李樹行，祝澤棟，徐紫顏，楊光參

(溫州大學(xué)數(shù)理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

DNA是一種高度帶電的聚電解質(zhì)，可以緊密包裝在細(xì)胞核、細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)和病毒衣殼中。因此，DNA縮合不僅對于生物系統(tǒng)中遺傳物質(zhì)的包裝過程起著重要作用，而且在人工基因遞送中具有潛在的治療應(yīng)用價值。對DNA等聚電解質(zhì)性質(zhì)的研究，有助于我們更清晰地了解DNA構(gòu)型變化的電動力學(xué)機(jī)理。通常在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的多價陽離子是多胺，例如三價亞精胺和四價精胺，都受到高度調(diào)節(jié)，在細(xì)胞增殖和生長中發(fā)揮重要作用[1]。但是多胺代表的是具有陽離子基團(tuán)(氨基)的化合物，而不是金屬離子。

在生物細(xì)胞中最常見的抗衡離子是金屬抗衡離子，如Na+、K+、Ca2+和Mg2+。并且通常情況下，一價與二價陽離子在溫和條件以及一般的摩爾濃度下不能導(dǎo)致DNA縮合，盡管其對DNA骨架具有高親和力以中和大部分DNA電荷。近幾年對DNA包裝和細(xì)胞骨架組織等各種生物現(xiàn)象的研究變得熱門起來，這使得對抗衡離子介導(dǎo)下的聚電解質(zhì)構(gòu)型變化的研究變得非常重要[2-3]。在早期的Oosawa-Manning凝聚理論中將抗衡離子分為“游離離子”和“聚集離子”[4-6],游離的抗衡離子充斥在溶液里，聚集的抗衡離子位于聚合物主鏈附近的小體積內(nèi)。這個理論系統(tǒng)給出了反離子與聚電解質(zhì)的作用機(jī)制，并且指出只有三價以上的多價離子才能誘導(dǎo)聚電解質(zhì)縮合。隨后，Katchalsky模型[7]對抗衡離子分布給出了更嚴(yán)格的描述,該模型能夠使反離子和聚合物的自由度解耦合，從而可以提供平衡離子密度分布固定的理想聚合物構(gòu)象。Ou 等[8]采用郎之萬動力學(xué)方法研究了均勻帶電半柔性聚電解質(zhì)鏈上反離子凝聚的性質(zhì)及其伴隨構(gòu)型，考察了鏈剛度、鏈長、反離子價態(tài)和靜電相互作用強(qiáng)度對反離子凝聚的影響。在近期，Hofzumahaus等[9]采用蒙特卡羅方法對弱聚電解質(zhì)微凝膠的構(gòu)象與pH的依賴關(guān)系進(jìn)行了模擬的，這對我們改變模擬pH環(huán)境提供了理論基礎(chǔ)。盡管到目前為止關(guān)于抗衡離子對DNA的凝聚的理論模擬和實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)很多[10-14]，但是關(guān)于非特異性結(jié)合的二價抗衡離子導(dǎo)致DNA凝聚的現(xiàn)象研究很少。

我們分別運(yùn)用理論模擬和實(shí)驗(yàn)的方法，通過改變?nèi)芤旱膒H環(huán)境，清楚地證明了由二價抗衡離子介導(dǎo)的聚電解質(zhì)(DNA)的構(gòu)象變化，主要工作是對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行模擬研究。事實(shí)上，嚴(yán)格調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH以優(yōu)化許多酶的活性，對于控制細(xì)胞周期和細(xì)胞的增殖能力是重要的。另一方面，pH調(diào)節(jié)的基于DNA的納米材料和納米器件在體內(nèi)成像、臨床診斷和藥物遞送方面都有一些應(yīng)用[15-18]。

1 模擬方法

1.1 模型創(chuàng)建

我們在隱性溶劑條件下利用粗粒化模型來研究含有聚電解質(zhì)和帶+2價反離子的水溶液體系。聚電解質(zhì)被模型化為一個由Lennard-Jones(LJ)粒子組成的彈簧鏈，聚電解質(zhì)鏈上每個珠子隨機(jī)帶有1或0個單位的負(fù)電荷，反離子為帶兩個正電荷的球體,聚電解質(zhì)分子和反離子置于均勻介電常數(shù)為εr的介質(zhì)中，模擬區(qū)域?yàn)長×L×L的立方體盒子,模型簡單示意圖可參見圖1。

圖1 聚電解質(zhì)鏈與反離子作用模型簡圖Fig.1 Schematic of the polyelectrolyte chain and anti-ion interaction model

單體間的相互作用勢選用排斥性的LJ勢：

(1)

其中，dαβ(α，β=1，2，3表示單體的類別，α=β表示同一種單體)是力為零的距離，兩個聚合物珠子排斥距離設(shè)定為dαβ=1σ，其中σ為模擬系統(tǒng)中長度基本單位，這里珠子與抗衡離子、抗衡離子與抗衡離子之間的排斥分別取為0.8σ和0.6σ。rij表示兩個珠子之間的距離，在這項(xiàng)工作中，能量單位參數(shù)ε=kBT，其中kB是Bolztmann常數(shù)，T是絕對溫度。

采用標(biāo)準(zhǔn)簡諧彈性勢對聚電解質(zhì)鏈連通性進(jìn)行建模:

(2)

其中，k是彈性參數(shù)，為了限制聚電解質(zhì)珠子在鏈的方向保持小范圍振動，設(shè)置k=10 000kBT/σ2,其中，l0為平衡距離，大小為σ。

聚電解質(zhì)鏈的彎曲能選用簡諧角的形式：

(3)

其中，θ0為角度平衡時的值，取為1800，k'是體現(xiàn)鏈剛性的參數(shù)。

任意兩個單體之間的庫侖相互作用，我們用以下形式描述：

(4)

其中,Bjerrum長度定義為lB=e2/4πε0εrkBT，其中ε0和εr分別是真空的介電常數(shù)和溶劑的相對介電常數(shù),庫侖作用強(qiáng)度用A=lB/σ描述,本研究我們選取的A為4.0,庫侖相互作用的計算采用ewald求和法。所有的模擬都是從隨機(jī)生成的初始配置開始的。每個模擬總的時間步數(shù)都在5×107以上，以保證系統(tǒng)達(dá)到平衡,每隔1000個模擬步數(shù)要保存所有粒子的位置和速度數(shù)據(jù)。

1.2 模擬細(xì)節(jié)

我們通過LAMMPS(大規(guī)模原子/分子并行仿真器)軟件包進(jìn)行分子動力學(xué)(MD)仿真來研究系統(tǒng)的動力學(xué)過程，整個模擬環(huán)境運(yùn)用Langevin恒溫器在NVT系宗中保持恒溫。為了提高計算效率，我們忽略了流體動力學(xué)相互作用,這種粗粒度方法，使得我們的模擬涵蓋更大的長度和時間尺度。

系統(tǒng)中任何單體的動力學(xué)行為滿足郎之萬方程：

(5)

我們通過計算不同pH-pK值來研究不同pH對聚電解質(zhì)縮合的影響，所有的值都是系統(tǒng)的平均值。對于聚電解質(zhì)滿足以下方程:

HMH++M-，

(6)

其中，M代表高分子電解質(zhì)。上述反應(yīng)可以用一個解離常數(shù)來描述，即：

(7)

其中，x(H+)，x(HM)和x(M-)表示離解質(zhì)子、相關(guān)酸及堿的濃度。同時我們可以定義電離度α：

(8)

電離度α和pH滿足以下關(guān)系[19]:

(9)

當(dāng)pK固定時(pK=-lgK)，通過調(diào)節(jié)α的值，可以得到不同的pH環(huán)境。而α的調(diào)節(jié)可以通過改變聚電解質(zhì)鏈的帶電比率來實(shí)現(xiàn)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

AFM型號是NanoWizard III，購自于 JPK公司，其分辨率大約為納米級，比光學(xué)衍射極限高出1000倍以上，通過用機(jī)械探針“感覺”或“觸摸”表面來收集信息。壓電元件有助于實(shí)現(xiàn)微小但精確的(電子)命令運(yùn)動，從而實(shí)現(xiàn)精確掃描，主要應(yīng)用于單分子DNA的操縱實(shí)驗(yàn)。在AFM內(nèi)部安裝有自動化機(jī)器人以及一架可操作的控制裝置，還包含NanoScience 控溫系統(tǒng)。機(jī)械探針購自于NanoWorld，型號為NCHR-50的鍍鋁硅探針。探針參數(shù)為：長寬厚度分別是125 μm、30 μm、4 μm，彈性系數(shù)為2 N/m，共振頻率為320 kHz。在整個實(shí)驗(yàn)過程中環(huán)境溫度保持室溫。使用AC mode掃描圖像，圖像尺寸5 μm×5 μm，掃描頻率維持1 Hz。圖像處理采用自帶的處理軟件(4.2版的JPK Data Processing)對所有圖片做相同的處理，圖片像素為512×512。實(shí)驗(yàn)所用的緩沖液為10 mmol/L的Tris溶液，超純水來自于Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,Billerica, MA, USA)。MgCl2·6H2O購于奧里奇西格瑪公司，配置的初始濃度為100 mmol/L。本實(shí)驗(yàn)所用的Mg2+濃度為 3 mmol/L。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

整個實(shí)驗(yàn)過程可分為以下5個步驟：

(1)制備云母片，將云母片切割成1 cm×1 cm大小備用；

(2)用雙面膠將云母片平鋪到載玻片中間位置；

(3)使用磨砂膠帶剝離云母片，使其表面光滑完整待用；

(4)云母片處理好后，用移液器取出50 μL實(shí)驗(yàn)溶液至云母片中央，用玻璃器皿將其罩上靜置5 min；

(5)5 min過后，取出樣品，吸取表面多余溶液，并用50 μL去離子水多次(10次左右)清洗，用氮?dú)獯蹈杀砻婧笤僦糜诤娓上渲泻娓? h備用。

簡單流程如圖2所示。

圖2 樣品制備流程圖Fig.2 Sample preparation flow chart

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 理論模擬結(jié)果

為了表征pH對聚電解質(zhì)鏈的聚集的影響，我們對不同pH-pK下聚電解質(zhì)的Rg做了統(tǒng)計平均。圖3給出了不同鏈長的聚電解質(zhì)Rg隨pH-pK的變化規(guī)律,其中回轉(zhuǎn)半徑Rg滿足公式：

(10)

其中，rc表示聚電解質(zhì)質(zhì)量中心的坐標(biāo)，ri表示聚電解質(zhì)中第i個單體的坐標(biāo)。

由圖3中可以看到，在-1.50(即α>0.5)時，Rg基本不隨α的變化而改變(pH-pK=-1.5時，Rg=7.2σ；pH-pK=0時，Rg=9.0σ)。隨著pH的降低，聚電解質(zhì)的回轉(zhuǎn)半徑也隨之降低。

圖3 回轉(zhuǎn)半徑Rg與pH-pK的關(guān)系Fig.3 Radius of gyration Rg for a chain of a particular length and some values of pH-pK

我們在二價離子溶液中研究了多種不同的聚電解質(zhì)系統(tǒng)，將pH-pK=0時的系統(tǒng)作為參考系統(tǒng)。從參考系出發(fā)，研究了另外多組系統(tǒng)，只改變一個參數(shù)α(電離度)，并保持所有其他參數(shù)不變。我們從中選取了4組不同系統(tǒng)(對應(yīng)的α分別為0.9、0.5、0.3、0.1)做了模擬快照圖，如圖4所示。隨著α的減小，pH是降低的，我們從圖4中能明顯地看出聚電解質(zhì)的構(gòu)型變化。所有的模擬數(shù)據(jù)均在體系能量達(dá)到最小時進(jìn)行收集，其能量隨時間步數(shù)的變化結(jié)果，如圖5所示(圖5是許多模擬中的一個普通個例)。

圖4 模擬快照圖Fig.4 Simulation snapshots

圖5 模擬系統(tǒng)總能量隨時間的變化Fig.5 The change in the total energy of the simulation system with time

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了證實(shí)當(dāng)前的模擬結(jié)果，我們做了pH對二價反離子介導(dǎo)的DNA形態(tài)影響的實(shí)驗(yàn)研究。本研究使用AFM觀察了在不同離子和pH條件下的DNA構(gòu)象變化，DNA的濃度為1 ng/μL。圖6給出了pH=8、5、4、3的3 mmol/L MgCl2溶液中的DNA形態(tài)，在pH = 5時，DNA呈現(xiàn)出自由松散的狀態(tài)，并且形態(tài)類似于pH>5的形態(tài)。當(dāng)pH從5變?yōu)?時，觀察到圖6中DNA發(fā)生了聚集，中間有個核狀結(jié)構(gòu)，周圍分布著DNA的線條，我們稱為花狀形態(tài)。而當(dāng)pH在圖6中降至3時，出現(xiàn)球狀或環(huán)狀形態(tài)。由此可以看出隨著pH的降低，DNA發(fā)生了凝聚，這和我們的理論模擬基本保持一致。

圖6 不同pH下3 mmol/L Mg2+誘導(dǎo)的DNA形態(tài)的AFM圖像Fig.6 The AFM images of the DNA morphologies induced by 3 mmol/L Mg2+ at different pH

4 結(jié)論

我們通過模擬在各種pH環(huán)境下聚電解質(zhì)鏈在二價反離子環(huán)境中的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)非特異性結(jié)合的抗衡離子中溶液的pH-pK降至低于0(即α=0.5)時，聚電解質(zhì)鏈開始收縮。當(dāng)環(huán)境pH-pK約為-0.37(即α=0.3)時，聚電解質(zhì)處于不穩(wěn)定的過渡狀態(tài)，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了模擬工作的正確性。當(dāng)溶液的pH降低時，DNA的質(zhì)子化能力變強(qiáng)，DNA鏈上被中和的磷酸基團(tuán)變多，使得DNA的負(fù)電性變?nèi)?，進(jìn)而更容易導(dǎo)致DNA凝聚。該結(jié)果為以后DNA和蛋白質(zhì)等生物聚電解質(zhì)鏈的實(shí)驗(yàn)以及理論研究奠定了基礎(chǔ)。