高爽，王玉真，薄福民，張麗，孫越，楊山景，李凌軍

(山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

女貞子，為木犀科植物女貞LigustrumIucidumAit.的干燥成熟果實，是一味傳統(tǒng)的扶正固本藥物，味苦平、主補中、安五臟、養(yǎng)精神，入肝、肺、腎三經。目前從女貞子中分離到的化合物主要為三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇類以及黃酮類等[1]。2005版《中國藥典》[2]采用齊墩果酸作為女貞子藥材含量測定的指標成分，但因多種中藥均含有齊墩果酸，不是女貞子的特征成分，于是2010版及2015版《中國藥典》[3-4]把特女貞苷作為女貞子的含量測定指標成分。齊墩果酸和熊果酸常被用作測定女貞子總三萜的代表成分，且互為異構體[5]，具有廣泛的生物活性，如抗微生物[6]、抗炎抗變態(tài)反應[7]、保肝[8]、調血脂抗肥胖[9]、抗動脈粥樣硬化[10]、調節(jié)免疫功能[11]及抗骨質疏松[12]等藥理作用；特女貞苷常用于治療氧化損傷、衰老相關的心血管疾病，可削弱血管內皮細胞的損傷及降低凋亡相關蛋白的表述[13]，結構見圖1。目前相關研究多為對女貞子單一類成分的提取，無法兼顧不同部位成分。本文通過單因素考察及正交試驗，以特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的提取轉移率為指標，同時對水溶性部位及低極性部位進行考察，為女貞子藥材提取提供最佳工藝。

a 齊墩果酸；b 熊果酸；c 特女貞苷圖1 齊墩果酸、熊果酸、特女貞苷化學結構式Fig.1 Chemicalstructural formulas of oleanolic acid,ursolic acid,and specnuezhenide

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫高效液相色譜儀 Technologies 1260 Series(美國Agilent公司)；Thermo BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)； BS110S分析天平(北京賽多利斯天平公司)；New Classic MC 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

本實驗所使用的女貞子(批號：20170601)購自安徽九合堂國藥有限公司，經山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定，為木犀科植物女貞子LigustrumiucidumAit.的干燥成熟果實，按照《中國藥典》2015年版相關項下要求檢查均符合規(guī)定。

特女貞苷(純度93.3%，批號：111926-201605)、齊墩果酸(純度91.7%，批號：110709-201607)、熊果酸(純度94.7%，批號：110742-201622)均購自中國食品藥品檢定研究所。

水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 樣品的制備

2.1 對照品儲備液的制備

精密稱取特女貞苷對照品12.78 mg于25 mL容量瓶中，加35%甲醇定容至刻度，制成濃度為0.511 2 mg·mL-1的特女貞苷對照品儲備液。

精密稱取齊墩果酸對照品10.33 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成濃度為0.413 2 mg·mL-1的齊墩果酸對照品儲備液。

精密稱取熊果酸對照品10.80 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成濃度為0.216 0 mg·mL-1的熊果酸對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取女貞子藥材30.00 g，置500 mL圓底燒瓶內，加入8倍量60%乙醇，加熱回流3次，每次3 h，合并煎液，加60%乙醇定容至500 mL。

精密移取女貞子藥材提取液0.5 mL至10 mL容量瓶內，加35%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得特女貞苷供試品溶液。

精密移取女貞子藥材提取液1.0 mL至10 mL容量瓶內，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得齊墩果酸、熊果酸供試品溶液。

3 色譜條件及方法學考察

3.1 色譜條件

3.1.1 特女貞苷測定色譜條件

1 特女貞苷圖2 特女貞苷HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of specnuezhenide

3.1.2 齊墩果酸、熊果酸測定色譜條件

1 齊墩果酸；2 熊果酸圖3 齊墩果酸、熊果酸HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

3.2 方法學考察

3.2.1 標準曲線的制備

精密移取2.1項下制備的特女貞苷對照品儲備液，加35%甲醇制備濃度分別為0.511 2，0.409 0，0.306 7，0.204 6，0.102 4，0.025 56 mg·mL-1的特女貞苷對照品溶液。

精密移取2.1項下制備的齊墩果酸對照品儲備液，加甲醇制備濃度分別為0.413 2，0.330 6，0.248 0，0.165 4，0.082 80，0.020 66 mg·mL-1的齊墩果酸對照品溶液。

精密移取2.1項下制備的熊果酸對照品儲備液，加甲醇制備濃度分別為0.216 0，0.172 8，0.129 6，0.086 40，0.043 20，0.010 80 mg·mL-1的熊果酸對照品溶液。

按3.1項下色譜條件測定，記錄峰面積。分別以對照品溶液濃度為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y，得特女貞苷回歸方程為Y=20 453X+21.324，R2=0.999 9。結果表明，特女貞苷在0.025 56～0.511 2 mg·mL-1范圍內與峰面積的積分值呈良好的線性關系；齊墩果酸回歸方程為Y=9 456.7X+28.773，R2=0.999 0，在0.020 66～0.413 2 mg·mL-1范圍內與峰面積的積分值呈良好的線性關系；熊果酸回歸方程為Y=9 744.9X+41.257，R2=0.999 3，在0.010 80 ～0.216 0 mg·mL-1范圍內與峰面積的積分值呈良好的線性關系。

3.2.2 精密度實驗

精密移取2.1項下制備的特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸對照品儲備液，分別按3.1項下色譜條件重復測定6次，記錄峰面積。測定得特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸峰面積的相對標準偏差(n=6)分別為0.164 9%、0.263 4%、0.772 0%，表明該方法精密度良好。

3.2.3 穩(wěn)定性實驗

精密移取2.2項下制備的供試品溶液，在室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h，分別取樣按3.1項下色譜條件測定，記錄峰面積。測得特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸峰面積的相對標準偏差(n=6)分別為0.602 0%、1.354%、2.197%，表明供試品在12 h內穩(wěn)定性良好。

3.2.4 重復性實驗

精密移取2.2項下制備的供試品溶液，按3.1項下色譜條件測定，記錄峰面積。測得特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸峰面積的相對標準偏差(n=6)分別為0.679 8%、1.103%、2.032%，表明該方法重復性良好。

3.2.5 加樣回收實驗

精密移取2.2項下制備的特女貞苷供試品溶液6份，齊墩果酸、熊果酸供試品溶液12份，分成2組，分別精密加入2.1項下制備對照品儲備液適量，制備成濃度分別為0.306 7、0.248 0、0.129 6 mg·mL-1的特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸對照品溶液，按照3.1項下色譜條件測定，計算得特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的平均回收率(n=6)分別為99.08%、100.24%、101.51%，表明該方法可靠性強。

4 藥材含量測定

4.1 女貞子藥材特女貞苷含量測定

取女貞子藥材粉末(過3號篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.0 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液[4]，按3.1項下色譜條件測定。測得女貞子藥材中特女貞苷含量為23.46 mg·g-1，即特女貞苷質量分數為2.346%，大于藥典規(guī)定的0.7%，該批藥材合格。

4.2 藥材齊墩果酸、熊果酸含量測定

取女貞子藥材粉末1 g，精密稱定，加乙醇50 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過；藥渣加乙醇同上。再重復回流2次，合并濾液，加乙醇定容至250 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液[2]，按3.1項下色譜條件測定。測得女貞子藥材中齊墩果酸、熊果酸含量為分別為10.04 mg·g-1、1.964 mg·g-1，即齊墩果酸質量分數為1.04%，大于2005版藥典規(guī)定的0.6%，該批藥材合格。

5 單因素考察

5.1 提取溶劑

稱取女貞子藥材30.00 g，稱取5份，分別加8倍量40%、50%、60%、70%、80%乙醇，回流提取2 h，濾出煎液。加入6倍量對應溶劑，回流提取1.5 h，合并煎液。加對應濃度乙醇定容至500 mL。按2.2方法制備供試液，按3.1項下色譜條件測定，結果見表1。

表1 乙醇體積分數對有效成分提取轉移率的影響

特女貞苷極性較大，提取轉移率隨乙醇體積分數增大呈下降趨勢，40%乙醇提取轉移率最高；齊墩果酸、熊果酸極性較小，提取轉移率隨乙醇濃度增大呈上升趨勢，70%乙醇提取轉移率最高。對3個成分進行歸一化處理得到的綜合評分顯示，當乙醇體積分數為60%時，綜合評分最高。綜合3個成分提取轉移率考慮，選擇60%乙醇為提取溶劑。

5.2 提取溶劑用量

稱取女貞子藥材30.00 g，稱取5份，一煎分別加4倍量、6倍量、8倍量、10倍量、12倍量60%乙醇，回流提取2 h，濾出煎液。二煎加入2倍量、4倍量、6倍量、8倍量、10倍量60%乙醇，回流提取1.5 h，合并煎液。分別加60%乙醇定容至500 mL或1000 mL。按2.2方法制備供試液，按3.1項下色譜條件測定，結果見表2。

表2 提取溶劑用量對有效成分提取轉移率的影響

提取溶劑用量增加，提取時藥材組織內部與外部溶液間濃度梯度增大，易于有效成分的溶出。由結果可得，特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的提取轉移率隨提取溶劑用量增加呈上升趨勢。由綜合評分可得，當提取溶劑超過10倍量以后，提取轉移率無明顯提高，考慮生產成本，選擇用10倍量60%乙醇為提取溶劑用量。

5.3 提取時間

稱取女貞子藥材30.00 g，稱取4份，一煎加10倍量60%乙醇，分別回流提取4.0 h、3.0 h、2.0 h、1.0 h，濾出煎液。二煎加8倍量60%乙醇，分別回流提取3.5 h、2.5 h、1.5 h、0.5 h，合并煎液。加60%乙醇定容至500 mL。按2.2方法制備供試液，按3.1項下色譜條件測定，結果見表3。

表3 提取時間對有效成分提取轉移率的影響

齊墩果酸、熊果酸主要分布在女貞子果實的果皮中，易于溶劑的浸潤、滲透，故增加提取時間對其提取轉移率影響較小。特女貞苷分布在女貞子的果仁中，需要一定的浸潤、滲透過程[14]，故增加提取時間可明顯提高特女貞苷的提取轉移率。由綜合評分可得，當提取時間為4.0 h時，3個成分提取轉移率最高。由于此次僅提取了一次，而實際生產中，可通過增加提取次數來增加提取時間，還可增大提取時的濃度梯度，更有利于提取徹底。所以，選擇3.0 h為提取時間，通過正交試驗考察提取時間與提取次數的最佳組合。

6 提取工藝正交試驗

選取影響有效成分提取率的溶劑用量(A)、提取時間(B)、提取次數(C)為考察因素，以特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的提取轉移率綜合評分為考察指標，取女貞子藥材，用60%乙醇為提取溶劑，按L9(34)正交表進行試驗。因素水平表見表4，正交表及直觀分析表見表5，方差分析表見表6。

表4 因素水平表

表5 L9(34)正交表及直觀分析表

表6 方差分析表

注：*表示該因素有顯著性影響

正交試驗結果顯示，3個因素對提取率的影響不同，以綜合評分為指標，3個因素影響主次順序為提取次數、提取時間、溶劑用量，由直觀分析得最佳提取工藝為A2B2C3，由方差分析可知，提取次數對提取率有顯著性影響。在提取溶劑及溶劑用量一定的前提下，總提取時間對轉移率的影響最大，符合藥材提取的浸潤、滲透、擴散過程。綜上所述，最佳實驗條件為A2B2C3，即用8倍量60%乙醇提取3.0 h，提取3次。

7 提取工藝驗證實驗

取女貞子1 kg，3份，加8倍量60%乙醇，回流提取3.0 h，提取3次，合并煎液。按2.2方法制備供試液，按3.1項下色譜條件測定。以特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸提取轉移率為考察指標，對最佳工藝進行重復性驗證，結果見表7。

表7 驗證實驗結果

通過對最佳提取工藝的驗證，特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的平均提取轉移率為75.42 %、93.86%、99.83%，相對標準偏差分別為0.298 8、0.065 05、0.217 4(n=3)，與正交試驗所得最佳提取工藝相比，無明顯差距。因此，提取工藝確定為A2B2C3，即用8倍量60%乙醇提取3.0 h，提取3次。

8 結論與討論

中醫(yī)治病是發(fā)揮多成分、多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合作用和整體效應，在提取過程中應根據臨床療效的需要、處方中各組成藥物的性質、擬制備的劑型，結合生產設備條件、經濟技術的合理性等，選擇和確定最佳工藝[15]。

提取溶劑的選擇與應用，關系到有效成分的充分溶出，制劑的有效性、安全性、穩(wěn)定性及經濟效益的合理性。特女貞苷為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類成分，主要分布在女貞子的水溶性提取液中[16]，極性較大；齊墩果酸、熊果酸為三萜類成分，主要分布在女貞子的脂溶性提取液中[17]，故選擇合適的乙醇濃度是同時提取三種成分的前提條件。本實驗通過單因素考察，選擇60%乙醇作為提取溶劑，保證了特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的提取轉移率。

藥材組織內部的濃溶液與其外部溶液的濃度差，是擴散的主要動力。提取過程中，若能始終保持較大的濃度梯度，將大大加速藥材內成分的浸出，提取時增加溶劑的用量可顯著影響濃度梯度[18]。當提取溶劑過量時，對提取轉移率的影響不明顯，反而影響經濟效益。由單因素考察結果可見，適當增加提取溶劑用量，可明顯增加特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的提取轉移率。

提取過程的浸潤、滲透、溶出階段都需要一定的時間[19]，因此若提取時間過短，將會造成藥材成分浸出不完全。但當擴散達到平衡后，時間不起作用。此外，長時間的提取往往導致大量雜質溶出，某些有效成分分解、轉化[20]。特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸在女貞子果實中的主要分布部位不同，性質也存在差異，由提取時間的單因素考察可見，增加提取時間對齊墩果酸、熊果酸的影響不明顯，但對特女貞苷提取轉移率具有顯著性影響。

回流熱浸法提取時，溶劑只能循環(huán)使用，不能不斷更新，為提高提取效率，通常需要更換新溶劑2～3次，溶劑用量較多，且間接對提取時間造成影響。本實驗通過單因素考察及正交試驗法，考察了提取溶劑用量、提取時間、提取次數，優(yōu)選了最佳提取工藝，即用8倍量60%乙醇提取3.0 h，提取3次。

本實驗以特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸作為指標成分對女貞子提取工藝進行優(yōu)選，方法簡便、準確，結果有利于實際生產操作。3種成分提取轉移率存在超過100%的情況，一方面由于操作誤差造成影響，其次可能因為藥材含量測定時有效成分提取不完全，導致計算存在誤差。乙醇回流作為女貞子中特女貞苷、齊墩果酸、熊果酸的提取方法，雖提取率高，但同時也提取出色素、鞣質、蠟質等雜質，后期可考察3種成分的純化工藝。