劉雪嬌 賈田惠 高同國 郭曉軍 李術娜

摘要：對貝萊斯芽孢桿菌電擊轉化條件進行優(yōu)化，以期建立其高效轉化體系。采用pIC333質粒電擊轉化貝萊斯芽孢桿菌3A3-15野生型菌株，考察細胞生長階段、電壓、電阻和質粒DNA加入量對轉化效率的影響。當細胞培養(yǎng)物D600 nm為0.9，電壓為1.75 kV，電阻為400 Ω，質粒DNA加入量為50 ng時，其轉化率最高達7.92×104 CFU/μg。該研究為貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15菌株的基因和分子水平操作奠定了基礎。

關鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌;電擊轉化;pIC333;優(yōu)化

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）05-0046-04

收稿日期：2017-12-15

基金項目：河北省自然科學基金（編號：C2015204031）;河北省高等學?？茖W技術研究項目（編號：BJ2016029）。

作者簡介：劉雪嬌（1991—），女，河北廊坊人，碩士研究生，主要從事植物真菌病害及生物防治研究。E-mail：956760741@qq.com。

通信作者：高同國，博士，碩士生導師，主要從事植物真菌病害及生物防治研究。E-mail：gtgrxf@163.com。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是一類重要的生防細菌[1]，對大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌、尖孢鐮刀菌、瘡痂鏈霉菌、立枯絲核菌等多種植物病原菌有明顯抑菌作用[2]。隨著現(xiàn)代分子生物技術的進步，利用基因工程手段對生防細菌改造以提高其生防效果成為當前研究的熱點問題，但由于芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，其細胞壁厚而致密[3]，其基因轉化效率較低[4]。因此，建立并優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌基因轉化體系是對其進行分子操作的重要前提。

在大量的分子遺傳研究方法中，轉座子隨機誘變技術因操作簡便而備受關注，轉座子及其衍生物作為插入突變原或分子標簽已廣泛應用于基因的分離和克隆中[5]，特別是某些具有隨機轉化特性的轉座子，已成為發(fā)現(xiàn)新基因、克隆功能基因、發(fā)掘已知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具[6]。Tn10轉座元件是目前在芽孢桿菌中應用廣泛的轉座子之一，已成功應用于芽孢桿菌突變體庫的構建及基因功能的研究，mini-Tn10是目前應用比較成熟、廣泛的Tn10轉座子衍生物之一[7]。而轉座質粒pIC333是針對芽孢桿菌構建出來的改良的mini-Tn10載體[8-9]。

目前外源基因導入宿主菌的主要手段有感受態(tài)法、原生質體轉化法和電擊轉化法。其中，電擊轉化法由于操作簡單、轉化率相對較高而被廣泛使用。該方法已在枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、短芽孢桿菌等不同種芽孢桿菌上得到成功應用[10-12]。芽孢桿菌不同種屬間，電轉化條件對電轉效率的影響較大，導致不同細菌電擊轉化效率不同。如細胞生長D600 nm值為0.7、pHY-P43質粒DNA加量為80 ng、恢復培養(yǎng)基山梨醇濃度為0.8 mol/L、電轉緩沖液為SGM以及電場強度為21 kV/cm時枯草芽孢桿菌WB600轉化率為8.0×106 CFU/μg [13]，Tn5轉座子導入短小芽孢桿菌DX01菌株時，當培養(yǎng)液D600 nm為0.96時，電壓2.4 kV/cm，采用AEB電轉緩沖液時電轉效率最高587 CFU/μg[14]。目前電轉化方法在枯草芽孢桿菌中研究較多，但很少有關于貝萊斯芽孢桿菌轉化體系的研究。

前期工作中篩選得到1株對尖孢鐮刀菌具有較強拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌3A3-15，為進一步開展其分子遺傳學研究，對其影響電擊效率的因素進行了摸索并對其電擊轉化體系進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、質粒及培養(yǎng)基?本試驗于2016年12月在河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院制藥工程實驗室進行。

貝萊斯芽孢桿菌3A3-15菌株為上述實驗室分離、保存。

質粒pIC333由江蘇師范大學劉偉杰老師提供，該質粒帶有轉座子mini-Tn 10，含有壯觀霉素抗性基因、紅霉素抗性基因和ColE1復制起點。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，pH 值為7.2～7.5。

生長培養(yǎng)基：LB+0.5 mol/L山梨醇。

復蘇培養(yǎng)基：LB+0.5 mol/L山梨醇+0.38 mol/L甘露醇。

電擊緩沖液：0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油。

1.2 貝萊斯芽孢桿菌3A3-15生長曲線

用竹簽挑取活化好的貝萊斯芽孢桿菌3A3-15，接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，再按1%的接種量接種到新鮮的生長培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，定時取樣，測定樣品在600 nm波長下的吸光度，并繪制生長曲線。

1.3 質粒提取與感受態(tài)細胞制備

采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取結果進行檢測，采用Thermo Scientific公司的Nanodrop 2000分光光度計測定其濃度及純度。貝萊斯芽孢桿菌3A3-15菌株感受態(tài)細胞的制備參考文獻[15-16]中的制備方法。取出冰箱中保存的3A3-15菌株，采用LB固體培養(yǎng)基進行活化。挑取單菌落接種于6 mL LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、200 r/min搖床，過夜培養(yǎng)。取5.2 mL接入100 mL含0.5 mol/L山梨醇的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)。將菌液冰浴10 min，然后4 ℃、5 000 r/min離心5 min收集菌體。用100 mL預冷的電轉培養(yǎng)基重新懸浮菌體，4 ℃、5 000 r/min離心8 min棄上清，如此漂洗至少4次。將洗滌后的菌體吹懸于1 mL電轉培養(yǎng)基中，每預冷的1.5 mL EP管分裝100 μL，置于-70 ℃保存。

1.4 電擊轉化條件

在100 μL感受態(tài)細胞中加入質粒DNA，冰上孵育30 min后，加入預冷的電轉杯（2 mm）中，電擊1次。利用浙江寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)的SCIENTZ-2C基因導入儀進行電擊，電擊完成后迅速取出杯子并立即加入900 μL RM，37 ℃、100 r/min復蘇5 h后，吸取100 μL涂布在含有100 μg/mL壯觀霉素和5 μg/mL紅霉素的LB平板上。30 ℃培養(yǎng)48 h。記錄菌落數(shù)，計算轉化效率（轉化1 μg質粒獲得的菌落數(shù)）。試驗重復3次。

1.5 細菌生長期對轉化率的影響

為考察貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15不同的生長狀態(tài)對感受態(tài)的制備和后期轉化的影響，培養(yǎng)細胞D600 nm值分別為03、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5時，按照“1.3”節(jié)方法制備成不同生長時期的電轉感受態(tài)，并于電壓1.25 kV、電容25 μF、電阻400 Ω條件下，電擊持續(xù)時間應在4.5～5.0 ms之間。電擊轉化方法參考“1.4”節(jié)，觀察試驗結果。

1.6 電壓對轉化率的影響

電場強度過高會造成細胞的大量死亡，電場強度過低則不能形成細胞穿孔[17]。本試驗在上述研究的基礎上，選擇轉化率最高的細胞生長期，研究電壓為1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 kV時對轉化率的影響。其他條件如電容25 μF、電阻400 Ω等保持不變，按照上述“1.4”節(jié)方法進行電擊轉化，觀察試驗結果。

1.7 電阻對轉化率的影響

對芽孢桿菌的電擊轉化電阻大多采用200 Ω和 400 Ω[18-19]。在上述細胞生長期和轉化電壓確定后，比較了電阻為200 Ω和400 Ω對貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15菌株電擊轉化率的影響。按照上述“1.4”節(jié)方法進行電擊轉化，其中電容25 μF保持不變，轉化后觀察試驗結果。

1.8 質粒加入量對轉化的影響

電轉化效率與外源DNA量在一定范圍內成正比;但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉化效率下降[20]。試劑盒提取pIC333質粒后，根據(jù)前述已優(yōu)化的其他電擊條件，在電擊轉化中分別加入5、10、50、100、500 ng的質粒DNA，按照“1.4”節(jié)方法進行電擊轉化，計算轉化率。

1.9 轉化子分子驗證

隨機挑取轉化子，于含有100 μg/mL壯觀霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12h后，采用質粒提取試劑盒提取質粒，采用Tn10F：5′-GCATTAATGAATCGGCCAACG-3′和Tn10R：5′-GTGGGTAAACCGTGAATATCG-3′引物對含有的壯觀霉素基因進行擴增，采用紅霉素引物ermF：5′-ATG AACGAGAAAAATATAAAACAC-3′和ermR：5′-TTACTTA TTAAATAATTTATAGCTATT-3′對紅霉素編碼基因進行擴增，驗證轉化子。

壯觀霉素基因PCR擴增程序：95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，25個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

紅霉素基因PCR擴增程序：95 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，25 個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 質粒提取結果

采用試劑盒提取質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳對質粒進行檢測（圖1）。質粒條帶較清晰且無其他條帶說明提取的質?？芍苯佑糜诤罄m(xù)的轉化試驗中。經(jīng)nanodrop 2000分光光度計測定其濃度為34.1 ng/μL，其D260 nm/D280 nm=2.1，D260 nm/D230 nm=2.24，表明提取的質粒濃度及純度滿足電轉化的需要。

2.2 細菌生長期對轉化率的影響

采用分光光度計測定3A3-15菌株的生長曲線，結果見圖2。根據(jù)生長曲線，選取不同生長階段的3A3-15培養(yǎng)物制備成電擊感受態(tài)細胞，研究不同生長階段的細胞制備的感受態(tài)對3A3-15轉化效率的影響。如圖3所示，在D600 nm=0.3～0.9時，3A3-15處于對數(shù)生長前期，轉化率隨細胞數(shù)量的增多逐漸增加。當D600 nm值為0.9時轉化率最高，為172×104 CFU/μg，隨后其轉化率隨培養(yǎng)時間延長有所降低。

2.3 電壓對3A3-15菌株電轉化效率的影響

電場強度是影響電擊轉化效率的重要參數(shù)[21]。根據(jù)上述結果，用D600 nm=0.9的3A3-15培養(yǎng)物做電擊感受態(tài)， 研

究不同電壓下3A3-15菌株電擊轉化效率，結果見圖4。當電壓為1.25～1.75 kV時，3A3-15菌株的轉化率有明顯的上升，電壓為1.75 kV時，轉化效率最高達到了5.33×104 CFU/μg;之后隨著電壓的增大，其轉化率有所下降。

2.4 電阻對3A3-15菌株電轉化效率的影響

在電壓為1.75 kV條件下，測試電阻值在200 Ω和 400 Ω 時3A3-15菌株的電擊轉化效率，結果見圖5，在電壓為 1.75 kV、電阻值為200 Ω和400 Ω的條件下電擊轉化效率分別為3.23×104 CFU/μg和5.50×104 CFU/μg。故后續(xù)試驗電擊過程采用400 Ω電阻值。

2.5 質粒DNA加入量對3A3-15電轉化效率的影響

在已優(yōu)化的電擊條件的基礎上，研究pIC333質粒加入量對3A3-15菌株電擊轉化率的影響，結果（圖6）表明，在一定的濃度范圍內隨著加入質粒DNA量的增加，其電擊轉化效率有所增加，當加入量為50 ng時，其轉化率最高，為7.92×104 CFU/μg。當質粒DNA的加入量再增加時轉化率反而降低。

2.6 貝萊斯芽孢桿菌3A3-15轉化子檢測

將pIC333質粒轉化進入貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15的感受態(tài)細胞中后，篩選得到了轉化子3A3-15-PIC333，提取該轉化子中的質粒，利用PCR擴增壯觀霉素基因進行檢測，結果如圖7所示。利用Tn10F和Tn10R引物擴增其壯觀霉素編碼基因，沒有轉化的野生型3A3-15中沒有目的條帶，轉化子中得到了大小約為2.1 kb的片段。上述PCR產(chǎn)物送華大基因進行測序，測序結果與壯觀霉素基因序列一致。進一步利用引物ermF和ermR對其編碼的紅霉素基因進行擴增，野生型3A3-15中沒有擴增到相關基因片段，在轉化子中擴增得到大小約750 bp的片段，經(jīng)測序、比對，其與紅霉素基因序列一致。上述檢測結果說明，PIC333質粒已經(jīng)通過電擊轉化的方法轉化進入了貝萊斯芽孢桿菌3A3-15中。

3 討論與結論

電轉化是一種簡便高效的外源DNA轉化的方法，因菌種不同其轉化效率差別較大，相對于革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚且致密，電擊轉化率較低[2]。而且芽孢桿菌不同的種屬、質粒攜帶復制子不同來源，其電轉化效率差別較大。王培培等比較了5個不同大小和攜帶不同復制子來源的質粒轉化枯草芽孢桿菌NCD-2菌株的轉化效率，發(fā)現(xiàn)其質粒大小與轉化效率之間無線性關系，但不同復制子來源的質粒電轉效率差別很大，質粒pHV1249的電轉化效率為1.40×102 CFU/μg，而pNW33N的電轉化效率為2.38×104 CFU/μg [10]。質粒pNW33N電轉化凝結芽孢桿菌P4-102B的最高轉化率為2.7×102 CFU/μg [11]。質粒pHT43電轉化多黏類芽孢桿菌JSa-9感受態(tài)細胞和原生質體細胞，其轉化率分別為0.36×103 CFU/μg和 1.0×103 CFU/μg [17]。本試驗中質粒pIC333電轉化貝萊斯芽孢桿菌 3A3-15感受態(tài)細胞的轉化率為7.92×104 CFU/μg，滿足基因操作的需要。

電場強度是影響電擊效率的主要參數(shù)，提高電場強度可以增強外源基因進入菌體的概率，但會增加細菌細胞的死亡率，使得轉化效率下降，因此轉化效率要兼顧這2個方面。不同的菌株所需最適的轉化電場強度有所不同。如Lu等研究了質粒pHT43在2株枯草芽孢桿菌WB800和DB104中的轉化率，發(fā)現(xiàn)在20～25 kV/cm的電場強度下，2株芽孢桿菌最優(yōu)轉化強度有所不同，分別在24 kV/cm和22 kV/cm時電擊轉化率最高[22]，枯草芽孢桿菌NCD-2最適轉化場強為 14 kV/cm [10]。迄今，除本研究外未發(fā)現(xiàn)有關貝萊斯芽孢桿菌優(yōu)化電場強度的報道。

不同菌株電擊轉化的最佳生長階段是不一致的。一般處于對數(shù)生長初期的菌株電擊轉化率高于中期和后期[16]。本試驗中轉化率最高時其D600 nm為0.9，處于對數(shù)生長初期。外源質粒DNA加入量對轉化也有一定影響，加入量不足和太多都會影響轉化效率。本試驗中DNA最佳加入量為50ng，這與牛福星等發(fā)現(xiàn)pHCMC04質粒添加量為140 ng時其轉化率最高的結果[23]以及Zhang等發(fā)現(xiàn)當質粒DNA含量在10 ng時pHT43轉化Bacillus subtilis ZK的效率最高的結果[24]均有所不同，說明不同菌株間轉化所需DNA濃度有所不同。

總之，本試驗首次研究了pIC333電轉化貝萊斯芽孢桿菌3A3-15的條件，發(fā)現(xiàn)當細胞培養(yǎng)物濃度D600 nm為0.9、電壓為1.75 kV，電阻為400 Ω、質粒DNA加入量為50 ng時，其轉化率最高，達7.92×104 CFU/μg，本研究結果為貝萊斯芽孢桿菌的電擊轉化提供了方法，為其基因轉移和分子生物學操作奠定了基礎。

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