何 樂(lè),翟少偉,馮建軍，江興龍,肖益群,郭松林

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

鰻(Anguillaspp.),俗稱鰻鱺,隸屬于鰻鱺目鰻鱺科。鰻鱺廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1]，是中國(guó)重要的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一[2]。日本鰻鱺(Anguillajaponica)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受我國(guó)和日本市場(chǎng)的歡迎。由于日本鰻鱺的苗種過(guò)度依賴于捕撈，近年來(lái)該物種年產(chǎn)量嚴(yán)重下降[3]。實(shí)際上，集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致日本鰻鱺細(xì)菌性疾病的發(fā)生日益頻繁，因此也嚴(yán)重影響了鰻鱺的養(yǎng)成[4]。嗜水氣單胞菌是鰻鱺重要的致病菌，常見(jiàn)鰻鱺感染后出現(xiàn)敗血癥的報(bào)道[5]。

有研究表明，真骨魚(yú)類的免疫反應(yīng)過(guò)程受多個(gè)基因的調(diào)控[6]，這些基因被稱為免疫相關(guān)基因。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)魚(yú)類接種滅活疫苗的研究發(fā)現(xiàn)了一些抗細(xì)菌感染相關(guān)的基因。使用福爾馬林滅活的柱狀黃桿菌免疫草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)后，其肝、脾和頭腎中的主要組織相容性抗原(mhc-Ⅰ)、腫瘤壞死因子(tnf-α)、白細(xì)胞介素(il-1β)和干擾素(ifn-Ⅰ)等4種基因的表達(dá)水平均發(fā)生不同程度的變化[7]。有人將嗜水氣單胞菌和大腸桿菌粗制脂多糖分別經(jīng)腹腔注射草魚(yú)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫組草魚(yú)頭腎、脾臟、腎臟、肝臟和腸組織中多種免疫相關(guān)基因均出現(xiàn)不同程度的變化[6]。已有的研究大多是通過(guò)人工感染魚(yú)類得到tnf-α、tlr4和lysC等相關(guān)免疫基因的變化[6，8]，而日本鰻鱺的cox2基因雖然已經(jīng)獲得，但是沒(méi)有進(jìn)一步的研究。迄今為止，未見(jiàn)日本鰻鱺自然感染嗜水氣單胞菌后對(duì)其免疫相關(guān)基因表達(dá)水平影響的相關(guān)報(bào)道。

由于患細(xì)菌性疾病的養(yǎng)殖鰻鱺常死于自然感染，故研究日本鰻鱺自然狀態(tài)下被細(xì)菌感染后的抗感染機(jī)制具有重要意義。本研究從自然發(fā)病的養(yǎng)殖日本鰻鱺脾臟中分離到1株嗜水氣單胞菌，以自然感染嗜水氣單胞菌前后的日本鰻鱺不同組織的cDNA為模板，研究已知的日本鰻鱺4種免疫相關(guān)基因的變化水平，為鰻鱺抵抗嗜水氣單胞菌感染的相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

100尾健康的日本鰻鱺購(gòu)自福建省福清市某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重約為(50±10)g。分別飼養(yǎng)于集美大學(xué)疫苗中心的4個(gè)水族箱中，每箱25尾，每天換水，全天24 h充氧，水溫控制在25 ℃左右。投餌量為鰻鱺體重的0.5%，每天投喂1次。鰻鱺飼養(yǎng)5 d后，取5條鰻鱺作為健康鰻鱺的cDNA模板。鰻鱺飼養(yǎng)約14 d后發(fā)現(xiàn)30%的日本鰻鱺出現(xiàn)脫黏癥狀(見(jiàn)圖1)。取5尾出現(xiàn)明顯癥狀的發(fā)病鰻鱺用于模板cDNA的分離。

1.2 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌操作下，用接種環(huán)挑取自然感染且具有典型患病癥狀的日本鰻鱺脾臟組織直接接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)平板上(接種過(guò)程在超凈工作臺(tái)中嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行無(wú)菌操作)，30 ℃孵育24 h后，挑取平板上的單菌落，并在TSA上劃線以獲得細(xì)菌的純培養(yǎng)，將純化的細(xì)菌菌落保存于TSA瓊脂試管斜面，同時(shí)將其余純培養(yǎng)物移至含有20%甘油的TSB肉湯中，置于-70 ℃凍存。

1.3 分離菌株的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

1.3.1 細(xì)菌基因組DNA的提取

將分離到的細(xì)菌接種于培養(yǎng)基中(TSB)，于搖床中培養(yǎng)24 h(30 ℃)。取適量菌液(1 mL)，離心5 min(12 000 r/min)后棄上清。按照基因組DNA提取試劑盒(GENERAY，上海)的操作手冊(cè)，提取細(xì)菌基因組。

1.3.2 16S rRNA基因的擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的純化

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]，使用通用引物擴(kuò)增分離菌的16S rRNA基因片段。引物(GENERAY，上海)分別為27F :5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用ExTaq聚合酶PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:首先95 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，分別為95 ℃(30 s)，55 ℃(30 s)，72 ℃(60 s)；最后72 ℃徹底延伸7 min。反應(yīng)完成后，待1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶，按照柱式DNA膠回收試劑盒的操作步驟回收PCR 產(chǎn)物(GENERAY，上海)。回收產(chǎn)物送至廈門鉑瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 Real time PCR中所用引物

1.3.3 序列分析與數(shù)據(jù)處理

使用BLAST檢索工具對(duì)分離菌的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)分析(NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。選取其中8種嗜水氣單胞菌和18種本實(shí)驗(yàn)室分離到的氣單胞菌序列，并且根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》選取了19種其他種類的氣單胞菌序列[10]，然后使用MEGA 5.0軟件，通過(guò)鄰接法[11]建立細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 細(xì)菌生理生化鑒定

根據(jù)杭州濱和微生物有限公司的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管使用說(shuō)明，首先參考文獻(xiàn)[12]對(duì)細(xì)菌純化培養(yǎng)物基本生理指標(biāo)進(jìn)行初步測(cè)定，包括：葡萄糖產(chǎn)氣、七葉苷、賴氨酸、精氨酸、甘露醇、蔗糖、V-P反應(yīng)、纖維二糖和鳥(niǎo)氨酸，然后通過(guò)使用Biolog微孔板(Biolog，美國(guó))進(jìn)行物種水平的鑒定。簡(jiǎn)而言之，讓純化的細(xì)菌在Biolog專用培養(yǎng)基瓊脂平板上生長(zhǎng)。從瓊脂平板表面選取1個(gè)細(xì)菌單菌落，并在配套的接種液(IF-A)中懸浮至一定濃度。采用12道加樣槍將細(xì)菌懸浮液移到專用的96孔微孔培養(yǎng)板中(100 μL/孔)。微孔板置于生化培養(yǎng)箱，30 ℃孵育24 h。用BiologMicroStationTM系統(tǒng)讀取微板并與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有細(xì)菌的95個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行比較，從而根據(jù)相似性鑒定細(xì)菌。

1.5 免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析

分別取5尾健康和5尾患病的日本鰻鱺，用1×10-5的丁香酚麻醉后，迅速取粘液、肝、脾、腎等組織置于RNA保護(hù)液(TIANGEN,北京)中，并轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。采用RNA 提取試劑盒(Promega，美國(guó))提取各組織的總RNA，將總RNA樣品進(jìn)行DNA酶I處理，運(yùn)用核酸測(cè)定儀和1.0%的瓊脂電泳檢測(cè)總RNA樣品的濃度和純度。然后采用PrimeScriptTM第一鏈cDNA試劑盒(Promega，美國(guó))合成cDNA(操作過(guò)程參考說(shuō)明書(shū))，合成的cDNA保存于-70 ℃。在定量板中加入配制好的10 μL反應(yīng)體系：SYBR GreenSuperMix 5 μL，超純水3.6 μL，cDNA模板1 μL，正向和反向引物(見(jiàn)表1)各0.2 μL。根據(jù)說(shuō)明書(shū)在LightCycle480系統(tǒng)(Roche，德國(guó))上進(jìn)行所有樣品的擴(kuò)增，簡(jiǎn)而言之，將10 μL的反應(yīng)體系95 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(分別為95 ℃，10 s；55 ℃，25 s；72 ℃，15 s)，最后72 ℃延伸10 min。所得試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法處理完成后，將處理完成后的數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，以所得數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E)為依據(jù)作圖。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株的形態(tài)特征

分離菌株在TSA平板上菌落呈淡黃色、圓形，且邊緣整齊(見(jiàn)圖2)。在電鏡下觀察到其菌落形態(tài)呈短桿狀，類似橢圓形，具極生鞭毛(見(jiàn)圖3)。

2.2 分離菌株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將基因測(cè)序得到的分離菌的16S rRNA部分基因序列，通過(guò)NCBI-blast進(jìn)行相似性比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)分離菌與嗜水氣單胞菌的相似性(99%)最高，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果也顯示了分離菌與嗜水氣單胞菌聚在一組中(見(jiàn)圖4)。

2.3 分離菌株的生理生化鑒定

本次研究對(duì)分離菌進(jìn)行初步檢測(cè)的結(jié)果為葡萄糖產(chǎn)氣，七葉苷、賴氨酸、精氨酸、甘露醇、蔗糖和V-P反應(yīng)為陽(yáng)性，纖維二糖和鳥(niǎo)氨酸為陰性。而B(niǎo)iolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定分離菌與嗜水氣單胞菌的鑒定可能性(PROB)為0.589，相似性指數(shù)(SIM)為0.589，位距(DIST)為6.037，嗜水氣單胞菌部分特征性生理生化指標(biāo)見(jiàn)表2。結(jié)合分子鑒定結(jié)果確定該分離菌為嗜水氣單胞菌。

2.4 免疫基因表達(dá)分析

在肝臟中，各基因的表達(dá)如圖5a表示，與自然狀態(tài)(健康狀態(tài))相比，tlr3基本沒(méi)有變化，tnf有一定程度的上調(diào)，cox2和lysC呈現(xiàn)一定程度的下降。在脾臟中，各基因的表達(dá)如圖5b表示，tlr3、tnf-α和cox2都呈現(xiàn)出一定程度的上調(diào)，lysC出現(xiàn)顯著性的上調(diào)。在腎臟中，各基因的表達(dá)如圖5c表示，tlr3、tnf-α和cox2呈現(xiàn)出一定程度的上調(diào)，lysC出現(xiàn)顯著性的上調(diào)。在粘液中，各基因的表達(dá)如圖5d表示，tlr3、cox2和lysC呈現(xiàn)出一定程度的上調(diào),tnf出現(xiàn)一定程度的下降。

表2 分離菌與嗜水氣單胞菌的生化特征

說(shuō)明：“+”為陽(yáng)性；“-”為陰性；“B”為臨界值。

Notes:“+”is postive；“-”is negative；“B”is borderline.

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌的危害

嗜水氣單胞菌隸屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，可以感染一系列脊椎動(dòng)物，包括人類、爬行動(dòng)物和魚(yú)類[13]，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的病原菌。該菌可引起水產(chǎn)動(dòng)物出現(xiàn)敗血癥，而且還常與其他病原菌共同感染，已經(jīng)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14]。近年來(lái)，關(guān)于青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)[15]、黃沙鱉(Truogxsinensis)[16]、紅點(diǎn)鮭(Salvelinusfominalis)[17]受嗜水氣單胞菌感染并且致病的研究已有報(bào)道。

3.2 分離菌株的鑒定

現(xiàn)今鑒定微生物最常用的方法就是生化鑒定和16S rRNA基因的序列分析。由于16S rRNA基因在細(xì)菌菌屬(種)內(nèi)高度保守，幾乎可以對(duì)所有的細(xì)菌鑒定到屬[18]，但是由于其對(duì)同源種類無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分，不能準(zhǔn)確反映關(guān)系較近的物種間的關(guān)系[19]，所以需要其他鑒定方法作進(jìn)一步的鑒定。Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)菌的原理是通過(guò)細(xì)菌對(duì)糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行判定[20]，多應(yīng)用于土壤和環(huán)境中微生物的檢測(cè)[21]，此方法快速、簡(jiǎn)單，并且省卻了配多種培養(yǎng)基的工作。本研究從患病的日本鰻鱺脾臟中分離純化得到一株優(yōu)勢(shì)菌株，在16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，顯示B101菌株與已報(bào)道的嗜水氣單胞菌聚為一支，但是與本實(shí)驗(yàn)室分離到的B50、B31、B32和B11沒(méi)有聚到一起，推測(cè)可能是細(xì)菌來(lái)源與毒力差異所致。分離菌的初步生理生化鑒定結(jié)果顯示葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇等嗜水氣單胞菌的重要鑒定指標(biāo)均與楊寧等[22]的鑒定結(jié)果一致。Biolog鑒定結(jié)果中有3種重要的參數(shù)，即PROB值、SIM值和DIST值，其中SIM值≥0.75，DIST值≤0.50，PROB值越接近1越好[23]，而本次研究結(jié)果顯示分離菌與嗜水氣單胞菌的PROB值為0.589，SIM值為0.589，DIST值為6.237。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]發(fā)現(xiàn)分離菌株的蔗糖、纖維二糖、水楊甙、山梨醇、醋酸、檸檬酸和果膠均與嗜水氣單胞菌不同，而葡萄糖、D-麥芽糖、甘露糖、甘露醇、明膠、麥芽糖、棉子糖、乳糖和葡萄糖苷等重要指標(biāo)的鑒定結(jié)果與嗜水氣單胞菌的一致，說(shuō)明Biolog系統(tǒng)雖鑒定結(jié)果為嗜水氣單胞菌，但還存在一些差異。由于Biolog鑒定系統(tǒng)的參考菌株來(lái)自歐美等國(guó)，故這些差異很可能源于菌株來(lái)源的地域差異。結(jié)合本研究的生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可以確定分離菌株為嗜水氣單胞菌。

3.3 嗜水氣單胞菌自然感染后對(duì)免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

魚(yú)類免疫系統(tǒng)的主要功能是幫助機(jī)體識(shí)別和清除異物，以及防御和維護(hù)自身穩(wěn)定。魚(yú)類作為低等脊椎動(dòng)物，同樣具有非特異性和特異性免疫應(yīng)答機(jī)制[24]。本次研究選取健康和自然感染嗜水氣單胞菌的日本鰻鱺組織作為cDNA模板，進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)tlr3、tnf-α、lysC和cox2免疫基因的變化。tlr3位于細(xì)胞器膜上,是一種重要的病毒識(shí)別受體[25]，是由T細(xì)胞分泌的，可以參與機(jī)體炎癥與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，有發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行一系列新陳代謝的作用[26]。本次研究結(jié)果顯示日本鰻鱺在感染嗜水氣單胞菌后tlr3和tnf-α基本沒(méi)有顯著性的變化。Liu等[27]的研究結(jié)果表明牙鲆(Paralichthysolivaceus)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)感染嗜水氣單胞菌后，tlr3沒(méi)有顯著性的變化。彭小云等[6]研究發(fā)現(xiàn)草魚(yú)在注射嗜水氣單胞菌粗脂多糖后，其tnf-α也沒(méi)有顯著性的變化。本研究表明自然感染嗜水氣單胞菌的日本鰻鱺tlr3和tnf-α不會(huì)產(chǎn)生顯著性變化。溶菌酶被認(rèn)為是魚(yú)類中重要的抗菌分子之一，可以在機(jī)體免疫過(guò)程中加快細(xì)菌的死亡[28],而C型是溶菌酶的一個(gè)類型。本研究結(jié)果顯示lysC在病鰻的不同組織中呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)，尤其是在腎臟和脾臟中出現(xiàn)顯著性的升高，Ye等[8]曾研究過(guò)草魚(yú)在感染嗜水氣單胞菌后lysC在不同組織中出現(xiàn)一定程度的上調(diào)，推測(cè)這是由于物種或者感染途徑不同所致。cox2參與許多生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞的新陳代謝、免疫應(yīng)答和防止外來(lái)物質(zhì)入侵[29]。本研究結(jié)果顯示自然感染嗜水氣單胞菌的日本鰻鱺cox2不會(huì)產(chǎn)生顯著變化。cox2在魚(yú)類中感染嗜水氣單胞菌的研究較少，有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

綜上所述，自然感染嗜水氣單胞菌的日本鰻鱺，tlr3、tnf-α和cox2沒(méi)有顯著性的變化，lysC則會(huì)出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，尤其是在脾臟和腎臟中，說(shuō)明lysC可以作為感染嗜水氣單胞菌疾病的檢測(cè)指標(biāo)。