宋姍姍，劉宗岳，叢 波，劉琳玲，宋興超，彭英華

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130112)

胰島素樣生長因子家族(Insulin-like growth factor，IGF)包括3個配體、3個細(xì)胞膜受體、6個結(jié)合蛋白和許多其他相關(guān)蛋白[1]。在哺乳動物中，胰島素調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，而胰島素樣生長因子1(IGF-1)是細(xì)胞生長的重要調(diào)控因子[2]。大部分循環(huán)的IGF-1是由肝臟產(chǎn)生的，生長激素可以調(diào)控肝臟表達(dá)IGF-1。然而，其他器官也可以產(chǎn)生自分泌和旁分泌的IGF-1，包括牛乳腺和肌肉[3]。胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)是一種受體-酪氨酸激酶，在對細(xì)胞生存和增殖至關(guān)重要的信號傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用。研究顯示，在多種腫瘤中IGF-1R出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡等方式促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4-5]。IGF-1R與原配體(IGF-1)結(jié)合引起一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，從而激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和mitogen活化蛋白激酶(MAPK)來促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]，誘導(dǎo)凋亡蛋白的磷酸化和抑制，阻斷細(xì)胞凋亡[7]。

IGF-1R基因多態(tài)性影響動物的生長，通過生物進(jìn)化樹分析大多數(shù)哺乳動物IGF-1R基因很保守[8]。為了進(jìn)一步探討IGF-1R基因的SNPs遺傳多態(tài)性和連鎖不平衡性，Lei等[9]針對雞的18個SNPs研究，發(fā)現(xiàn)A17299834G SNP與雞胴體的體質(zhì)量顯著相關(guān)，A17307750G、A17307494G SNP與早期生長性狀相關(guān)。Wu等[10]利用PCR-RFLP方法檢測邊雞IGF-1R基因2個多態(tài)位點(diǎn)，分別位于外顯子2和3上，在8，14，16，18周時，具有AluI酶切位點(diǎn)AA基因型的母邊雞體質(zhì)量高于AB基因型雞(P<0.05)；Hin1I酶切位點(diǎn)的CD基因型個體在6，8，10，12，14歲時體質(zhì)量較高于CC基因型 (P<0.05或P<0.01)。宋姍姍等[11]采用直接測序法在大體型水貂銀藍(lán)水貂和小體型水貂美國短毛黑水貂中篩查IGF-1R基因21個外顯子的SNPs，發(fā)現(xiàn)2個SNPs(c.207G>A、c.1782G>A)，分別位于在外顯子2和外顯子11上，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn) c.1782G>A與美國短毛黑水貂體質(zhì)量顯著相關(guān)，且雜合型AA型為優(yōu)勢基因型。Szewczuk等[12]采用PCR-RFLP方法發(fā)現(xiàn)IGF-1R基因可作為研究水貂生長性狀的一個候選基因，該基因的多態(tài)性及基因型效應(yīng)在不同種群水貂中不同，因此，本研究下一步可增加種群數(shù)量并對IGF-1R基因的多態(tài)性進(jìn)行分析，并與水貂生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為培育體型大的水貂和水貂的育種工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2017年12月打皮期3種群水貂共235只為研究對象，其中包括國外引進(jìn)品種紅眼白水貂118只，咖啡水貂50只，國內(nèi)培育品種金州黑水貂67只，取自大連名威貂業(yè)，打皮時心臟采血于5 mL真空采血管中，統(tǒng)計水貂個體測量體尺和體質(zhì)量數(shù)據(jù)。

1.2 血液全基因組DNA提取

血液DNA的提取采用傳統(tǒng)的酚氯仿法[13]。應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計方法檢測DNA的完整性、濃度及純度，將其質(zhì)量濃度稀釋成20 ng/μL，-20 ℃保存[14]。

1.3 PCR擴(kuò)增及測序分析

水貂IGF-1R序列外顯子2和外顯子11特異性引物設(shè)計參照參考文獻(xiàn)[11]，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以提取全基因DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL：模板DNA 1.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，TransStart KD Plus DNA Polymerase 1 μL、5×TransStart KD Plus Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，滅菌超純水32 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)數(shù)為35，72 ℃后延伸10 min。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，目的片段經(jīng)切膠純化后，16 ℃過夜連接到pEASY-Blunt Simple Cloning Kit載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)后挑平板上單菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性樣品后，送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.4 IGF-1R SNPs位點(diǎn)查詢及其基因型的判定

采用BioEdit軟件Clustal W Multiple alignment程序進(jìn)行IGF-1R基因序列的比對和分析，篩查SNPs位點(diǎn)；采用SeqMan軟件查看序列對應(yīng)的峰圖判定SNPs的基因型，單一峰為純合基因型，套峰為雜合基因型。

1.5 基因型、等位基因頻率及SNPs位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用Popgene1.32軟件分析基因型頻率和等位基因頻率，并利用SAS 9.1中的PROC GLM程序進(jìn)行SNPs位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析(SAS Institute, Inc, Cary, NC, USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增IGF-1R基因結(jié)果

利用設(shè)計的特異性引物對不同個體水貂IGF-1R基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物見圖1。2對特異性引物擴(kuò)增片段為180，236 bp，與預(yù)期設(shè)計擴(kuò)增長度相一致，進(jìn)行克隆反應(yīng)。

A.1-4. 引物2 PCR產(chǎn)物；B.1-4.引物11 PCR產(chǎn)物；M.DNA Marker DL2000.A.1-4.The PCR products of primer 2;B.1-4.The PCR products of primer 11;M.DNA Marker DL2000.

2.2 水貂IGF-1R基因鑒定

對純化后的2段PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆(圖2)、測序，獲得片段長度分別為180，236 bp，通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，序列一和序列二與NCBI公布的雪貂同源性達(dá)到99%，97%，可認(rèn)定克隆得到的2條序列為水貂IGF-1R基因序列。

A.1-10.引物2擴(kuò)增的PCR片段；B.1-4.引物11擴(kuò)增的PCR片段；M.DNA Marker DL2000。A.1-10. The PCR result of bacteria colony of primer 2; B. 1-4. The PCR result of bacteria colony of primer 11; M. DNA Marker DL2000.

2.3 SNPs位點(diǎn)篩查及基因型判定

參照雪貂IGF-1R基因序列信息分析2對引物的測序結(jié)果，獲得長度為180，230 bp的外顯子序列。采用BioEdit 7.0軟件對3種群水貂的測序結(jié)果進(jìn)行拼接比對，結(jié)果顯示，紅眼白水貂和金州黑水貂在引物2擴(kuò)增的序列檢測到c.207G>A，在引物11擴(kuò)增的序列檢測到c.1782G>A；咖啡水貂引物2擴(kuò)增的序列檢測到c.207G>A和c.218T>A，在引物11擴(kuò)增的序列檢測到c.1782G>A。其中紅眼白水貂、金州黑水貂和咖啡水貂c.207G>A和c.1782G>A位點(diǎn)都屬于無義突變，氨基酸未發(fā)生改變?？Х人鮟.218T>A位點(diǎn)屬于有義突變，氨基酸發(fā)生改變，脯氨酸變?yōu)榫彼帷＜t眼白水貂c.207G>A檢測到2個基因型；c.1782G>A檢測到3個基因型；金州黑水貂c.207G>A檢測到3個基因型；c.1782G>A檢測到3個基因型；咖啡水貂c.207G>A檢測到2個基因型，c.218T>A檢測到2個基因型，c.1782G>A檢測到3個基因型(圖3-9)。

圖3 紅眼白水貂c.207G>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.3 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.207G>A in red-eye white mink

圖4 紅眼白水貂c.1782G>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.4 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.1782G>A in red-eye white mink

圖5 金州黑水貂c.207G>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.5 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.207G>A in Jinzhou black mink

圖6 金州黑水貂c.1782G>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.6 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.1782G>A in Jinzhou black mink

2.4 SNPs位點(diǎn)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用PopGene32分析各SNPs位點(diǎn)的遺傳參數(shù)見表1，2。紅眼白水貂、咖啡水貂c.207G>A位點(diǎn)屬于低度多態(tài)(P<0.25)，其他位點(diǎn)在3種水貂中屬于中度多態(tài)(0.25

圖7 咖啡水貂c.207G>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.7 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.207G>A in coffee mink

圖8 咖啡水貂c.218T>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.8 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.218T>A in coffee mink

圖9 咖啡水貂c.1782G>A變異位點(diǎn)峰圖及分型圖Fig.9 Nucleotide sequence variation peak figure and genotyped chart of c.1782G>A in coffee mink

突變位點(diǎn)SNPs基因型與等位基因Genotype and allele不同水貂群體 Different populations of mink紅眼白水貂Red-eye white mink金州黑水貂Jinzhou black mink咖啡水貂Coffee minkc.207G>AGG0.90(106)0.34(23)0.83(43)GA0.10(12)0.54(36)0.14(7)AA0.12(8)G0.940.610.94A0.060.390.06c.218T>ATT0.48(24)TA0.52(26)T0.76A0.24c.1782G>AGG0.29(34)0.12(8)0.24(12)GA0.53(63)0.57(38)0.64(32)AA0.18(21)0.31(21)0.12(6)G0.560.390.56A0.440.610.44

表2 等位基因多態(tài)性群體遺傳結(jié)構(gòu)分析Tab.2 Population genetic structure based on allelic polymorphism data

2.5 IGF-1R基因SNPs位點(diǎn)與水貂生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

SNPs位點(diǎn)基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3。c.207G>A與金州黑水貂和咖啡水貂體長性狀顯著相關(guān)(P<0.05)，與紅眼白水貂體長性狀不顯著相關(guān)，其中金州黑水貂野生型GG基因型個體體長比突變雜合GA基因型和突變純合AA型的個體體長長；咖啡水貂野生型GG基因型個體體長長于突變雜合GA基因型。c.1782G>A與咖啡水貂的體長顯著相關(guān)(P<0.05)，與咖啡水貂的體質(zhì)量呈現(xiàn)差異極顯著相關(guān)(P<0.01)，其中優(yōu)勢基因型為突變雜合GA基因型，其體長、體質(zhì)量都顯著高于其他2個基因型個體。

合并基因型與水貂生長性狀關(guān)聯(lián)分析見表4。金州黑水貂合并基因型GGGA個體和GGAA個體的體長與GAGA個體體長差異極顯著(P<0.01)，基因型GGGA個體和GGAA個體的體長長于GAGA個體體長；金州黑水貂合并基因型GGGA個體體質(zhì)量與GAGA個體差異顯著(P<0.05)，GGGA個體體質(zhì)量高于GAGA基因型個體。試驗(yàn)可推斷得出合并基因型GGGA和GGAA可能是影響金州黑水貂體長體質(zhì)量的有利基因型。

表3 c.207G>A、c.218T>A 和c.1782G>A位點(diǎn)不同基因型與3種群水貂生長性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Correlation between different genotypes and growth traits of c.207G>A, c.218T>A and c.1782G>A sites in three groups

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。表4同。

Note: Different small letters in each column mean significant difference(P<0.05); while capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).The same as Tab.4.

表4 c.207G>A、c.218T>A 和c.1782G>A位點(diǎn)合并基因型與3種群水貂生長性狀關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Correlation between different combination genotypes and growth traits of c.207G>A, c.218T>A and c.1782G>A sites in three groups

3 結(jié)論與討論

經(jīng)典育種方案通過表型篩選和利用系譜信息實(shí)現(xiàn)遺傳改良。這些項(xiàng)目提高了大多數(shù)現(xiàn)有作物品種和動物品種的生產(chǎn)力。然而，分子輔助育種的進(jìn)展可以提高育種者選擇最佳基因組合的優(yōu)良表型的效率。與數(shù)量性狀相關(guān)的基因組區(qū)域(QTL)可以使用多態(tài)DNA標(biāo)記繪制，如微衛(wèi)星或SNPs(單核苷酸多態(tài)性)[15]。這種關(guān)聯(lián)可以加速育種方案的結(jié)果，使優(yōu)等個體的早期識別具有更高的精度[16]。

動物的生長軸為GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，IGF-1R基因作為生長軸的終端與IGF-1結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，它們形成的復(fù)合體能促進(jìn)IGF-1R酪氨酸殘基自身磷酸化，信號級聯(lián)激活磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和Ras蛋白信號通路從而阻斷細(xì)胞凋亡[17]，調(diào)控GH的分泌、影響機(jī)體生長發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增殖和分化[18]。因此，進(jìn)一步對水貂IGF-1R基因的生物學(xué)功能進(jìn)行研究顯得尤為重要。

先前在大體型銀藍(lán)水貂和小體型美國短毛黑兩種群水貂研究IGF-1R基因，在外顯子2和外顯子11中發(fā)現(xiàn)2個SNPs，性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)c.1782G>A與美國短毛黑水貂體質(zhì)量顯著相關(guān)，且AA型為優(yōu)勢基因型[19]。本研究中，在紅眼白水貂、金州黑水貂和咖啡水貂3種群水貂中發(fā)現(xiàn)3個SNPs，其中2個SNPs與先前研究相同，氨基酸分析發(fā)現(xiàn)兩突變位點(diǎn)均為同義突變，其氨基酸并未發(fā)生改變，但有研究表明，同一氨基酸的密碼子有數(shù)量不等的tRNA，蛋白質(zhì)表達(dá)的速度和數(shù)量將不同[20]。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)c.207G>A與金州黑水貂和咖啡水貂體長性狀顯著相關(guān)(P<0.05)，與紅眼白水貂體長性狀不顯著相關(guān)，c.1782G>A與咖啡水貂的體長顯著相關(guān)，GA基因型個體體長與AA基因型個體體長差異顯著，且GA基因型個體體質(zhì)量與AA基因型個體體質(zhì)量差異極顯著。同時在咖啡水貂中發(fā)現(xiàn)一個新的SNPs：c.218T>A，該位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸分析發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)屬于有義突變，氨基酸發(fā)生改變，脯氨酸變?yōu)榫彼?。但進(jìn)一步的性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與水貂體長體質(zhì)量性狀并無顯著相關(guān)性，本研究由于樣品量較少，該結(jié)論需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。試驗(yàn)表明，c.207G>A位點(diǎn)GG基因型是水貂體長的優(yōu)勢基因型，進(jìn)一步進(jìn)行了合并基因型與水貂生長性狀關(guān)聯(lián)分析，GGGA基因型和GGAA可能是影響金州黑水貂體長體質(zhì)量的有利基因型。

綜上，IGF-1R基因可作為研究水貂生長性狀的一個候選基因，該基因的多態(tài)性及基因型效應(yīng)在不同種群水貂中不同。應(yīng)增加對IGF-1R基因的多態(tài)性及功能的研究，并分析其在水貂發(fā)育機(jī)制早中期的影響，及其該基因的生物學(xué)功能。揭示該候選基因在水貂生長發(fā)育過程中的作用機(jī)制。