李利君，李文靜，于智超，張 婷，李 紅，倪 輝

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021.2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

茶葉是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，根據(jù)加工過(guò)程中茶多酚的變化方式和變化程度的不同，茶葉可分為6大類(lèi)：綠茶(不發(fā)酵)，白茶(微發(fā)酵)，黃茶(輕發(fā)酵)，烏龍茶(半發(fā)酵)，紅茶(全發(fā)酵)，黑茶(后發(fā)酵)[1-2]。其中，烏龍茶是中國(guó)特有的茶類(lèi)，主要品種有：廣東烏龍(鳳凰單樅、鳳凰水仙、嶺頭單樅等)；閩北烏龍(武夷巖茶、水仙、大紅袍、肉桂等)；閩南烏龍(鐵觀音、奇蘭、水仙、黃金桂等)；臺(tái)灣烏龍(凍頂烏龍)[3]。烏龍茶深受消費(fèi)者喜愛(ài)，名優(yōu)特色產(chǎn)品眾多[4]，福建省是最重要的產(chǎn)區(qū)，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了重要推動(dòng)作用。

香氣是評(píng)價(jià)茶葉質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)之一[5]。酶是決定茶葉香氣質(zhì)量的重要因素，茶葉中的內(nèi)源酶如β-櫻草糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶和巢菜糖苷酶等，它們分別催化β-櫻草糖苷、β-D-葡萄糖苷和巢菜糖苷轉(zhuǎn)化成的香氣成分是茶葉香氣品質(zhì)形成的重要途徑[6-8]。此外，相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，夏季烏龍茶經(jīng)外源酶漆酶和α-半乳糖苷酶處理后，其滋味和香氣品質(zhì)均具有明顯的改善[2]，外源酶β-葡萄糖苷酶處理綠茶湯對(duì)其有明顯的增香作用[9]。

黑曲霉(Aspergillusniger)屬于絲狀真菌，被美國(guó)食品藥品管理局(food and drugs administration，F(xiàn)DA)認(rèn)定為安全菌種之一，并且是常用的食品酶制劑生產(chǎn)菌株，它在不同的培養(yǎng)基中發(fā)酵能夠產(chǎn)生多種不同類(lèi)別的胞外酶，包括糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉胞外酶液處理綠茶粉后，2-乙基呋喃和癸醛含量顯著增加，且花香和青草香味增強(qiáng)，整體香氣品質(zhì)顯著改善[9]。但是，目前尚未系統(tǒng)對(duì)比研究不同培養(yǎng)基發(fā)酵的黑曲霉胞外酶液對(duì)茶葉香氣的影響，因此還不明確不同培養(yǎng)基制備的胞外酶液對(duì)茶葉香氣的改良效果，限制了應(yīng)用黑曲霉胞外酶改良茶葉風(fēng)味品質(zhì)的技術(shù)開(kāi)發(fā)。本文以福建特色烏龍茶為研究對(duì)象，采用5種不同培養(yǎng)基(PDA、察氏、果膠、麥麩和柚皮)制備黑曲霉胞外粗酶液，研究不同胞外酶對(duì)茶葉水溶液香氣的影響，為高效制備改良茶葉香氣的黑曲霉胞外酶及開(kāi)發(fā)新型茶葉風(fēng)味改良技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉菌株(編號(hào)為41034)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；麥麩和馬鈴薯購(gòu)于廈門(mén)當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；柚皮粉是由新鮮柚皮烘干后粉碎過(guò)40目篩；食品級(jí)果膠購(gòu)于廈門(mén)唯康食品科技有限公司；秋季鐵觀音烏龍茶葉購(gòu)于廈門(mén)當(dāng)?shù)爻校徽龢?gòu)烷烴(C8～C20)和環(huán)己酮購(gòu)于Sigma-Aldrich(中國(guó))公司；正己醛、苯甲醛、月桂烯、乙酸己酯、檸檬烯、苯乙醛等標(biāo)準(zhǔn)品分別購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich(中國(guó))公司和英國(guó)Alfa Aesar(中國(guó))公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)于上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小型高速藥物粉碎機(jī)，上海燁昌食品機(jī)械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；HQ45B恒溫?fù)u床，中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；JKOPZ電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；QP-2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)儀，日本島津公司；Rtx-5MS毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，美國(guó)Restek公司；HH-157330-U手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、50/30 μm CAR/PDMS萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的制備

稱(chēng)取去皮馬鈴薯200 g，加入約1 L水煮沸20 min，用紗布濾渣后，在馬鈴薯煮出液中加入蔗糖20 g，加水定容至1 L，加入瓊脂18 g，加熱溶解后取5 mL裝入試管，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min制備斜面培養(yǎng)基，接種黑曲霉置于30 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)3～4 d，得到成熟孢子[12]。之后采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%的無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫孢子，并倒入帶有無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%的無(wú)菌氯化鈉溶液振蕩均勻，稀釋至A600= 2.0(孢子濃度約為1×108個(gè)/mL)，即為單孢子菌懸液。

1.3.2 黑曲霉發(fā)酵粗酶液的制備

將孢子懸液接種到以下5種培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)。

1)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)PDA)：稱(chēng)取去皮馬鈴薯200 g并切小塊，再加適量水煮沸20 min，過(guò)濾馬鈴薯渣，濾液中加入20 g葡萄糖，溶解后加水至1 L。量取30 mL制備好的培養(yǎng)基分裝到250 mL的搖瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后接種2 mL孢子懸液(1×108個(gè)/mL)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)6 d。

2)察氏液體培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)察氏)：參照常用察氏培養(yǎng)基配方[12]，準(zhǔn)確稱(chēng)量硝酸鈉3.00 g，磷酸氫二鉀1.00 g，氯化鉀0.50 g，硫酸亞鐵0.01 g，硫酸鎂0.50 g，蔗糖30.00 g，加水定容至1 L。量取30 mL制備好的培養(yǎng)基分裝到250 mL的搖瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后接種2 mL孢子懸液(1×108個(gè)/mL)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)6 d。

3)果膠液體培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)果膠)：參考Thakur等[13]發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的配方，準(zhǔn)確稱(chēng)量氯化鉀0.50 g，七水合硫酸鎂0.10 g，檸檬酸三鈉二水合物1.00 g，無(wú)水檸檬酸1.00 g，酵母提取物1.00 g，干酪素水解物1.00 g，果膠10.00 g，加水定容到1 L，用1 mol/L的HCl調(diào)pH=4.0。量取25 mL分裝到250 mL的搖瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后接種2 mL孢子懸液(1×108個(gè)/mL)，轉(zhuǎn)速180 r/min，30 ℃培養(yǎng)4 d。

4)麥麩固體培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)麥麩)：參考Kumar等[14]發(fā)酵黑曲霉果膠酶和纖維素酶的配方，準(zhǔn)確稱(chēng)量硫酸銨1.00 g，硫酸鎂5.00 g，七水合硫酸亞鐵0.005 g，磷酸二氫鉀5.00 g，溶于1 L超純水中，并調(diào)節(jié)pH=4.8，即為無(wú)機(jī)鹽溶液。準(zhǔn)確量取2.10 g麥麩、1.40 g柚皮和6.5 mL無(wú)機(jī)鹽溶液分裝到250 mL的錐形瓶中，攪拌均勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后接種2 mL孢子懸液(1×108個(gè)/mL)，30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6 d。

5)柚皮粉固體培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱(chēng)柚皮)：參考本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)酵棘孢曲霉的配方[15]。準(zhǔn)確稱(chēng)量柚皮粉5.00 g，硫酸銨0.50 g，并加入8 mL水溶解，然后分裝到250 mL錐形瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后接種2 mL孢子懸液(1×108個(gè)/mL)，30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8 d。

發(fā)酵完成后，將液體培養(yǎng)基制備的發(fā)酵液進(jìn)行抽濾去除菌體，得到粗酶液(PDA粗酶、察氏粗酶、果膠粗酶)，放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。麥麩和柚皮的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中分別加入30 mL的pH=7.0的磷酸鹽緩沖液，20 ℃、180 r/min振蕩洗脫1 h后進(jìn)行抽濾，制備得到麥麩粗酶和柚皮粗酶，放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 黑曲霉發(fā)酵粗酶液處理烏龍茶水溶液

稱(chēng)取2 g烏龍茶葉置于50 mL萃取瓶中，同時(shí)加入30 mL粗酶液，再加入10 μL環(huán)己酮(1 g/L)作為內(nèi)標(biāo)，擰緊瓶蓋后，置于40 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min?？瞻讓?duì)照分別為：1)烏龍茶葉中加入30 mL超純水；2)30 mL酶液加上2 mL水。

1.3.4 烏龍茶水溶液揮發(fā)性成分的固相微萃取及GC-MS分析

將50/30 μm CAR/PDMS萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口中，230 ℃老化3 min，載氣的流量為3 mL/min。將老化后的萃取頭插入萃取瓶并停留在萃取瓶頂空部分，吸附20 min。吸附完成后，將固相微萃取頭插到氣相色譜的進(jìn)樣口解吸3 min，按照如下條件進(jìn)行GC-MS分析。

色譜柱為Rtx-5MS(60 m×0.32 mm×0.25 μm)，以高純氦氣(純度99.999%)作為載氣，進(jìn)樣口溫度為230 ℃，不分流進(jìn)樣。柱流量設(shè)為3 mL/min，柱溫度初始為50 ℃保持2 min，2 ℃/min升溫至120 ℃，再5 ℃/min升溫至200 ℃，在200 ℃保持1 min。離子源溫度為220 ℃，電離方式為EI，電離能量為0.80 kV，接口溫度為250 ℃，掃描方式選擇SCAN模式進(jìn)行定性分析，離子碎片的掃描范圍(m/z)為35～500。溶劑延遲時(shí)間為1.5 min。

對(duì)揮發(fā)性成分采用3種方式進(jìn)行定性：1)運(yùn)用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(NIST08、NIST08s、FFNSC1.3)進(jìn)行相似度檢索，根據(jù)不同物質(zhì)的基峰、質(zhì)荷比以及相對(duì)峰度進(jìn)行串連檢索與人工解析，根據(jù)質(zhì)譜匹配度大于80%的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行物質(zhì)鑒定；2)將待測(cè)物質(zhì)的特征離子與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性；3)計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)，與文獻(xiàn)報(bào)道及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比定性。保留指數(shù)運(yùn)算參考Dool等[16]的方法：RIx=100n+100[t(m)-t(n)]/[t(n+1)-t(n)]，式中：RIx為待測(cè)定成分的保留指數(shù)；t(m)為待測(cè)成分的調(diào)整保留時(shí)間；t(n)表示具有n個(gè)碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時(shí)間；t(n+1)表示具有n+1個(gè)碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時(shí)間。

定量分析時(shí)質(zhì)譜掃描方式設(shè)為SIM模式，具有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用的該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線用外標(biāo)法定量；不具有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物通過(guò)計(jì)算與環(huán)己酮峰面積的比值來(lái)進(jìn)行相對(duì)定量。

在定性分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步計(jì)算香氣強(qiáng)度值(odour activity value，OAV)用于評(píng)價(jià)香氣貢獻(xiàn)成分，其計(jì)算公式為：OAV=揮發(fā)性物質(zhì)濃度/風(fēng)味閾值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

參照相關(guān)文獻(xiàn)[17]，通過(guò)Microsoft Office Excel 2010 軟件計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并繪制相關(guān)圖表，利用SPSS 19.0軟件對(duì)揮發(fā)性成分含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分的定性分析

對(duì)黑曲霉粗酶液處理前后的烏龍茶水溶液揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析，得到其總離子流圖(見(jiàn)圖1)，根據(jù)相似度檢索、特征離子碎片、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)并參考相關(guān)文獻(xiàn)，共鑒定出28種揮發(fā)性成分(見(jiàn)表1)，包括酯類(lèi)10種、醛類(lèi)4種、醇類(lèi)5種、烯烴類(lèi)6種和其他類(lèi)化合物3種。由此可知，主要揮發(fā)性成分為酯類(lèi)、醛類(lèi)和醇類(lèi)，這與有關(guān)研究[18]對(duì)烏龍茶葉揮發(fā)性成分種類(lèi)的研究結(jié)果基本一致。

表1 黑曲霉粗酶液處理烏龍茶水溶液揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果

序號(hào)Number保留時(shí)間Retentiontime/min揮發(fā)性成分Volatiles保留指數(shù)aRetention index a保留指數(shù)bRetention index b特征離子碎片Characteristicion fragment鑒定依據(jù)Identificationbasis15.79正己醛Hexanal802802444156Std MS27.52順式-3-己烯醇3-cis-hexenol853843674182MS312.21苯甲醛Benzaldehyde95996610510677Std MS413.84月桂烯Myrcene9919904193136Std MS515.20乙酸己酯Hexyl acetate10151014436184Std MS615.75p-傘花烴P-Cymene1024102811913491MS716.02檸檬烯Cinene102810296813693Std MS816.71順式-β-羅勒烯β-cis-Ocimene10381038939291MS916.94苯乙醛Phenyl acetaldehyde104410499192120Std MS1017.37反式-β-羅勒烯β-trans-ocimene10491048939180MS1120.53芳樟醇Linalool11011104714393Std MS1221.38苯乙醇Phenylethyl alcohol111311119112265MS1323.09苯乙腈Phenyl acetonitrile113911441179063Std MS1425.24苯甲酸乙酯Ethyl benzoate1171117010515077Std MS1526.38順式-丁酸-3-己烯酯3-cis-hexe-nyl isobutanoate11881188678243MS1629.20橙花醇Nerol12301227694193MS1729.442-甲基丁酸葉醇酯cis-3-hexenyl 2-methylbutyate12341231678257MS1829.98順式-檸檬醛cis-citral124212424169109Std MS1930.12L-香芹酮L-carvone124412508254150Std MS2030.62己酸異戊酯Isopentyl-hexanoate12521251704399MS2133.49吲哚Indole129512951179089Std MS2238.99己酸葉醇酯cis-3-hexenyl hexanoate138613804369117Std MS2339.25己酸己酯Hexyl hexanoate1390138843200117Std MS2439.67異丁酸苯乙酯Phenethyl isobutyrate139713961044371Std MS2543.552-甲基丁酸-2-苯乙酯Phenethyl 2-methylbutyrate149114897757104MS2644.31α-法呢烯α-Farnesene151215059320441MS2746.08橙花叔醇Nerolidol15691564694193Std MS2846.32苯甲酸葉醇酯cis-3-hexenyl benzoate1576157382105123MS

說(shuō)明：保留指數(shù)為Rtx-5MS色譜柱結(jié)果；保留指數(shù)a為本研究得到的數(shù)值，保留指數(shù)b為文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)值；Std為標(biāo)準(zhǔn)品定性，MS為質(zhì)譜庫(kù)檢索結(jié)果，文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)均來(lái)源于網(wǎng)站(http://webbook.nist.gov/chemistry)。

Notes:The retention index is the result of Ttx-5MS;the retention index a is the value obtained in this study;the retention index b is the value reported in the literature;Std is the standard qualitative;MS is the mass spectral library search result,and the retention index of the literature is derived from the website(http://webbook.nist.gov/chemistry).

2.2 揮發(fā)性成分的定量分析

由表2可知，烏龍茶水溶液、PDA酶處理組、察氏粗酶處理組、果膠粗酶處理組、麥麩粗酶處理組和柚皮粗酶處理組分別鑒定出25，26，26，27，28和27種揮發(fā)性成分。

表2 黑曲霉粗酶液處理烏龍茶水溶液的揮發(fā)性成分定量分析結(jié)果

說(shuō)明：該序號(hào)為定性表中對(duì)應(yīng)的序號(hào)；A為采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量；每一行中，不同的字母(a，b，c，d，e)代表數(shù)值間存在著顯著性差異(P<0.05)。

Notes:The serial number is the corresponding serial number in the qualitative table;A is quantified by the internal standard method;different letters(a,b,c,d,e)represent significant.

對(duì)于酯類(lèi)物質(zhì)，烏龍茶水溶液中含量較高的(≥100 μg/kg)為乙酸己酯、苯甲酸乙酯、順式-丁酸-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、2-甲基丁酸-2-苯乙酯和苯甲酸葉醇酯。與烏龍茶水溶液相比，麥麩粗酶處理組酯類(lèi)物質(zhì)中的順式-丁酸-3-己烯酯和2-甲基丁酸葉醇酯含量分別增加了24 μg/kg和63 μg/kg；柚皮粗酶處理組中的順式-丁酸-3-己烯酯、2-甲基丁酸葉醇酯、己酸異戊酯、2-甲基丁酸-2-苯乙酯和苯甲酸葉醇酯含量均顯著增加。茶葉中酯類(lèi)是由于脂氧合酶介導(dǎo)脂質(zhì)氧化而產(chǎn)生的[8]，這表明在麥麩粗酶和柚皮粗酶中可能存在脂氧合酶。

烏龍茶水溶液中醛類(lèi)物質(zhì)含量較高的(>500 μg/kg)為正己醛和苯乙醛。與烏龍茶水溶液相比，察氏粗酶處理組和果膠粗酶處理組醛類(lèi)物質(zhì)中的正己醛含量分別增加了482和308 μg/kg，且5種粗酶處理后苯乙醛含量均顯著增加。此外，在麥麩粗酶處理組中增加了苯甲醛。相關(guān)研究[19]發(fā)現(xiàn)，茶葉中存在香氣化合物的單糖苷和二糖苷類(lèi)前體，并已知苯甲醛的糖苷前體為野黑櫻苷(β-D-苯乙腈葡萄糖苷)。同時(shí)，相關(guān)研究[18，20]表明，β-葡萄糖苷酶和黑曲霉胞外酶液處理速溶烏龍茶粉后，苯甲醛、苯乙醛和香葉醇含量顯著增加。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比說(shuō)明，不同培養(yǎng)基制得的粗酶液中含有不同種類(lèi)糖苷酶水解酶。

烏龍茶水溶液中醇類(lèi)物質(zhì)含量較高的(>100 μg/kg)為芳樟醇、苯乙醇和橙花叔醇。與之對(duì)比，柚皮粗酶處理組中芳樟醇和橙花叔醇的含量分別增加了141和4931 μg/kg；麥麩粗酶處理組中苯乙醇含量增加了537 μg/kg；果膠粗酶處理組、麥麩粗酶處理組和柚皮粗酶處理組中新增了順式-3-己烯醇化合物。此外，5種粗酶液處理都可以產(chǎn)生橙花醇化合物。相關(guān)文獻(xiàn)[20]報(bào)道，苯乙醇的前體為β-櫻草糖苷類(lèi)物質(zhì)，順式-3-己烯醇的前體為β-葡萄糖苷和β-櫻草糖苷，橙花醇的前體為β-櫻草糖苷。這些研究表明，黑曲霉發(fā)酵粗酶液中可能含有β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶。

烏龍茶水溶液中烯烴類(lèi)物質(zhì)含量較高的(>3000 μg/kg)為p-傘花烴、反式-β-羅勒烯和α-法呢烯，其中α-法呢烯是烏龍茶葉中含量較高的烯烴，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]。與烏龍茶水溶液相比，麥麩粗酶處理組和柚皮粗酶處理組中，α-法呢烯的含量分別增加了2723和2225 μg/kg。已有研究表明[2]，漆酶和α-半乳糖苷酶處理烏龍茶葉能顯著增加α-法呢烯的含量，這表明麥麩粗酶和柚皮粗酶中可能含有漆酶和α-半乳糖苷酶。

此外，烏龍茶水溶液中含量較高的還有吲哚(12 820 μg/kg)，該結(jié)果與Lin等[21]發(fā)現(xiàn)烏龍茶葉具有較高含量的α-法呢烯、橙花叔醇和吲哚的結(jié)果相似。

2.3 揮發(fā)性成分的OAV分析

參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的香氣閾值[10，22-24]，計(jì)算烏龍茶水溶液及黑曲霉粗酶處理后的樣品中揮發(fā)性成分的OAV值，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，烏龍茶水溶液、PDA粗酶、察氏粗酶、果膠粗酶、麥麩粗酶和柚皮粗酶處理組中香氣化合物的總OAV分別為101.0，130.8，138.1，132.1，115.6，142.9，表明黑曲霉粗酶處理烏龍茶水溶液能明顯增加總香氣強(qiáng)度。此外，由圖2和表3可知，醛類(lèi)、醇類(lèi)和烯烴類(lèi)物質(zhì)是烏龍茶水溶液的重要香氣貢獻(xiàn)成分，該結(jié)果與以往報(bào)道烏龍茶中主要香氣化合物為醇類(lèi)和醛類(lèi)是相似的[25]。

醛類(lèi)中，正己醛(OAV=10.1，青草香)和苯乙醛(OAV=5.6，甜香)對(duì)烏龍茶水溶液的香氣具有影響。與烏龍茶水溶液相比，在察氏粗酶和果膠粗酶處理組中，正己醛(察氏粗酶處理組OAV=13.3，果膠粗酶處理組OAV=12.1)的OAV均有增加；在PDA粗酶、察氏粗酶、果膠粗酶、麥麩粗酶和柚皮粗酶處理組中，苯乙醛(PDA粗酶處理組OAV=43.8，察氏粗酶處理組OAV=36.9，果膠粗酶處理組OAV=21.5，麥麩粗酶處理組OAV=8.4，柚皮粗酶處理組OAV=21.2)的OAV也是明顯增加。表明黑曲霉粗酶處理可增加正己醛、苯乙醛的香氣強(qiáng)度值，這兩種成分主要與青草香和甜香有關(guān)。因此，本研究與相關(guān)文獻(xiàn)[9]報(bào)道的PDA培養(yǎng)基發(fā)酵的黑曲霉胞外酶液處理綠茶粉后減弱了青草香和花香是不一致的，其主要原因可能是烏龍茶和綠茶粉的香氣特征及其中存在的香氣前體的差異。

表3 黑曲霉粗酶液處理烏龍茶水溶液的揮發(fā)性成分OAV分析

說(shuō)明：nd表示文獻(xiàn)中未報(bào)道該化合物的閾值。

Notes:nd indicates that the threshold of the compound is not reported in the literature.

醇類(lèi)中，芳樟醇(OAV=1.4，花香)和橙花叔醇(OAV=45.6，花香)對(duì)烏龍茶水溶液香氣具有重要影響。PDA粗酶、果膠粗酶和柚皮粗酶處理組芳樟醇的OAV分別為2.1，2.0，3.0，與烏龍茶水溶液相比明顯增加；在察氏粗酶、果膠粗酶、麥麩粗酶和柚皮粗酶處理組中，橙花叔醇的OAV分別為49.8，59.8，53.3和67.5，與烏龍茶水溶液相比增加明顯。芳樟醇和橙花叔醇主要呈現(xiàn)出花香氣味。因此，黑曲霉粗酶處理后這兩種醇類(lèi)物質(zhì)OAV的增加與相關(guān)研究[9]茶梗培養(yǎng)基發(fā)酵黑曲霉胞外酶液能顯著增加綠茶水溶液花香味的結(jié)果相一致。

烯烴類(lèi)中，p-傘花烴(OAV=19.1，柑橘香)和反式-β-羅勒烯(OAV=6.7，青草香，果香)對(duì)烏龍茶水溶液香氣具有重要影響。在麥麩粗酶和柚皮粗酶處理組中，p-傘花烴的OAV分別為24.4和19.8，反式-β-羅勒烯的OAV分別為8.0和7.2，與烏龍茶水溶液相比增加明顯。該結(jié)果與前人研究[20]發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶顯著增加烏龍茶水溶液的順式-β-羅勒烯和反式-β-羅勒烯的OAVs值是相似的。

3 結(jié)論

從黑曲霉粗酶液處理前后的烏龍茶水溶液中共鑒定出28種揮發(fā)性化合物，其中,正己醛、橙花叔醇、p-傘花烴、反式-β-羅勒烯、α-法呢烯和吲哚是烏龍茶水溶液中含量較高的揮發(fā)性成分；且正己醛(OAV=10.1，青草香)、苯乙醛(OAV=5.6，甜香)、橙花叔醇(OAV=45.6，花香)、p-傘花烴(OAV=19.1，柑橘香)和反式-β-羅勒烯(OAV=6.7，青草香和果香)對(duì)烏龍茶水溶液香氣具有重要影響。黑曲霉粗酶液處理烏龍茶水溶液后，正己醛、苯乙醛、苯乙醇、橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚、橙花醇、苯甲醛和順式-3-己烯醇的含量顯著增加，且苯乙醛、芳樟醇、橙花叔醇和吲哚的OAVs顯著增大。5種不同培養(yǎng)基發(fā)酵制備的粗酶處理后各成分含量及OAV值增大的規(guī)律不同。