胡觀麗，張晶波，董潔，胡勝男，劉建維，孟琳，王晴，張蓓

作者單位：1徐州醫(yī)科大學(xué)，a研究生學(xué)院，b臨床學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2徐州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 徐州 221004；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇 徐州 221004；

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年增加，且發(fā)病年齡愈發(fā)年輕化［1-2］。子宮內(nèi)膜癌具有雌激素依賴性，超生理水平的雌激素與雌激素受體（ER）結(jié)合促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的過度增殖，進(jìn)而在子宮內(nèi)膜癌的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要的作用［3］。雌激素受體具有ERα和ERβ兩種亞型，ERα和ERβ分別由不同的基因編碼，在細(xì)胞生物學(xué)功能方面可能發(fā)揮不同、甚至相反的作用［4］。已有的研究表明，ERα和ERβ在乳腺癌、卵巢癌等婦科惡性腫瘤中可能具有不同的表達(dá)模式［5-6］。ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)也存在不一致的研究結(jié)果［7-8］。CyclinD1和癌基因蛋白質(zhì)P21作為細(xì)胞周期中重要的調(diào)控因子，均和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。本研究將通過檢測ERα、ERβ以及細(xì)胞周期調(diào)控因子CyclinD1、P21在子宮內(nèi)膜癌組織中的蛋白表達(dá)水平，分析以上蛋白在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)變化，進(jìn)而探索ERα、ERβ以及細(xì)胞周期調(diào)控因子CyclinD1、P21在子宮內(nèi)膜癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2016年1月至2017年12月徐州市中心醫(yī)院婦科就診的子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生以及子宮肌瘤或腺瘤125例。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：（1）子宮內(nèi)膜癌組65例，通過手術(shù)取樣且經(jīng)過病理檢查確診。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO，2009年）標(biāo)準(zhǔn)分期，I期35例，II期18例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例；高分化28例，中分化21例，低分化16例；肌層浸潤深度＜1/2病人35例，肌層浸潤深度≥1/2病人30例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例；組織病理類型為子宮內(nèi)膜樣55例，非子宮內(nèi)膜樣10例。（2）子宮內(nèi)膜不典型增生組30例，因功能失調(diào)性子宮出血行診斷性刮宮術(shù)，并且經(jīng)過病理確診。（3）正常子宮內(nèi)膜組30例，取自子宮肌瘤或腺肌瘤病人，通過全子宮手術(shù)切除獲得正常子宮內(nèi)膜。所有病人臨床病理資料完整，術(shù)前未行放療、化療及激素等治療，無合并癥及并發(fā)癥。所有納入研究的病人或其近親屬均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2免疫組織化學(xué)檢測免疫組織化學(xué)檢測所用到的ERα、ERβ、CyclinD1和P21一抗抗體均購于abcam公司。采用兔二步法檢測試劑盒（中衫金橋公司）進(jìn)行，簡要步驟如下：子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本在10%甲醛中浸泡固定，石蠟包埋，連續(xù)3～4 μm切片。石蠟切片梯度乙醇脫蠟后進(jìn)行高壓、高溫抗原修復(fù)，加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。ERα、CyclinD1和P21一抗抗體與PBS按照1∶200稀釋，ERβ一抗抗體與PBS按照1∶50稀釋后，分別滴加到標(biāo)本上，4度過夜孵育。加入二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片觀察。預(yù)實(shí)驗(yàn)中陽性染色的切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3免疫組織化學(xué)結(jié)果判定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法對染色結(jié)果進(jìn)行判讀計分。ERα、ERβ、CyclinD1和P21陽性染色均主要定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)棕黃色顆粒狀染色。在顯微鏡（×400）下隨機(jī)觀察10個高倍鏡視野，每個視野觀察100個細(xì)胞，找出陽性細(xì)胞個數(shù)，計算陽性率。以陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行如下劃分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為（-），10%～25%為（+），26%～75%為（++），＞75%為（+++）。最終判定標(biāo)準(zhǔn)：（-）記為陰性，（+）、（++）、（+++）均記為陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗(yàn)比較各組間蛋白陽性表達(dá)率之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ERα、ERβ、CyclinD1和P21蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異我們通過免疫組化檢測了ERα、ERβ、CyclinD1和P21四種蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERα、ERβ、CyclinD1和P21蛋白在三組間的陽性表達(dá)率均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但各個蛋白在三組間的表達(dá)變化趨勢不同。ERα在三組間的陽性表達(dá)率依次為：子宮內(nèi)膜不典型增生＞正常子宮內(nèi)膜＞子宮內(nèi)膜癌，ERβ和P21在三組間的陽性表達(dá)率依次為：正常子宮內(nèi)膜＞子宮內(nèi)膜不典型增生＞子宮內(nèi)膜癌，CyclinD1在三組間的陽性表達(dá)率依次為：子宮內(nèi)膜癌＞子宮內(nèi)膜不典型增生＞正常子宮內(nèi)膜（表1）。

2.2ERα和ERβ蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性我們分析了ERα和ERβ蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERα與病理分期、分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型均有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ERα在Ⅲ～Ⅳ期、低分化、肌層浸潤深度≥1/2以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率降低，且在子宮內(nèi)膜樣組織中具有較高的陽性表達(dá)率。ERβ與病理分期有關(guān)，在Ⅲ～Ⅳ期組織中的陽性表達(dá)率低于Ⅰ～Ⅱ期病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但是與ERα不同，ERβ與分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型均無明顯關(guān)聯(lián)（P＞0.05）（表2）。

2.3CyclinD1和P21蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性我們進(jìn)一步分析了細(xì)胞周期因子CyclinD1和P21蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CyclinD1與分化程度和肌層浸潤深度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。P21與病理分期、分化程度和肌層浸潤深度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CyclinD1在低分化和肌層浸潤深度≥1/2的子宮內(nèi)膜癌組織中具有較高的陽性表達(dá)率，而P21與之相反，在Ⅰ～Ⅱ期、高中分化以及肌層浸潤深度＜1/2的組織中具有較高的陽性表達(dá)率（表3）。

3 討論

雌激素受體是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分子，受到雌激素的激活進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［11］。經(jīng)典的雌激素核受體主要包括ERα和ERβ，分別由ESR1和ESR2兩種不同的基因編碼［11］。盡管ERα和ERβ在多種組織中陽性表達(dá)，但是研究發(fā)現(xiàn)ERα和ERβ卻有著不同的表達(dá)模式。例如，ERα在子宮內(nèi)膜細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及卵巢間質(zhì)細(xì)胞中陽性表達(dá)，而ERβ則在卵巢顆粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及腎臟、骨骼等組織中廣泛表達(dá)［12］。在細(xì)胞生物學(xué)功能方面，ERα和ERβ也具有不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，ERα在乳腺癌和肝癌細(xì)胞中可以介導(dǎo)雌激素誘導(dǎo)的促有絲分裂信號，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［13-14］；而Strom等研究發(fā)現(xiàn)ERβ可以抑制雌激素對乳腺癌細(xì)胞的促增殖作用［15］；Bossard等［16］對卵巢癌體內(nèi)外的研究顯示，ERβ表達(dá)可以減少磷酸化AKT、CyclinD1，從而影響卵巢癌細(xì)胞周期以及促進(jìn)凋亡。由此可見，ERα可以介導(dǎo)雌激素的促增殖作用、ERβ則介導(dǎo)雌激素的促凋亡效應(yīng)。

表1 ERα、ERβ、CyclinD1和P21蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生和正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)/例（%）

表2 ERα和ERβ蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性/例（%）

在子宮內(nèi)膜癌研究領(lǐng)域中，國內(nèi)外有關(guān)ERα的研究較多，ERβ相關(guān)研究相對較少。但ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)變化依然存在不一致的結(jié)果。例如，Knapp等［7］研究發(fā)現(xiàn)，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中均表達(dá)上調(diào)。而袁俐等研究表明ERα在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達(dá)率低于正常組織［17］；姚微等研究也表明ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)，且ERβ表達(dá)下調(diào)可能是由啟動子區(qū)域甲基化所介導(dǎo)［18］。因此，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)模式還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

表3 CyclinD1和P21蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的相關(guān)性/例（%）

我們的研究發(fā)現(xiàn)，ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率均低于正常子宮內(nèi)膜組織。有趣的是，與正常子宮內(nèi)膜相比，ERα在子宮內(nèi)膜不典型增生組織中陽性表達(dá)率上調(diào)，而在子宮內(nèi)膜癌組織中卻出現(xiàn)較低的陽性表達(dá)率。子宮內(nèi)膜不典型增生是子宮內(nèi)膜癌的癌前病變，部分不典型增生經(jīng)過較長時間后可以進(jìn)展為子宮內(nèi)膜癌［19］。ERα在子宮內(nèi)膜不典型增生組織中陽性表達(dá)率高于正常組織，提示ERα可能在子宮內(nèi)膜癌早期腫瘤形成過程中發(fā)揮著促癌的作用。進(jìn)一步，我們通過分析ERα和ERβ子宮內(nèi)膜癌病人臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ERα在I～I(xiàn)I期、高中分化的子宮內(nèi)膜癌病人組織中陽性表達(dá)率依然較高，而主要在Ⅲ～Ⅳ期以及低分化的子宮內(nèi)膜癌病人組織中出現(xiàn)較低的陽性表達(dá)率。說明ERα可能在早期子宮內(nèi)膜癌病人組織中陽性表達(dá)率依然較高，僅在晚期子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)降低。因此我們推測，在子宮內(nèi)膜不典型增生以及早期子宮內(nèi)膜癌中，ERα可能通過介導(dǎo)雌激素活性進(jìn)而扮演著促癌的角色；在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展為晚期的過程中，由于腫瘤異質(zhì)性以及ERα對雌激素敏感性的改變，出現(xiàn)更多ERα陰性表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，間接導(dǎo)致ERα蛋白陽性表達(dá)率降低。ERβ在子宮內(nèi)膜不典型增生以及子宮內(nèi)膜癌病人組織中均呈現(xiàn)低表達(dá)，提示ERβ不同于ERα，在子宮內(nèi)膜癌腫瘤形成及進(jìn)展過程中可能具有抑癌基因的作用。ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌中具體的生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步的細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)功能的研究確認(rèn)。

CyclinD1和P21蛋白均為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；P21蛋白則可作為細(xì)胞周期抑制蛋白，使細(xì)胞周期停滯在G1期，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20］。研究表明，CyclinD1可以作為腫瘤進(jìn)展惡化的分子標(biāo)志物，而P21則可以作為腫瘤病人良性預(yù)后的標(biāo)志物［21-22］。因此，我們還探討了CyclinD1和P21在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義。我們發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率升高，P21在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)率則降低；CyclinD1陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌分化程度及肌層浸潤深度正相關(guān)，而P21則與病理分期、分化程度以及肌層浸潤深度負(fù)相關(guān)。在較早的研究中，廖秀芳等發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且在低分化、有淋巴轉(zhuǎn)移以及晚期子宮內(nèi)膜癌組織中過度表達(dá)［9］；韋瑞紅等研究發(fā)現(xiàn)，P21在正常子宮內(nèi)膜-不典型增生-子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展過程中表達(dá)依次降低［10］。我們的結(jié)果與之類似，均提示在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中，CyclinD1在子宮內(nèi)膜癌中可能發(fā)揮促進(jìn)癌癥形成及進(jìn)展的作用，P21在子宮內(nèi)膜癌中則可能發(fā)揮抑制癌癥形成及進(jìn)展的作用。有研究表明，二甲雙胍可以顯著下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ERα的表達(dá)而上調(diào)ERβ的表達(dá)，并進(jìn)一步抑制雌激素誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖［23］。此外，二甲雙胍對腫瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響可能與CyclinD1和P21等細(xì)胞周期調(diào)控因子有關(guān)［24］。因此，在子宮內(nèi)膜癌中，CyclinD1和P21有可能作為ERα、ERβ下游的細(xì)胞周期調(diào)控因子，但是ERα、ERβ能否直接調(diào)控CyclinD1、P21的表達(dá)還有待于進(jìn)一步研究。

本研究也存在一定的局限性。由于組織樣本收集受到病人例數(shù)、病人是否愿意參與研究等因素的影響，因此本研究納入的病例與對照的樣本量有限，尤其按照臨床特征分組后各組樣本量變小，較小的樣本量可能不能保證足夠的統(tǒng)計效能。因此在我們后續(xù)的研究中，將增加組織樣本的收集，對ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)模式進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示，ERα和ERβ在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生以及子宮內(nèi)膜癌組織中可能具有不同的表達(dá)模式，ERα和ERβ可能在子宮內(nèi)膜癌腫瘤形成及進(jìn)展過程中發(fā)揮不同的作用。深入了解ERα和ERβ在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展各個階段的生物學(xué)作用和機(jī)制，可能為子宮內(nèi)膜癌的精準(zhǔn)治療提供有效的靶點(diǎn)和思路。