劉富江，朱齊春，張健鵬，蔡明夷

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

0 引言

鮑是我國傳統(tǒng)的海珍品，是重要的海水養(yǎng)殖貝類。近年來，鮑的遺傳育種研究發(fā)展迅速，其中雜交育種的成果最為突出。基于雜交，我國科研工作者已先后育成“大連1號”、“東優(yōu)1號”和“西盤鮑”等品種，推動了我國鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。在鮑的雜交育種中，雜交后代的遺傳分析是結(jié)果鑒定的重要內(nèi)容，也是深入研究雜種優(yōu)勢機(jī)理的基礎(chǔ)[4]。

基因組原位雜交(genomicinsituhybridization，GISH)是分析遠(yuǎn)緣雜交染色體組結(jié)構(gòu)的有力工具。它以一個親本的總DNA制備雜交探針，對染色體進(jìn)行原位雜交，可以用不同顏色的熒光區(qū)別顯示染色體的親本來源[5]。目前 ，GISH已廣泛應(yīng)用于動植物遠(yuǎn)緣的雜交結(jié)果鑒定、異源多倍體識別，以及基因流與基因滲入檢出等研究中[6-8]。在鮑的遠(yuǎn)緣雜交研究中，GISH也初步應(yīng)用于雜交子代的染色體組成及其動態(tài)變化[9-11]。然而，前期研究結(jié)果顯示，對于親本親緣關(guān)系較近的雜交鮑，利用GISH分辨父母本染色體的難度仍然較高，較難得到穩(wěn)定結(jié)果[11]。因此，本文擬以皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)和雜色鮑(H.diversicolor)雜交子代為研究對象，分析雜交緩沖液中探針、封阻DNA、去離子甲酰胺(dFA)、硫酸葡聚糖(DS)或聚乙二醇(PEG)6000的含量對GISH信號強(qiáng)度的影響，為提高雜交鮑染色體GISH的靈敏度與穩(wěn)定性，也可為其他探針的熒光原位雜交(FISH)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用雜色鮑足部肌肉組織采自福建省晉江福大鮑魚水產(chǎn)有限公司，固定于無水乙醇中-20 ℃保存。取性腺成熟的雌性雜色鮑和雄性皺紋盤鮑，采用陰干、流水刺激和經(jīng)過紫外照射的海水刺激等手段催產(chǎn)，獲得雜色鮑卵子與皺紋盤鮑精子。按蔡明夷等描述的方法獲得雜色鮑×皺紋盤鮑的雜交鮑幼體[12]。雜交鮑幼體在秋水仙素液體中培養(yǎng)后經(jīng)低滲、固定等處理，然后置于-20 ℃保存[13]。

1.2 GISH探針和封阻DNA的制備

用雜色鮑足部肌肉組織提取DNA，具體操作參照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化有限公司)說明書。采用切口平移法制備生物素標(biāo)記的雜色鮑基因組DNA探針，操作方法參考試劑盒說明書(Roche)。將鮭精DNA(廈門海琪生物技術(shù)有限公司)用高壓滅菌剪切法剪切成合適片段(100～200 bp)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測探針和封阻DNA的質(zhì)量。將符合要求的探針和鮭精DNA混合后采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，再用不同體積的TE緩沖液溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 染色體制片的準(zhǔn)備

取雜交鮑擔(dān)輪幼體，采用蒸汽滴片法進(jìn)行染色體制片，具體操作方法參考蔡明夷等[13]的描述，滴好的制片經(jīng)空氣干燥后于60 ℃恒溫箱中老化30 min。

1.4 基因組熒光原位雜交

GISH的一般程序包括探針變性、染色體制片變性、雜交、雜交后洗滌和信號放大等5個步驟，操作程序與蔡明夷等[13]的FISH方法描述相同。除特殊說明外，研究所用雜交緩沖液各成分組成為：30%(體積分?jǐn)?shù))dFA、10%(體積分?jǐn)?shù))2×SSC、12.5%(體積分?jǐn)?shù))DS、6.25 ng/μL探針、62.5 ng/μL鮭精DNA。雜色鮑探針雜交信號預(yù)期顯示為綠色熒光。

1)探針含量試驗(yàn) 各試驗(yàn)組探針的終質(zhì)量濃度分別為1.56 ng/μL、3.13 ng/μL、6.25 ng/μL、12.50 ng/μL、25.00 ng/μL。

2)鮭精DNA含量試驗(yàn) 各試驗(yàn)組鮭精DNA的質(zhì)量濃度分別為探針的0倍(0 ng/μL)、5倍(31.3 ng/μL)、10倍(62.5 ng/μL)、20倍(125.0 ng/μL)、40倍(250.0 ng/μL)。

3)dFA含量試驗(yàn) 各試驗(yàn)組雜交緩沖液中dFA的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%和50%。

4)DS含量試驗(yàn) 各試驗(yàn)組DS的體積分?jǐn)?shù)分別為2.5%、7.5%、12.5%、17.5%、25.0%。

5)PEG6000替代DS試驗(yàn) 用PEG6000替代雜交緩沖液中的DS，各試驗(yàn)組PEG6000的體積分?jǐn)?shù)分別為2.5%、7.5%、12.5%、17.5%、25.0%。

1.5 顯微觀察、測量與數(shù)據(jù)處理

在熒光顯微鏡下，用固定條件拍照，獲取分散良好、形態(tài)清晰且數(shù)目完整的雜交鮑的中期分裂相。每個試驗(yàn)選取5個分裂相，利用Image-pro plus 6.0軟件測量有陽性信號(綠色熒光)染色體的平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，并作折線圖。用SPSS 21.0作單因素方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 探針含量對雜交信號的影響

探針含量單因素試驗(yàn)中，在其不同質(zhì)量濃度下的GISH圖像如圖1a～圖1e所示，其中綠色熒光為雜色鮑探針雜交信號，紅色為負(fù)染的PI信號。

當(dāng)探針質(zhì)量濃度為1.56 ng/μL(見圖1a)和3.13 ng/μL(見圖1b)時，雜交信號均較弱，不能明顯區(qū)分雜交子代中染色體的親本來源。當(dāng)探針質(zhì)量濃度高于6.25 ng/μL時，雜交信號強(qiáng)，染色體親本來源明顯區(qū)別為紅綠兩色。定量分析結(jié)果表明：當(dāng)探針質(zhì)量濃度從1.56 ng/μL增加至6.25 ng/μL時，靶染色體的平均熒光強(qiáng)度由(7.53±1.76)上升至(12.46±2.38)；當(dāng)探針質(zhì)量濃度從6.25 ng/μL增加至25.00 ng/μL時，染色體平均熒光強(qiáng)度依然有所增強(qiáng)，但是增強(qiáng)趨勢已趨于平緩，平均值間的差異不顯著(P>0.05，見圖2a)。

2.2 封阻DNA含量對雜交信號的影響

封阻DNA含量單因素試驗(yàn)中，在其不同質(zhì)量濃度下的GISH圖像如圖1f～圖1j所示，其中綠色熒光為雜色鮑探針雜交信號，紅色為負(fù)染的PI信號。各試驗(yàn)組間均可明顯區(qū)別染色體親本來源，當(dāng)鮭精DNA質(zhì)量濃度為探針10倍時信號最強(qiáng)。定量分析結(jié)果表明：當(dāng)封阻DNA質(zhì)量濃度由0倍增加至10倍過程中，靶染色體的平均熒光強(qiáng)度由(5.41±0.71)逐漸增強(qiáng)到(11.39±2.28)；當(dāng)封阻DNA質(zhì)量濃度由10倍增加至40倍過程中，熒光強(qiáng)度又逐步減弱至(2.81±0.55)，各處理水平間熒光強(qiáng)度差異顯著(P<0.05，見圖2b)。

2.3 dFA含量對雜交信號的影響

dFA含量單因素試驗(yàn)中，在其不同體積分?jǐn)?shù)下的GISH圖像如圖1k～圖1o所示，其中綠色熒光為雜色鮑探針雜交信號，紅色為負(fù)染的PI信號。當(dāng)dFA體積分?jǐn)?shù)為30%時，染色體親本來源的區(qū)分度最明顯，探針雜交信號涂布的完整性最好(見圖1m)；當(dāng)dFA體積分?jǐn)?shù)高于40%時，探針雜交的涂布均一性變差，雜交信號只出現(xiàn)于某些異染色質(zhì)區(qū)域，無法明確區(qū)分染色體的親本來源(見圖1n，圖1o)。定量分析結(jié)果表明：當(dāng)dFA體積分?jǐn)?shù)由10%增至30%時，靶染色體的平均熒光強(qiáng)度由(5.07±0.15)逐漸增強(qiáng)到(11.40±2.09)；而當(dāng)dFA體積分?jǐn)?shù)由30%增至40%，靶染色體的平均熒光強(qiáng)度度急劇變?nèi)踔?4.63±0.49)(見圖2c)。

2.4 DS或PEG6000含量對雜交信號的影響

DS含量單因素試驗(yàn)中，在其不同體積分?jǐn)?shù)下的GISH圖像如圖1p～圖1t所示，其中綠色熒光為雜色鮑探針雜交信號，紅色為負(fù)染的PI信號。結(jié)果直觀顯示，DS體積分?jǐn)?shù)為12.5%和17.5%時信號最強(qiáng)，涂布均勻，親本來源區(qū)分度較高(見圖1q,圖1s)。定量分析結(jié)果表明：DS試劑的體積分?jǐn)?shù)由2.5%增加至12.5%的過程中，靶染色體的平均熒光強(qiáng)度由(5.25±2.41)逐漸增強(qiáng)到(9.96±2.05)；當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)由12.5%增加至17.5%時熒光強(qiáng)度略略下降；當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)由17.5%增加至25.0%時，熒光強(qiáng)度驟減至(2.45±0.80)(見圖2d)。

在PEG6000不同體積分?jǐn)?shù)下的GISH圖像如圖1p～圖1y所示，其中綠色熒光為雜色鮑探針雜交信號，紅色為負(fù)染的PI信號。圖像顯示：7.5% PEG6000熒光信號極強(qiáng)，但親本來源區(qū)分度并不高(見圖2v)。定量分析結(jié)果表明：當(dāng)PEG6000的體積分?jǐn)?shù)由2.5%增加至7.5%時，染色體單位面積上的熒光強(qiáng)度由(14.91±3.13)劇增到(32.65±5.31)；當(dāng)PEG6000的體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加至12.5%，熒光強(qiáng)度反而減弱到(24.7±7.71)，并隨著PEG6000的體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加而略微下降，但差異不顯著(P>0.05，見圖2d)。

DS和PEG6000兩組試驗(yàn)結(jié)果比較說明，使用PEG6000組熒光強(qiáng)度明顯高于用DS組。

3 討論

3.1 探針含量的影響

核酸雜交的反應(yīng)速度與溶液中參與雜交的互補(bǔ)鏈核苷酸質(zhì)量濃度的乘積成正比[14]。染色體GISH中，染色體制片上固定的DNA量基本穩(wěn)定，因此探針質(zhì)量濃度是影響核酸雜交效率的關(guān)鍵因素[15]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)探針的質(zhì)量濃度為1.56 ng/μL時，GISH信號強(qiáng)度微弱，且對異源染色體的區(qū)分度差；隨探針的質(zhì)量濃度的升高，信號強(qiáng)度和染色體區(qū)分度均相應(yīng)提高；當(dāng)探針的質(zhì)量濃度升高到6.25 ng/μL時熒光強(qiáng)度達(dá)到平臺，但繼續(xù)提高探針的質(zhì)量濃度也不再顯著提升GISH信號強(qiáng)度。可見，雜交鮑GISH試驗(yàn)中，探針的質(zhì)量濃度應(yīng)大于6.25 ng/μL。綜合考慮試驗(yàn)的成本控制和穩(wěn)定性，本研究建議雜交鮑的GISH探針用量為6.25 ng/μL。

不同研究所使用探針的質(zhì)量濃度并不相同。Bi等[16]在運(yùn)用GISH鑒定兩種異源三倍體蠑螈(A.laterale-2jeffersonianum，A.2laterale-jeffersonianum)的核基因組成中所使用的藍(lán)點(diǎn)鈍口螈(A.laterale)基因組探針的質(zhì)量濃度為5 ng/μL 。Sczepanski等[17]在運(yùn)用FISH研究兩種海洋鯰魚(Genidensgenidens，Aspistorluniscutis)細(xì)胞分類和核型進(jìn)化中所使用銀色鯪脂鯉(Prochilodusargenteus)18S rDNA探針的質(zhì)量濃度為2.5 ng/μL。Jowett[18]用雙色FISH研究斑馬魚(Barchydanioreriovar)胚胎基因表達(dá)模式時所使用的反義探針的質(zhì)量濃度為0.5 ng/μL。Zhang等[19]在運(yùn)用FISH研究櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的染色體定位與鑒定中所使用的Fosmid DNA探針的質(zhì)量濃度為10 ng/μL。探針種類、染色體結(jié)構(gòu)差異、探針標(biāo)記效率、雜交后洗滌嚴(yán)謹(jǐn)度等因素均可能影響探針檢出下限，導(dǎo)致GISH試驗(yàn)信號太弱甚至無法檢出。因此，不同實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)時，有必要結(jié)合自身?xiàng)l件優(yōu)化探針使用的質(zhì)量濃度。

3.2 鮭精DNA含量的影響

在雜交緩沖液中加入鮭精DNA的目的是封閉普遍同源性的重復(fù)序列，以此降低非特異雜交信號[20-21]。Mukai等[22]通過加入鮭精DNA，在小麥背景下成功檢測到大麥染色體。本研究結(jié)果顯示，最佳的鮭精DNA的質(zhì)量濃度約為探針質(zhì)量濃度的10倍，過高或過低均會顯著影響GISH信號強(qiáng)度和異源染色體的區(qū)分度。可能的原因是質(zhì)量濃度過低不足以封閉同源序列造成微小的跨基因組雜交，質(zhì)量濃度過高會影響探針在整個目標(biāo)染色體長度上的均勻雜交。

不同研究中，鮭精DNA的使用量有所差異。Hu等[23]在運(yùn)用GISH研究紫扇貝(Argopectenpurpuratus)和海灣扇貝(A.irradiansirradians)雜交種基因組時所用鮭精DNA的質(zhì)量濃度為探針的100倍。Bi等[24]在運(yùn)用GISH研究蠑螈(Ambystoma(Amphibia:Caudata))的基因組交換減數(shù)分裂機(jī)制時所用鮭精DNA的質(zhì)量濃度為探針的100倍。Rampin等[25]在運(yùn)用GISH研究鯉科魚雜交(Squaliusalburnoidescomplex)的親本染色體和基因組重排時所用鮭精DNA的質(zhì)量濃度為探針的25倍。即在不同研究中，鮭精DNA質(zhì)量濃度的使用范圍為探針的25～100倍。鮭精DNA的適宜用量的差異可能與研究對象的基因組結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

3.3 dFA含量的影響

變性的探針和染色體DNA的復(fù)性是熒光原位雜交的關(guān)鍵步驟。已有研究證明，特定DNA復(fù)性的適宜溫度約為Tm-25℃[26]。然而，為了避免長時間高溫孵育破壞染色體形態(tài)，探針與靶序列的復(fù)性通常在37℃中完成[27]。因此，研究人員一般在雜交緩沖液中添加適量dFA來調(diào)整DNA的Tm，以降低復(fù)性溫度[28]。目前已知，dFA的體積分?jǐn)?shù)每提高1%，溶液中DNA的Tm約下降0.60～0.73℃[29]。本文研究了雜交緩沖液中dFA的體積分?jǐn)?shù)對雜交鮑幼體GISH信號的影響。結(jié)果顯示，GISH信號強(qiáng)度相對dFA體積分?jǐn)?shù)的變化曲線為單峰曲線，峰值對應(yīng)的dFA體積分?jǐn)?shù)為30%(見圖1c)；dFA體積分?jǐn)?shù)過高或過低均會同時導(dǎo)致雜交信號強(qiáng)度和均一性的下降(見圖2k～圖2o)。這一曲線的特征與Mcconaughy[28]在研究dFA體積分?jǐn)?shù)對膜結(jié)合枯草芽孢桿菌DNA雜交效率的影響所得的結(jié)果相符。可見，雜交緩沖液中dFA的含量高低是影響分子雜交效率的重要因素，其含量過低或過高均會嚴(yán)重影響雜交信號的強(qiáng)度與均勻性。

不同研究報道中，雜交緩沖液中dFA的含量可能不同。例如，Barranger等[30]在運(yùn)用rDNA基因(5S rRNA，18-5.8-28S rRNA)做探針，用胚胎細(xì)胞核染色體制片的FISH，研究太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的胚胎染色體受敵草隆脅迫而導(dǎo)致非整倍性時所用的dFA的體積分?jǐn)?shù)為50%；Rampin等[25]在用S.alburnoides的AA基因組做探針，用S.alburnoides的二倍體和三倍體細(xì)胞懸液制片的GISH研究鯉科雜交魚(Squaliusalburnoidescomplex)的親本染色體和基因組重排，其所用的dFA的體積分?jǐn)?shù)為75%；Bi等[24]用藍(lán)點(diǎn)鈍口螈(A.laterale)基因組做探針，用火蜥蜴(Salamandrasalamandra)卵母細(xì)胞做染色體制片的GISH，研究蠑螈的基因組交換減數(shù)分裂機(jī)制，其所用的dFA的體積分?jǐn)?shù)為50%。本研究結(jié)果顯示，雜交鮑GISH中dFA的適宜體積分?jǐn)?shù)約為30%，低于多數(shù)研究報道。DNA的Tm值受GC含量、長度、復(fù)雜性、構(gòu)像等因素的影響，也受緩沖液中變性劑種類和含量、一價陽離子濃度、pH等因素的影響[31-32]，這些都可能導(dǎo)致dFA的適宜含量的變化。因此，在GISH試驗(yàn)中出現(xiàn)雜交信號太弱或不均勻的問題時，在保證探針含量充分的前提下，需檢查雜交緩沖液中dFA的含量是否適宜。

3.4 DS或PEG6000含量的影響

在核酸雜交中，常常在雜交緩沖液中加入適量DS以促進(jìn)雜交速度[14]。DS是一種大分子多聚化合物，具有極強(qiáng)的水合作用。它在雜交緩沖液中的作用可以歸納為兩點(diǎn)：一是，增加探針含量；二是，增加溶液的粘稠度[33]。本研究結(jié)果顯示，雜交鮑GISH雜交緩沖液中DS最適宜的體積分?jǐn)?shù)約為12.5%。其體積分?jǐn)?shù)太低，探針濃縮不充分；其體積分?jǐn)?shù)太高，溶液過于粘稠，導(dǎo)致分子擴(kuò)散速度降低。因此，其體積分?jǐn)?shù)太低或太高均會影響雜交效率。不同研究中DS的使用量差別不大。Bi等[24]在利用GISH研究蠑螈的基因組交換減數(shù)分裂機(jī)制時，所用的DS的體積分?jǐn)?shù)為10%；Yang等[34]在利用FISH研究蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)免疫相關(guān)基因定位時，F(xiàn)eng等[35]在用FISH研究櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)微衛(wèi)星標(biāo)記的細(xì)胞遺傳圖譜時，他們所用的DS的體積分?jǐn)?shù)都為10%；Rampin等[25]在利用GISH研究魚類(Squaliusalburnoidescomplex)的親本染色體和基因組重排時，Boonanuntanasarn等[36]在利用FISH研究石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)vasa基因表達(dá)時，他們所用的DS的體積分?jǐn)?shù)都為10%。可見，與其他因素相比，雜交緩沖液中DS含量的作用相對獨(dú)立且相對穩(wěn)定，在不同的研究中無需特別優(yōu)化。然而值得注意的是，DS液體比較粘稠，精確量取較困難，在配液中要注意準(zhǔn)確量取。

Amasino[37]在Southern雜交中用PEG6000替代核酸雜交緩沖液中的DS，發(fā)現(xiàn)PEG6000具有信號強(qiáng)、粘度低和價格低等優(yōu)勢。因此，本研究嘗試用PEG6000替代GISH雜交緩沖液中的DS。結(jié)果顯示，PEG6000組的信號強(qiáng)度總體高于DS組，適宜的體積分?jǐn)?shù)為7.5%。但研究結(jié)果也顯示，PEG6000組存在雜交信號不穩(wěn)定、信號噪點(diǎn)多、制片標(biāo)本易“掉片”等問題。

4 結(jié)論

本文提出一種染色體熒光強(qiáng)度定量測量方法，并利用該方法研究了雜交緩沖液中探針深度、鮭精DNA用量、DS含量對雜盤雜交鮑染色體GISH信號的影響，同時嘗試用PEG6000替換緩沖液中的DS。研究結(jié)果為提高雜交鮑GISH的分辨率提供了依據(jù)，也為其他FISH相關(guān)研究提供了借鑒。