高靜，李曉嵐，王敏哲，劉貫英，楊雪松

作者單位：新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830054

近年較多動物模型在研究分析糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生、發(fā)展機制時，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子參與調(diào)控了此過程［1-2］，其中對新生血管生成有重要作用的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）已成為學(xué)者們的研究熱點。目前實驗資料結(jié)果已經(jīng)推測VEGF可能調(diào)控了視網(wǎng)膜病變的形成，可能與VEGF具有提高血管通透性、促內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖等功能密切相關(guān)［3］，且最新研究發(fā)現(xiàn)在大鼠糖尿病模型實驗中，一旦抑制VEGF的表達(dá)，大鼠視網(wǎng)膜病變會出現(xiàn)顯著改善［4］?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）是最近發(fā)現(xiàn)的一種由骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其他組織基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它具有趨化活性的功能。前有研究認(rèn)為，SDF-1和VEGF一樣，也參與了糖尿病大血管病變和微血管病變過程［5-7］，但其在調(diào)控的作用機制目前尚不明確，而SDF-1和VEGF之間是否存在相互調(diào)節(jié)的作用以及其相互作用機制也尚無定論。本研究自2017年1—5月對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別以siRNA介導(dǎo)低表達(dá)VEGF、SDF-1處理細(xì)胞，觀察處理后細(xì)胞增殖、凋亡、遷移狀況的變化情況，從而為進(jìn)一步探討VEGF和SDF-1在糖尿病視網(wǎng)膜血管病變中的可能作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1購自上海信裕生物技術(shù)有限公司。從GenBank中獲得已知的人VEGF和mRNA的序列VEGF、SDF-1，VEGF165、SDF-1 siRNA由上海吉瑪公司合成，非特異隨機序列由上海吉瑪公司贈送。DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清購自北京方程生物公司，脂質(zhì)體lipofectamineTM 2000購自美國Santa Cruz公司。BCA法蛋白定量測定試劑盒、VEGF、SDF-1兔抗人抗體均購自福建邁新生物工程公司、β-actin鼠單克隆抗體購自Anbo公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，其中含10%FBS，細(xì)胞傳代至對數(shù)生長期開始實驗。

1.2.2實驗分組和轉(zhuǎn)染 實驗分成4組，分別為空白對照組（Ⅰ組），轉(zhuǎn)染非特異性對照組（Ⅱ組），轉(zhuǎn)染si VEGF165組（Ⅲ組），轉(zhuǎn)染si SDF-1組（Ⅳ組）。對各組的轉(zhuǎn)染操作過程如下：①在各組的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入生長狀態(tài)良好的HMEC-1細(xì)胞；②對Ⅱ組，Ⅲ組和Ⅳ組分別加入Scramble RNA 20 nmol/L、si VEGF165 20 nmol/L、si SDF-1 20 nmol/L，三組均加入適量Lipofect 2000TM；③24 h后收集細(xì)胞；④對Ⅰ組的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1不作任何處理。

1.2.3Western印跡法 采用Western印跡法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中VEGF165、SDF-1蛋白表達(dá)變化。操作過程：（1）提取蛋白：將各組細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加3 mL 4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，加入400 μL含PMSF的裂解液，使細(xì)胞充分裂解，于4℃下12 000 r/min離心5 min，吸取上清，放于-80℃保存。（2）Bradford法測定蛋白濃度：首先把不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加進(jìn)96孔板中，并將待測樣品2.5 μL加進(jìn)測試孔，均稀釋10倍后在測定總蛋白濃度，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。（3）Western Blot檢測：緩慢地在樣孔中加入樣品，經(jīng)過兩種不同的SDS-PAGE電泳（濃縮膠60 V；分離膠100 V），分別為5%和10%各2 h；轉(zhuǎn)印在Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行，之后封閉硝酸纖維素膜，取出漂洗3次，保存于雜交袋中，內(nèi)含有1∶1 000的一抗，保持溫度4℃下，持續(xù)緩慢地?fù)u動過夜。第二天先進(jìn)行漂洗3次后將硝酸纖維素膜取出放進(jìn)另外一個雜交袋中，內(nèi)含有1∶2 000的二抗，溫度為室溫，緩慢地繼續(xù)搖動1 h。取出漂洗3次后以actin為內(nèi)參對照，進(jìn)一步顯影，感光，定影，均在暗室內(nèi)操作；用Quatity One軟件對得到的圖片進(jìn)行分析其條帶灰度值。

1.2.4MTT增殖檢測 取各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，調(diào)制成1×105/mL細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入200 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)的48 h后去除培養(yǎng)基，加入含l mg/mLMTT的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）液，室溫下將平板在微孔板上震蕩，使結(jié)晶物溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長490 nm處測吸光度OD值，取4個復(fù)孔的平均值。抑制率＝（1-實驗孔OD值／對照孔OD值）×100%。

1.2.5流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡變化 收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，調(diào)制濃度為2×105/mL的細(xì)胞懸液，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌1次，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定 1～2 h，離心棄去固定液，PBS 重懸 5 min。400目的篩網(wǎng)過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS，收集懸浮細(xì)胞。加入1 mL PI染液染色，4℃避光30 min。細(xì)胞經(jīng)過PI染色后，上流式細(xì)胞儀，熒光被PI激發(fā)氬離子而產(chǎn)生，激光光波波長為488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖，用Cellquest軟件分析處理熒光強度，得出各組細(xì)胞凋亡百分比。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）＝亞二倍體峰細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6劃痕愈合實驗 收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，在24孔板每孔接種1×105個細(xì)胞，在37℃5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，在孔板中央劃一條寬度為0.8 mm的橫線，并在橫線等距離間隔作5個標(biāo)記以為下一步測量做準(zhǔn)備。繼續(xù)置于37℃5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)前（0 h）和培養(yǎng)后（48 h）均采用相差顯微鏡觀察，沿橫線邊緣作為數(shù)據(jù)測定點，測量橫線兩側(cè)的細(xì)胞間距離（μm）變化，測量時取平均值。HMEC-1的遷移距離（遷移能力）＝0 h橫線邊沿的距離-48 h后細(xì)胞遷移邊沿的距離。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行整理分析，以±s來表示計量資料，多組間數(shù)據(jù)資料采用單因素方差分析（Anova），組間資料采用lsd-t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1Western印跡法檢測VEGF165、SDF-1蛋白的表達(dá)轉(zhuǎn)染了VEGF165-siRNA后，Ⅲ組VEGF165、SDF-1蛋白的表達(dá)強度均明顯弱于Ⅰ組和Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝9.836，8.279，7.846，8.045，P＜0.05）；轉(zhuǎn)染了SDF-1-siRNA后，Ⅳ組SDF-1蛋白的表達(dá)強度均明顯弱于Ⅰ組和Ⅱ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝7.381，7.984，P＜0.05），而VEGF165蛋白表達(dá)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Ⅰ組與Ⅱ組比較，VEGF165、SDF-1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1，表1。

圖1 si VEGF165和si SDF-1處理HMEC-1細(xì)胞24 h下調(diào)VEGF165、SDF-1的蛋白表達(dá)水平：I為空白對照組；Ⅱ為轉(zhuǎn)染非特異性對照組；Ⅲ為轉(zhuǎn)染si VEGF165；IV：轉(zhuǎn)染si SDF-1

表1 轉(zhuǎn)染后HMEC-1細(xì)胞中VEGF165、SDF-1蛋白的相對表達(dá)比較/±s

表1 轉(zhuǎn)染后HMEC-1細(xì)胞中VEGF165、SDF-1蛋白的相對表達(dá)比較/±s

注：與Ⅰ組比較，aP＜0.05；與Ⅱ組比較，bP＜0.05

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組F值P值VEGF165 1.92±0.42 1.87±0.35 0.48±0.07ab 1.76±0.09 6.067 0.018 SDF-1 1.29±0.38 1.32±0.47 0.62±0.08ab 0.37±0.05ab 4.589 0.038

2.2VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1增殖、凋亡的影響經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后，Ⅲ組和Ⅳ組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖抑制率和凋亡率明顯增高，與Ⅰ組和Ⅱ組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但Ⅲ組和Ⅳ組之間比較，Ⅲ組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率增高更顯著（t＝6.217，5.487，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ⅰ組與Ⅱ組比較，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明經(jīng)VEGF165 siRNA和SDF-1siRNA轉(zhuǎn)染均對HMEC-1細(xì)胞增殖能力具有抑制作用，對細(xì)胞發(fā)生凋亡具有明顯的促進(jìn)作用，但VEGF165 siRNA轉(zhuǎn)染的作用更顯著。見表2，圖2。

2.3VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外遷移力的影響細(xì)胞遷移實驗中，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組遷移距離分別為（579.65±11.59）μm、（553.76±9.47）μm、（234.72±10.28）μm、（318.36±9.95）μm，Ⅲ組和Ⅳ組細(xì)胞明顯 少 于 Ⅰ 組 和 Ⅱ 組（t＝10.972，9.894，8.426，7.904，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而Ⅰ組與Ⅱ組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其中Ⅲ組和Ⅳ組之間比較，Ⅲ組細(xì)胞明顯少于Ⅳ組（t＝5.907，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義 。說明VEGF165、SDF-1表達(dá)的下調(diào)抑制了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的遷移能力，且經(jīng)轉(zhuǎn)染VEGF165 siRNA后的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的遷移能力下降更顯著。見圖3，表3。

表2 轉(zhuǎn)染后各組HMEC-1細(xì)胞的增殖能力、凋亡情況比較/xˉ± s

表3 VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外遷移力的影響

圖2 各組人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1凋亡率的檢測結(jié)果：A為Ⅰ組，B為Ⅱ組，C為Ⅲ組，D為Ⅳ組

圖3 VEGF165-siRNA、SDF-1-siRNA對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外遷移力的影響檢測：A為Ⅰ組，B為Ⅱ組，C為Ⅲ組，D為Ⅳ組

3 討論

VEGF的促血管新生作用最初是1989年由研究者發(fā)現(xiàn)的，之后它一直是人們的研究熱點。越來越多的動物實驗以及體外實驗均已經(jīng)證明了，VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長增殖、促血管通透及誘導(dǎo)血管形成的作用。VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D和PIGF，其中VEGF-A與生理/病理情況下的血管生成、血管形成密切相關(guān)［8］。VEGF基因根據(jù)不同剪接分為5種異構(gòu)體：VEGF121、145、165、189及206，其中VEGF165是最為常見的形式，因其在生理病理反應(yīng)中的重要作用被定義為優(yōu)勢異構(gòu)體。目前實驗結(jié)果推測VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞作用及新生血管形成的影響可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展過程的機制之一［9］。SDF-1是CXC家族的趨化因子蛋白，也屬于重要的血管生成蛋白之一，主要在低氧條件下由基質(zhì)細(xì)胞分泌表達(dá)，對腫瘤的生長轉(zhuǎn)移以及血管生成的調(diào)節(jié)起著重要作用［10-11］。以往研究表明［12］SDF-1能夠促進(jìn)血管新生部位鄰近的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、形成管樣結(jié)構(gòu)，并通過動員募集血管前體細(xì)胞參與血管的生成，在修復(fù)損傷的過程中起到重要作用。最新研究發(fā)生，SDF-1能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞，促使它從骨髓向缺血的視網(wǎng)膜組織集聚，從而參與糖尿病病人視網(wǎng)膜血管病變發(fā)生［13-14］?，F(xiàn)研究認(rèn)為，SDF-1和VEGF的表達(dá)均參與了糖尿病大血管病變和微血管病變過程［4］，但目前對于二者之間的關(guān)系以及作用機制尚無定論。

在基因研究領(lǐng)域中，將外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA（dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞后，調(diào)節(jié)和關(guān)閉相應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動，這種發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的基因靜寂現(xiàn)象被稱之為RNA干擾［15-16］。本研究為探討VEGF、SDF-1基因?qū)θ宋⒀軆?nèi)皮細(xì)胞HMEC-1增殖、遷移、凋亡中的作用，根據(jù)VEGF、SDF-1基因mRNA特點，設(shè)計了siRNA序列，分別轉(zhuǎn)染了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染VEGF165-siRNA組和轉(zhuǎn)染SDF-1-siRNA組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖抑制率和凋亡率明顯增高，與空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但轉(zhuǎn)染VEGF165-siRNA組和轉(zhuǎn)染SDF-1-siRNA組之間比較，轉(zhuǎn)染VEGF165-siRNA組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率增高更顯著。表明經(jīng)VEGF165 siRNA和SDF-1siRNA轉(zhuǎn)染均對HMEC-1細(xì)胞增殖能力具有抑制作用，對HMEC-1細(xì)胞發(fā)生凋亡具有明顯的促進(jìn)作用，但其中VEGF165 siRNA轉(zhuǎn)染的作用更顯著。推測VEGF、SDF-1基因均能促進(jìn)HMEC-1的增殖能力，并抑制HMEC-1的凋亡，從而在糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，而通過轉(zhuǎn)染siRNA阻斷它們的表達(dá)，能降低微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可推測兩者對微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用可能為糖尿病視網(wǎng)膜血病變治療提供新的靶點［17-18］。

本研究采用Western Blot方法檢測VEGF、SDF-1蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了VEGF165-siRNA后，Ⅲ組VEGF、SDF-1蛋白的表達(dá)強度均明顯弱于空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性對照組（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染了SDF-1-siRNA后，Ⅳ組SDF-1蛋白的表達(dá)強度均明顯弱于空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性對照組（P＜0.05），而VEGF蛋白表達(dá)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1轉(zhuǎn)染siRNA后，均出現(xiàn)相應(yīng)基因表達(dá)的蛋白水平下降，而轉(zhuǎn)染了VEGF165-siRNA后，不僅VEGF蛋白表達(dá)水平降低明顯，同時伴隨SDF-1蛋白表達(dá)下降。這與前面提到VEGF165 siRNA轉(zhuǎn)染對HMEC-1細(xì)胞增殖、凋亡能力的作用更顯著是相符的，證明了抑制VEGF表達(dá)可以下調(diào)SDF-1表達(dá)水平，兩者之間可能存在密切聯(lián)系，VEGF對SDF-1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)機制。

本研究細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF165-siRNA組和轉(zhuǎn)染SDF-1-siRNA組細(xì)胞遷移距離明顯少于空白對照組和轉(zhuǎn)染非特異性對照組（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染VEGF165-siRNA組和轉(zhuǎn)染SDF-1-siRNA組之間比較，轉(zhuǎn)染VEGF165-siRNA組細(xì)胞遷移距離明顯少于轉(zhuǎn)染SDF-1-siRNA組（P＜0.05）。說明VEGF、SDF-1表達(dá)的下調(diào)抑制了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的遷移能力，且經(jīng)轉(zhuǎn)染VEGF165 siRNA后的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的遷移能力下降更顯著［19-20］。提示兩者在對微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的調(diào)節(jié)過程中，VEGF對SDF-1表達(dá)具有調(diào)節(jié)機制，這可能為尋找預(yù)防及治療糖尿病視網(wǎng)膜血管病變提供了新的策略［21-23］。