路霞林，宋熙薇，曹參，王楠

作者單位：解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥品科，江蘇 南京 210002

心血管疾病是終末期腎臟?。‥SRD）病人死亡的主要原因［1］。近年來，隨著電子束CT等一些新的檢測方法在臨床實踐中的應(yīng)用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ESRD病人的血管鈣化問題非常突出。透析人群中約有54%～100%（平均83%）的病人存在不同程度冠狀動脈鈣化，此比例顯著高于年齡相同的普通人群甚至臨床上懷疑心絞痛的腎功能正常的病人［2-3］。血管鈣化會促進血栓的形成、增加血管僵硬度，降低血管順應(yīng)性，增加脈壓和促進動脈粥樣硬化斑塊破裂等嚴重后果［3］。血管鈣化的出現(xiàn)被認為是動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的標志之一，同樣也是心血管疾病的重要危險因素。除了一些傳統(tǒng)因素如高血壓，高脂血癥和糖尿病外，ESRD病人血管鈣化的原因很多。近年來，更多的臨床證據(jù)表明，高磷、高鈣血癥和大量鈣磷沉積與血管鈣化密切相關(guān)。高鈣、高磷血癥導(dǎo)致血管鈣化形成的機制尚不明確。近年來關(guān)于細胞生物學(xué)和血管影像學(xué)的研究表明，血管鈣化與骨發(fā)育類似，是高度可調(diào)控的主動的生物學(xué)過程，主要特征是血管壁細胞、尤其是血管中層的平滑肌細胞的成骨樣轉(zhuǎn)變，但迄今血管鈣化的具體發(fā)病機制尚未完全闡明［4］。

白細胞介素10（IL-10）可以由多種免疫細胞產(chǎn)生，例如單核巨噬細胞，樹突細胞和巨噬細胞。近10年的研究證實IL-10是一種關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)因子，具有強大的抗炎作用，它可以抑制活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素1α（IL-1α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、單核細胞趨化蛋白等炎癥介質(zhì)［5］，并且目前研究證實IL-10通過抑制T細胞核因子c1（NFATc1）的表達從而抑制破骨細胞生成［6］。血管壁中的鈣化由沉積骨基質(zhì)的成骨細胞和負責基質(zhì)再吸收的破骨細胞調(diào)節(jié)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，鈣化血管中的破骨細胞積聚增加，并且伴隨著巨噬細胞浸潤減少。推測原因可能是血管鈣化過程中巨噬細胞向破骨細胞分化造成的［8］。破骨細胞的生成以及功能受到抑制在血管鈣化形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而IL-10在這一過程中具體發(fā)揮的作用目前尚不清楚。本研究自2017年6月至2018年8月年通過高磷高鈣誘導(dǎo)大鼠胸主動脈平滑肌細胞（VSMCs）鈣化，觀察IL-10對大鼠胸VSMCs鈣化的作用并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組鈣濃度測定、堿性磷酸酶（ALP）活性測定、茜素紅染色分為4組，包括空白對照組（Ctrl）、高磷高鈣處理組（HCa+P）、20 ng/mL IL-10處理組（20 ng/mL IL-10）和高鈣高磷加20 ng/mL IL-10處理組。蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）和實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real time PCR）分為3組，包括空白對照組（Ctrl）、高磷高鈣處理組（HCa+P）、高鈣高磷加20 ng/mL IL-10處理組。其中鈣濃度測定、ALP活性測定、茜素紅染色實驗每組樣本量為12，Western Blot實驗每組樣本量為3，Real time PCR實驗每組樣本量為6。本研究大鼠處置方法符合動物倫理學(xué)原則。

1.2 大鼠胸VSMCs的提取無菌分離180～200g SD大鼠（n＝10）（購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）主動脈中膜，組織貼塊法原代和傳代培養(yǎng)VSMCs，實驗選用傳代的3～6代VSMC，并且以20%體積分數(shù)小牛血清培養(yǎng)的VSMC選為指數(shù)增殖細胞。通過相差顯微鏡的形態(tài)學(xué)特征判斷和抗肌動蛋白單克隆抗體標記的免疫細胞化學(xué)染色證實培養(yǎng)的細胞沒有內(nèi)皮細胞和成纖維細胞混雜。

1.3 體外高磷高鈣誘導(dǎo)大鼠VSMCs鈣化模型的構(gòu)建配置高磷高鈣培養(yǎng)基：DMEM（含HEPES）高糖培養(yǎng)基，含1%青/鏈霉素，1%磷酸緩沖鹽溶液（PBS），1.5 mmol/L氯化鈣，2.0 mmol/L磷酸鹽（Pi）。IL-10（R&D公司，美國）用DMEM培養(yǎng)基溶解后加入上述培養(yǎng)基中，使其終濃度為20 ng/mL。用高磷高鈣培養(yǎng)基處理大鼠胸VSMC 3 d。

1.4 細胞鈣濃度測定用PBS將12孔板中培養(yǎng)的細胞清洗3次，向各孔中加入500 μL 0.6mol/LHCl，在4℃下振蕩24 h。操作步驟采用試劑盒：Quanti-ChromCalcium Assay Kit（DICA-500，QuantiChrom 公司，美國）的說明。配置工作液，將AB液體一比一混勻，避光。取每個樣品及標準品5 μL，分別加入96孔板，后加入200μL工作液，室溫振蕩3 min。使用SynergyTM2 microplate reader酶標儀（BioTek公司，美國）讀取612nm處吸光度。預(yù)冷PBS沖洗12孔板3次，加入0.1 mol/L NaOH/0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS），將每孔細胞刮下，4℃11 600 r/min離心20min，取上清使用BCA法測蛋白濃度。鈣濃度值計算：標準化鈣濃度＝絕對鈣濃度/蛋白濃度。

1.5 ALP活性的測定收取24孔板中培養(yǎng)的細胞，各孔添加125 μL 0.05%的曲拉通X-100，凍融3次。收集每孔液體，在4℃以15 000 r/mim離心15 min。操作步驟采用使用ALP試劑盒（WAKO公司，日本）。用標準品和雙蒸水制作標準曲線，將20 μL樣品加入96孔板中，加入100 μL底物緩沖液，振蕩2 min，37℃孵育15 min；加入80 μL反應(yīng)終止液，振蕩1 min，使用SynergyTM2 microplate reader酶標儀（BioTek公司，美國）測量405 nm處的吸光度（OD）值。BCA法檢測樣品的總蛋白濃度，計算相對ALP活性。

1.6 茜素紅染色吸取12孔板培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次；室溫下多聚甲醛固定10 min，用PBS漂洗3次；使用95%乙醇室溫固定細胞20～30 min，進一步用去離子水漂洗3遍；茜素紅S（pH 4.2，合肥博美生物）染色1 min，觀察有無紅色結(jié)節(jié)出現(xiàn)，若有終止染色，若無繼續(xù)染色；去離子水洗數(shù)次，洗凈非特異性棕色染色為止，拍照留取圖像。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)提取大鼠VSMCs的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（Takara公司，日本）進行逆轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR使用Prism 7900（ABI公司，美國）系統(tǒng)。Taqman探針BMP2（#23 cat.no.04686977001）、骨鈣素（osteocalcin，OCN（#133 cat.no.04694171001））和 Runx2（#66cat.no.04688651001）來自Roche公司（瑞士）。所有熒光定量PCR反應(yīng)均重復(fù)3次，并將檢測基因與管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）標準化。根據(jù)對照組將CT值進行歸一化，計算各處理組CT值。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）提取大鼠VSMCs的蛋白，使用Cytoplasmic Extraction Reagents細胞裂解液（Thermo公司，美國）。細胞裂解產(chǎn)物使用10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Roche，瑞士）上，使用5%牛血清白蛋白（BSA）溶液封閉后，4℃孵育目標蛋白抗體過夜，孵育相對應(yīng)辣根過氧化物酶（HRP）耦聯(lián)二抗。使用顯影液（SuperSignal?West Femto Maximum Sensitivity Substrate，Thermo公司，美國），ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）曝光。Image Lab?軟件用于條帶灰度分析。使用的抗體如下：RUNX2抗體（1∶1 000，#12556）、p-Smad1/5抗體（1∶1 000，#9516）、Smad1/5抗體（1∶1 000，#8685）、Rankle抗體（1∶1 000，#4816）、p65抗體（1：1000，#8242）、GAPDH抗體（1∶1 000，#5174）、和 NFATc1抗體（1∶1 000，#5861）（Cell Signaling Technology公司，美國），HRP標記的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（1∶5 000，Cell Signaling Technology公司，美國）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。測量數(shù)據(jù)是所有測量數(shù)據(jù)并且由±s描述。使用單因素方差分析和多重比較LSD檢驗進行多組數(shù)據(jù)的比較。P＜0.05被認為數(shù)值間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-10促進高磷高鈣誘導(dǎo)的大鼠胸VSMCs鈣化細胞內(nèi)鈣含量測定結(jié)果表明，高磷和高鈣處理顯著誘導(dǎo)大鼠平滑肌細胞的鈣化，與高磷和高鈣處理組相比，IL-10（20 ng/mL）處理組增加了細胞內(nèi)鈣含量（P＜0.01），并且IL-10單獨處理組顯示IL-10對基礎(chǔ)狀態(tài)下的大鼠平滑肌細胞中鈣含量沒有影響（圖1A）。ALP活性結(jié)果表明，高磷和高鈣處理顯著增加大鼠平滑肌細胞ALP的活性，在IL-10治療組中，與高磷和高鈣處理組相比，細胞中ALP活性顯著增加（P＜0.01），IL-10單獨處理組顯示IL-10對基礎(chǔ)狀態(tài)下的大鼠平滑肌細胞中ALP活性沒有影響（圖1B）。茜素紅染色結(jié)果顯示，高磷和高鈣處理組茜素紅染色呈陽性，觀察到鈣結(jié)節(jié)。IL-10可以顯著加重大鼠平滑肌細胞的鈣化程度（圖1C）。

2.2 IL-10促進大鼠平滑肌細胞的成骨樣分化Realtime PCR結(jié)果顯示，高磷和高鈣可顯著誘導(dǎo)大鼠平滑肌細胞中成骨分化指標RUNX2，BMP2和OCN的表達。IL-10處理增加了RUNX2，BMP2以及OCN的激活，從而促進了平滑肌細胞的成骨樣分化程度（圖2）。

2.3 IL-10刺激后成骨細胞分化相關(guān)蛋白的表達Western Blot結(jié)果顯示，高鈣和高磷處理顯著激活了RUNX2、p-Smad1/5、Rankle、NFATC1以及p65的表達。IL-10處理后促進了RUNX2、p-Smad1/5、p65的激活，抑制了Rankle與NFATC1的表達，發(fā)揮了顯著促成骨分化作用（圖3）。

圖1 IL-10對血管平滑肌鈣化的促進作用：A為細胞內(nèi)鈣含量的測定；B為細胞內(nèi)ALP活性的測定；C為茜素紅染色結(jié)果

圖2 IL-10對成骨樣分化的促進作用：A～C為RUNX2、BMP2和OCN的mRNA表達水平

圖3 IL-10對成骨細胞分化相關(guān)蛋白表達的影響：A為Western Blot檢測成骨分化相關(guān)分子；B為細胞總蛋白Western Blot統(tǒng)計；C為細胞核蛋白Western Blot統(tǒng)計

3 討論

血管鈣化是心血管疾病的非常重要的危險因素之一。血管鈣化過程不是被動的，而是類似于骨形成和骨發(fā)育的主動調(diào)節(jié)過程。血管平滑肌細胞出現(xiàn)向成骨樣細胞表型的轉(zhuǎn)化，是血管鈣化發(fā)生的細胞生物學(xué)基礎(chǔ)。大量的研究表明，慢性腎病病人伴隨的高磷血癥及高血漿鈣磷沉積可顯著增加心血管病的發(fā)生率和死亡率，而其機制尚不清楚。在多個研究中，IL-10已被證實是血管鈣化的獨立危險因素［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-10可促進高磷和高鈣誘導(dǎo)的血管平滑肌鈣化，并且主要通過促進高磷和高鈣誘導(dǎo)下血管平滑肌細胞成骨樣分化而發(fā)揮作用。VSMCs是血管鈣化的中心環(huán)節(jié)，國內(nèi)外關(guān)于IL-10直接作用的研究甚少。

BMP2是成骨細胞分化最重要的調(diào)控蛋白，體內(nèi)、外均能誘導(dǎo)多種前體細胞發(fā)生成骨、軟骨細胞表型分化。它通過自分泌、旁分泌方式作用于細胞膜上的BMPR1和BMPR2受體，主要經(jīng)Smad1，5的磷酸化和轉(zhuǎn)移，將信號導(dǎo)入細胞核內(nèi)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Runx2等的活性，后者在成骨細胞表型分化中是必需的［11-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)VSMC給予IL-10刺激后，上調(diào)成骨細胞分化調(diào)節(jié)分子BMP2及鈣化相關(guān)蛋白OPN，蛋白含量檢測結(jié)果與mRNA水平一致。這些特點與成骨細胞生物學(xué)行為一致，提示IL-10體外能夠誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生成骨樣分化。我們同時還發(fā)現(xiàn)lL10刺激上調(diào)成骨分化標志Runx2的表達，蛋白含量檢測結(jié)果與mRNA水平一致，進一步證明了IL-10促進VSMC成骨樣分化的作用。

NFAT家族最初被發(fā)現(xiàn)在骨免疫中發(fā)揮著重要作用，NFATc1是NFAT家族中重要的一員，人類和小鼠的 NFATc1 為全長約 150 kb 的轉(zhuǎn)錄 DNA［13］，NFATc1是破骨細胞分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)破骨細胞方面發(fā)揮著不可替代的作用。NFATc1的表達在成骨與破骨的平衡中發(fā)揮重要作用［14］。并且血管鈣化灶內(nèi)破骨細胞功能的喪失是血管鈣化發(fā)生，加重并且不可逆轉(zhuǎn)的重要原因［15］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-10刺激可以抑制NFATc1以及RANKL的表達，從而阻斷了破骨細胞的形成，抑制了破骨細胞的吞噬活性，從而間接地促進了血管鈣化的發(fā)生。而RANK-RANKL系統(tǒng)同時也是心血管系統(tǒng)鈣化抑制因子，缺乏可發(fā)生血管鈣化［16-17］。本研究結(jié)果提示 VSMCs中的 NFATc1，RANK-RANKL系統(tǒng)可能參與了IL-10介導(dǎo)的血管鈣化過程，IL-10對RANKL的抑制作用不僅促進了血管平滑肌細胞鈣化的發(fā)生，同時抑制了破骨細胞的形成，從而降低了破骨細胞對血管鈣化灶的吞噬吸收作用，進一步促進了血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果首次證實了IL-10體外能夠直接刺激大鼠主動脈血管平滑肌細胞發(fā)生成骨樣分化和鈣化，這一過程伴有BMP2/Smad1，5系統(tǒng)的參與，促進了成骨分化標志Runx2的表達，抑制了促進破骨細胞分化的關(guān)鍵分子NFATc1的表達。IL-10在體內(nèi)的作用廣泛而復(fù)雜，血管鈣化可能通過這一橋梁與其他病理過程相關(guān)，對其進行深入研究將有助于闡明血管鈣化的機制，并為臨床上治療血管鈣化的疾病并發(fā)癥提供潛在的治療靶點。