吳麗紅, 李洪濤, 管紅兵, 顧為望, 黃莉文

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣州口腔疾病研究所·口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室, 廣州 510140；

2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院廣州呼吸健康研究院, 呼吸疾病國家重點實驗室

·國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心, 廣州 510230；

3. 南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所, 廣州510515)

現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟速猛發(fā)展，生活變得方便、舒適、優(yōu)越： 富營養(yǎng)食品, 汽車代步, 電腦、網(wǎng)絡(luò)和空調(diào)使人們舒適上班, 甚至足不出戶便可完成金融交易和跨國會議等。同時也使人們變得更加“懶慢”，缺少運動、營養(yǎng)過剩導(dǎo)致很多人處于超重、高脂血癥和非酒精性脂肪肝的狀態(tài)。

瘦素(Leptin)是由脂肪細(xì)胞分泌的激素[1,2]，是反映體內(nèi)脂肪儲存重要信號。Leptin 功能異?？梢鹬敬x異常，從而導(dǎo)致高脂血癥和非酒精性脂肪肝等疾病的發(fā)生。Leptin 與脂肪代謝之間的聯(lián)系機制很多。有報道[3-5]指出線粒體解偶聯(lián)蛋白3(uncoupling protein-3, UCP3)、過氧化體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferatoractivatedreceptor-gamma, PPARγ)和類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1, SREBP-1)在Leptin參與脂肪代謝過程中起到重要作用。UCP3 是脂肪和能量代謝過程中的重要關(guān)鍵調(diào)控基因之一，而PPARγ被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞分化和增殖的調(diào)控因子，它們在Leptin 與Leptin受體結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到增敏作用。SREBP-1 參與肝細(xì)胞脂肪變過程，食物中的脂肪酸可以通過調(diào)節(jié)SREBP-1基因mRNA表達(dá)與轉(zhuǎn)錄過程，從而促進(jìn)脂肪在肝細(xì)胞的蓄積。

本實驗利用Leptin免疫SD 大鼠，觀察Leptin對皮下、腹部和肝臟脂肪沉積的影響，不但對肥胖、高脂血癥、非酒精性脂肪肝的新型動物模型制作進(jìn)行探索性研究，也為臨床脂肪代謝異常疾病發(fā)生、病因研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雌性SD 大鼠30 只, 40 日齡, 110～120 g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0041]。動物實驗于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(粵)2016-0167]進(jìn)行，動物實驗倫理審查表編號為R-20120928-01。

1.2 主要試劑與儀器

Lpetin抗體檢測用的Leptin(包被96孔板用)為實驗室自制保存, 磷酸鹽緩沖液、油紅O 染色試劑盒、鑰孔血藍(lán)(keyhole limpet hemocyanin,KLH)蛋白均購自美國Sigma 公司； 脫脂奶粉、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺、二甲基亞砜、碳酸氫鹽、醋酸鈉和98%濃硫酸等為國產(chǎn)試劑； 熒光定量PCR 試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。顯微鏡及數(shù)碼成像系統(tǒng)(COOLSCOPE)購自日本尼康公司； 石蠟切片機(R M 2 2 4 5)、全自動脫水機(TP1020)和冰凍切片機(CM1850 UV)均購自德國萊卡公司； 熒光定量PCR儀(CFX96)和酶標(biāo)儀(FC)購自美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物免疫實驗 Leptin 的表達(dá)、純化、濃縮以及免疫原的制備具體方法按照前期研究[6]進(jìn)行。

將SD大鼠隨機分成對照組(KLH組)和實驗組(Leptin 組), 每組15 只。實驗期間, 大鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境并飼喂無菌鼠料、高壓滅菌水, 飲食自由。

實驗全期按免疫次數(shù)分成3 個階段：以第一次免疫前1 d 記為0 d，于1 d 進(jìn)行第一次免疫，21 d 和42 d 加強免疫。采用腿部肌兩側(cè)兩點注射方法免疫，Leptin 組每只大鼠每次免疫1 mg Leptin，KLH 組免疫1 mg KLH 蛋白。實驗0 d 和52 d 稱體質(zhì)量和測抗體水平。實驗0 d，大鼠在0.3%戊巴比妥鈉溶液1 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉狀態(tài)下進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，用于抗Leptin 抗體水平和血脂4 項指標(biāo)檢測。

在實驗52 d將所有大鼠實施安死術(shù)，采集血液分離血清，用于抗Leptin 抗體水平和血脂4 項指標(biāo)檢測。采集肝臟稱重、制作冰凍切片并進(jìn)行油紅O 染色，采集皮下和腹部脂肪稱重和制作石蠟切片并進(jìn)行HE 染色。肝臟脂變率=臟臟脂肪滴面積/觀察視野面積×100%。

1.3.2 抗Leptin 抗體和血脂4 項指標(biāo)檢測 抗Leptin抗體測定方法如下： 通過交叉連續(xù)稀釋法確定ELISA中顯色劑和抗原(Leptin)包被劑的最佳濃度； 向酶標(biāo)板孔中加入100 μL 含適量抗原的包被液4 ℃過夜； 清洗后加入200 μL 封閉液，37 ℃孵育2 h； 清洗后加入血清樣品100 μL，37 ℃孵育1 h； 清洗后加入100 μL 二抗(過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體，稀釋比為1∶2 400)，37 ℃孵育1 h； 清洗后進(jìn)行四甲基聯(lián)苯胺(TMB)染色，室溫下作用10～20 min (避光)，加入100 μL 2%硫酸溶液終止反應(yīng)后立即用酶標(biāo)儀測定A450值。

每組血清樣本隨機抽取6 個進(jìn)行總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和甘油三酯檢測(由南京建成生物工程研究所進(jìn)行檢測和分析)。

1.3.3 基因的定量檢測 抽取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將UCP3(肌肉)、Leptin(腹部脂肪)、SREBP-1(肝臟)和PPARγ(下丘腦)基因與對應(yīng)組織的β-actin 基因同時進(jìn)行定量PCR 擴增, 記錄各個基因擴增的Ct 值。熒光定量PCR 方法與步驟根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行。定量PCR體系： 上下游引物(20 μmol/L)各0.2 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、ddH2O 8.56 μL, SYBR green-Taq 10 μL，50×ROX 0.04 μL。 引物序列見表1。定量循環(huán)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，[95 ℃ 15 s，60 ℃(β-actin)或54 ℃(Leptin) 或57 ℃(UCP3) 或58 ℃(PPARγ)或55 ℃(SREBP-1)30 s]40 個循環(huán)。

表 1 定量PCR 引物序列Table 1 Oligonucleotides used for Real-time PCR amplication

計算公式：Relative Quantification (ddCt)法，基因的平均相對含量 = 2-averageΔΔCt×100%(Ct 值是表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。

1.3.3 組織病理學(xué)檢測與分析 肝臟冰凍切片制作和油紅O染色： 冷凍度調(diào)至-25 ℃左右取材，切成大小約為0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm后用OCT包埋、冰凍、切片； 冰凍切片在常溫下干燥15～20 min； 無水異丙醇孵育5 min； 0.5%的油紅O 溶液孵育7～8 min (在60 ℃烤箱)； 85%異丙醇溶液洗3 min； 雙脫水洗，蘇木素染1～1.5 min, 雙脫水洗；封片劑封片； 倒置顯微鏡觀察結(jié)果并拍照(染色結(jié)果不能長期保存，應(yīng)盡快觀察和拍照)。皮下、腹部脂肪組織的石蠟切片與HE染色： 具體染色步驟參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 實驗數(shù)據(jù)處理與分析 利用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，數(shù)據(jù)用x-± s 表示。體質(zhì)量、抗Leptin 抗體水平、血脂4 項檢測結(jié)果分析采用two-way ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計分析； 其余數(shù)據(jù)采用student t 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫Leptin 后大鼠抗體水平和體質(zhì)量

表2 結(jié)果顯示，在實驗0 d(首次免疫前)，2組大鼠血清中的抗Leptin抗體水平均比較低。在實驗52 d(實驗結(jié)束)，KLH 組沒有明顯變化，Leptin 組抗體水平明顯升高(P＜0.01)，表明SD 大鼠免疫Leptin 后，成功激活了其體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)。SD 大鼠的體質(zhì)量在實驗52 d，免疫Leptin組體質(zhì)量顯著重于對照組(P＜0.01)。

2.2 免疫Leptin 后大鼠血脂水平

表3 結(jié)果顯示，實驗0 d，免疫Leptin與KLH組大鼠血脂水平差異不顯著(P＞0.05), 但實驗52 d時，免疫Leptin 的大鼠總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯均顯著高于KLH 組(P＜0.05)。

2.3 免疫Leptin后大鼠皮下、腹部和肝臟脂肪沉積

病理學(xué)觀察可見(圖1)，Leptin 組大鼠皮下和腹部脂肪組織中的脂肪空泡較KLH 組排列松散，大部分脂肪細(xì)胞單個體積增大，有些細(xì)胞邊緣輪廓不清晰。KLH 組大鼠肝細(xì)胞核呈藍(lán)色, 肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)量極少； Leptin組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴蓄積明顯，視野內(nèi)出現(xiàn)彌漫性的紅染脂滴，且大多數(shù)被紅染的脂肪滴的輪廓界面清晰。Leptin 組大鼠腹部脂肪和肝臟重量都較KLH 組顯著增加； 單個視野皮下和腹部脂肪細(xì)胞面積大小分別約為KLH 組的2 倍和1.4 倍(P＜0.05)； 單個視野皮下和腹部脂肪細(xì)胞數(shù)量則分別比KLH組少31%和22%； 肝臟脂肪所占面積和肝臟脂變率都比KLH組分別顯著高約8 倍和3.3 倍(表4)。

表 3 大鼠血清中總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和甘油三酯水平Table 3 The levels of total cholesterol, high density lipoprotein, low density lipoprotein and triglycerides in rat mmol/L

表 4 大鼠肝臟、皮下和腹部脂肪細(xì)胞比較Table 4 The comparison of liver, subcutaneous and abdominal fat cell of KLH and leptin rats

紅色箭頭表示肝臟中的紅色脂肪滴圖 1 大鼠皮下、腹部和肝臟脂肪沉積情況Figure 1 Fats deposition in subcutaneous, abdominal and liver of rat

2.4 免疫Leptin 后大鼠PPAYγ、Leptin 和SREBP-1 mRNA 表達(dá)水平

與KLH組比較，免疫Leptin后SD大鼠PPAYγ(下丘腦)、Leptin(腹部脂肪)和SREBP-1(肝臟)的mRNA 表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05)(表5)。

表 5 脂肪沉積相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平 (變化倍數(shù))Table 5 The mRNA expression levels of fat deposition related genes in hypothalamic, abdominal fat,muscle or liver (Fold Change)

3 討論

通常情況下，高脂血癥合并非酒精性脂肪肝會伴隨肥胖、糖尿病和高血壓等代謝性疾病一起發(fā)生[8]。迄今，它們的病因復(fù)雜且尚未闡述明確，發(fā)病機制亦不十分清晰，這給高脂血癥和非酒精性脂肪肝一級防治帶來極大困難。

目前，常用的高脂血癥合并非酒精性脂肪肝動物模型利用高脂飲食法誘導(dǎo)成模[9]，隨著人們健康意識的加強，部分人膳食中的脂肪攝入控制后，仍然出現(xiàn)超重和高脂血癥合并非酒精性脂肪肝，這預(yù)示高脂飲食法造模存在一定的局限性。另外大部分高脂血癥合并非酒精性脂肪肝患者未篩查出高脂血癥合并非酒精性脂肪肝相關(guān)基因的突變或缺失，因而轉(zhuǎn)基因和基因剔除性模型是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的[10]。

高脂血癥和非酒精性脂肪肝的發(fā)生與下丘腦Leptin抵抗有關(guān)[11]。Leptin被認(rèn)為是一種新的肝病致病因子，Leptin 調(diào)控肝臟代謝的各種因子成為研究熱點。Leptin 抵抗使外周脂肪分解，血中游離脂防酸增加，促進(jìn)脂肪酸在肝內(nèi)蓄積。甘油三酯合成增多是引起脂肪肝重要原因之一[12,13]。本實驗結(jié)果顯示，SD 大鼠免疫Leptin 后，體質(zhì)量較KLH 對照組顯著增加；組織病理學(xué)觀察顯示，脂肪在皮下、腹部中沉積增多。Leptin 功能的異常能夠引起脂肪代謝異常，可使脂肪在血液中沉積，引起高脂血癥、心血管疾病等[14-17]。本實驗結(jié)果顯示，免疫Leptin 后，大鼠總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯比KLH組顯著升高，提示免疫Leptin 可引起大鼠發(fā)生高脂血癥。臨床上有些心血管病患者存在Leptin抵抗的現(xiàn)象(體內(nèi)內(nèi)源性的Leptin 分泌異常升高)，導(dǎo)致Leptin 在體內(nèi)蓄積，破壞心血管的內(nèi)皮細(xì)胞的正常新陳代謝[18]。免疫Leptin后，SD 大鼠腹部脂肪中Leptin 基因的mRNA 表達(dá)量升高，可能與Leptin 抵抗產(chǎn)生的機體代償機制相關(guān)，這一結(jié)果與臨床患有高血脂的肥胖患者情況十分相近。

另外，免疫Leptin 后，下丘腦PPAYγ 和肝臟SREBP-1 表達(dá)上調(diào)也會導(dǎo)致脂肪在肝臟的沉積。轉(zhuǎn)錄活化后的PPAYγ 參與調(diào)控脂類代謝[19]。PPAYγ 上調(diào)可以促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞的分化與增殖、脂肪儲存等，與本文結(jié)果一致。SREBP-1在肝臟脂肪化過程中起重要作用，肝內(nèi)葡萄糖增高是脂肪組織表達(dá)SREBP-1的主要正調(diào)控因子之一[5]。從本文結(jié)果可見，免疫Leptin 可能通過降低SREBP-1基因mRNA的表達(dá)來促進(jìn)在肝臟抗脂質(zhì)合成的效應(yīng)，肝臟SREBP-1 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了非酒精性脂肪肝的發(fā)生。Leptin 可促進(jìn)組織對葡萄糖的吸收和利用，阻礙葡萄糖進(jìn)入肝臟，免疫Leptin可能阻礙了內(nèi)源性Leptin與肝臟中Leptin受體的結(jié)合，從而抑制葡萄糖進(jìn)入肝臟，增加脂肪在肝臟的沉積。我們推測，大鼠免疫Leptin 后，內(nèi)源性Leptin 的功能受到抑制，脂肪細(xì)胞增大可能與Leptin受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中酪氨酸激酶(JAKs)和信號傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(STATs)的活化和磷酸化減弱有關(guān)，這個科學(xué)問題將是我們未來研究工作的重點之一。

綜上所述, 大鼠免疫Leptin 后, 出現(xiàn)高脂血癥和脂肪在皮下、腹部和肝臟沉積增多，這可能與脂肪代謝相關(guān)的Leptin、PPARγ 和SREBP-1 基因表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)，一定程度上為構(gòu)建新型高脂血癥和非酒精性脂肪肝大鼠模型提供科學(xué)依據(jù)。