溫度和濕度呈顯著負(fù)相關(guān)，且地上部枯萎后，土壤中的根經(jīng)過寒冷漫長(zhǎng)的冬季和寒冷干燥的春季，其毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量（2、3年生5月）與上一年（1、2年生10月）相比明顯增加。這些結(jié)果表明，根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的積累與黃酮類化合物在植物的抗寒和抗旱過程中的保護(hù)作用密切相關(guān)[15]，即適當(dāng)?shù)牡蜏睾退置{迫促進(jìn)了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累。Pan等也報(bào)道，低溫（2 ℃）刺激了蒙古黃芪幼苗根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累[7]，并且這種積累提高了蒙古黃芪幼苗的耐凍性[16]。還有報(bào)道表明，適當(dāng)?shù)母珊得{迫促進(jìn)了3年生蒙古黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累[17]。

在黃芪植株生長(zhǎng)過程中，病蟲害的發(fā)生是不可避免的。由本研究結(jié)果可知，進(jìn)入快速生長(zhǎng)期之后，病蟲害的發(fā)生嚴(yán)重限制了3年生黃芪生物量的積累，這與楊春清等報(bào)道的黃芪白粉病、根腐病和蚜蟲等病蟲害的發(fā)生會(huì)造成黃芪大幅度減產(chǎn)的結(jié)果[18]相一致。異黃酮是豆科植物中的植保素[19]，異黃酮的含量與大豆抗蚜蟲[20]、紅三葉抗白粉病[21]和大豆抗根腐病[19]的能力密切相關(guān)。與此相似，在本研究中蚜蟲與白粉?。?月的葉）、根腐病的發(fā)生之初（8月的根）分別誘導(dǎo)了黃芪葉和根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的明顯積累，但是長(zhǎng)期的病蟲危害則降低了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量和產(chǎn)量。

根是黃芪主要的入藥部位，在本試驗(yàn)中，根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累是動(dòng)態(tài)的，與非生物和生物脅迫密切相關(guān)，同時(shí)也具有時(shí)間特異性，這可能與膜莢黃芪長(zhǎng)期適應(yīng)延邊地區(qū)的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。因此，在比較不同地區(qū)膜莢黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量時(shí)，應(yīng)充分了解各自地區(qū)毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的差異性，以增加可比性。

綜上，本試驗(yàn)結(jié)果表明，2年生膜莢黃芪根中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行適時(shí)采收;成熟莖中含量和產(chǎn)量都較高，可用于開發(fā)飼料;嫩葉中含量也不低，適合作茶飲，這些結(jié)果將有助于指導(dǎo)延邊地區(qū)黃芪的栽培和生產(chǎn)。

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