沈丹鳳 劉克堅(jiān) 王 燕 蔣 華

心肌缺血是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的常見(jiàn)的重要原因，心肌持續(xù)缺氧缺血導(dǎo)致心肌壞死、心臟衰竭等是影響人類生活質(zhì)量的關(guān)鍵[1]。缺氧能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而過(guò)量的心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌組織損傷，進(jìn)而引起的心肌功能障礙，是心肌缺血損傷發(fā)生的機(jī)制之一[2]。細(xì)胞自噬被認(rèn)為是機(jī)體自我保護(hù)的一種方式，其在缺氧缺血程度較輕時(shí)可以通過(guò)降解功能異常的細(xì)胞器維持正常的細(xì)胞活動(dòng)，長(zhǎng)時(shí)間的缺氧能夠降低心肌細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)細(xì)胞損傷[3,4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silence Information Regulator 1,Sirt1)是一個(gè)與細(xì)胞程序性死亡有關(guān)的蛋白酶，其可以調(diào)控細(xì)胞的新陳代謝、生長(zhǎng)、凋亡及自噬。有研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等過(guò)程中Sirt1表達(dá)下調(diào)，并且具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和減少細(xì)胞凋亡的作用[5,6]。目前關(guān)于Sirt1在缺氧條件下對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和自噬中的作用尚不明確，本研究以心肌H9c2細(xì)胞為對(duì)象，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)Sirt1表達(dá)水平，評(píng)估Sirt1對(duì)缺氧心肌細(xì)胞自噬和凋亡的作用，為研究Sirt1在心肌缺血損傷中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

心肌H9c2細(xì)胞購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；Sirt1真核表達(dá)載體(pIRES2-EGFP-Sirt1)由漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；ab2302 Cleaved Caspase-3抗體、ab32503 Bax抗體、ab207612 Beclin-1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；14600-1-AP LC3抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group；MA0220 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；M2128 MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；6210A反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RR820A SYBR熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自大連Takara公司;11668-027 Lipfectamine 2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司；SPECTRAMAX 340PC384酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 H9c2細(xì)胞分組及處理

H9c2細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前12h，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液同步化處理后種植到6孔板中，每孔中添加106個(gè)細(xì)胞(用于細(xì)胞存活率檢測(cè)時(shí)每孔細(xì)胞密度為5×104/ml)，置于94% N2、1%O2和5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧處理24h，記為Hypoxia組。H9c2細(xì)胞在5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)記為Control組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞，其密度為80%時(shí)用Lipfectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。將轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Sirt1和陰性對(duì)照24h后的細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，以800μg/ml G418篩選陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-Sirt1和陰性對(duì)照后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述缺氧處理24h后分別記為Sirt1+Hypoxia組和NC+Hypoxia組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)Hypoxia、Sirt1+Hypoxia、NC+Hypoxia組細(xì)胞中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)變化。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)Sirt1 mRNA水平

取出細(xì)胞，在細(xì)胞中添加Trizol溶液，置于冰上反復(fù)吹打，按照Trizol說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)A260/A280的比值確定RNA的純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)SYBR熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參設(shè)置為GAPDH。收集熒光信號(hào)，采用2-△△Ct法計(jì)算Sirt1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。GAPDH forward 5’-CCA CCC ATG GCA AAT TCC-3’，reverse 5’-TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G-3’; Sirt1 forward 5’-TAG GCG GCT TGA TGG TAA T-3’，reverse 5’-ATG GGT TCT TCT AAA CTT GGA CT-3’。

1.4 Western blot檢測(cè)Sirt1蛋白水平

取出細(xì)胞，用蛋白提取試劑提取細(xì)胞中的總蛋白，采用BCA法定量。分別配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，在每個(gè)上樣孔中添加40μg的蛋白樣品。在濃縮膠中使用80V的電壓電泳，在分離膠中使用120V的電壓電泳。2h后，觀察蛋白進(jìn)入到電泳槽的底部以后，取出凝膠。取大小合適的PVDF膜，設(shè)置160mA恒流轉(zhuǎn)膜60min。將PVDF膜置于TBST溶液中，搖床孵育2h。按照1∶400配制Sirt1抗體孵育液，將PVDF膜置于其中在4℃過(guò)夜后，轉(zhuǎn)移到二抗反應(yīng)液中，二抗以1∶4 000稀釋，GAPDH為內(nèi)參照。經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光以后，在凝膠成像儀中拍照曝光。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)量。Sirt1蛋白相對(duì)表達(dá)水平=Sirt1蛋白灰度值÷GAPDH蛋白灰度值。

1.5 MTT檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率

在分組處理24h的各組細(xì)胞中每孔添加20μl MTT溶液，孵育4h以后，倒掉孔內(nèi)液體，添加150μl二甲基亞砜溶液，再孵育10min后，測(cè)定470nm波長(zhǎng)處每孔的A值，經(jīng)過(guò)不含細(xì)胞的孔調(diào)零以后，常規(guī)方法分析細(xì)胞存活率變化。各組細(xì)胞存活率為該組細(xì)胞A值與Control組細(xì)胞A值的比值×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

用Annexin V-FITC/PI試劑盒流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡，取Control、Hypoxia、NC+Hypoxia和Sirt1+Hypoxia組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，再用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮，添加Annexin V-FITC和PI染液混合孵育15min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞總凋亡率。

1.7 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3、LC3、Beclin-1蛋白水平

Bax、Cleaved Caspase-3、LC3、Beclin-1抗體分別以1∶400、 1∶200、 1∶400、 1∶600稀釋。其余操作步驟同1.4。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白灰度值÷GAPDH蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Sirt1真核表達(dá)載體對(duì)缺氧條件下心肌細(xì)胞中Sirt1表達(dá)影響

各組心肌細(xì)胞Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hypoxia組心肌細(xì)胞中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于Control組(t=8.323、4.359，P<0.05)。Sirt1+Hypoxia組心肌細(xì)胞中Sirt1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于NC+Hypoxia組(t=7.657、5.277，P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

表1 各組心肌細(xì)胞中Sirt1 mRNA和蛋白水平比較均=3)

注：與Control組比較，1)P<0.05；與NC+Hypoxia組比較，2)P<0.05

2.2 過(guò)表達(dá)Sirt1提高缺氧條件下心肌細(xì)胞存活率

各組心肌細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hypoxia組心肌細(xì)胞存活率低于Control組(t=6.126，P<0.05)。Sirt1+Hypoxia組心肌細(xì)胞存活率高于NC+Hypoxia組(t=3.449，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌細(xì)胞存活率和凋亡率比較均=3)

注：與Control組比較，1)P<0.05；與NC+Hypoxia組比較，2)P<0.05

2.3 過(guò)表達(dá)Sirt1抑制缺氧條件下心肌細(xì)胞凋亡率

各組心肌細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hypoxia組心肌細(xì)胞凋亡率高于Control組(t=15.925，P<0.05)。Sirt1+Hypoxia組心肌細(xì)胞凋亡率低于NC+Hypoxia組(t=5.617，P<0.05)。見(jiàn)圖2和表2。

2.4 過(guò)表達(dá)Sirt1減少缺氧條件下心肌細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平

各組心肌細(xì)胞Bax、Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hypoxia組心肌細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平高于Control組(t=11.385、5.025，P<0.05)。Sirt1+Hypoxia組心肌細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平低于NC+Hypoxia組(t=5.481、1.954，P<0.05)。Hypoxia組心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1水平低于Control組(t=8.221、8.726，P<0.05)。Sirt1+Hypoxia組心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1水平高于NC+Hypoxia組(t=5.265、5.410，P<0.05)。見(jiàn)圖3和表3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡變化

圖3 Western blot檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1蛋白水平

組 別BaxCleavedCaspase-3LC3-Ⅱ/ⅠBeclin-1Control組0.15±0.060.22±0.034.25±0.360.89±0.10Hypoxia組0.69±0.071)0.40±0.041)2.47±0.201)0.39±0.051)NC+Hypoxia組0.68±0.050.39±0.062.51±0.260.40±0.06Sirt1+Hypoxia組0.42±0.052)0.32±0.042)3.65±0.212)0.71±0.062)F值58.2210.7432.8836.60

注：與Control組比較，1)P<0.05；與NC+Hypoxia組比較，2)P<0.05

3 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞特有的生物學(xué)特性，參與疾病的發(fā)生[7]。細(xì)胞凋亡受到細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的調(diào)控作用，Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族是目前發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的調(diào)控因子；Bax是Bcl-2蛋白家族成員，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生；Caspase-3是細(xì)胞Caspase凋亡反應(yīng)的執(zhí)行因子，只有活化后才可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[8-11]。細(xì)胞自噬是除細(xì)胞凋亡外的細(xì)胞程序性死亡方式，是細(xì)胞的自我保護(hù)方式之一[12-14]。缺氧條件下心肌細(xì)胞凋亡和自噬異常是心肌損傷發(fā)生的主要原因，LC3和Beclin-1是細(xì)胞自噬的標(biāo)志蛋白[13]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的缺氧處理可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬水平下降[3,4]。本次實(shí)驗(yàn)表明，缺氧處理后心肌細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平升高，細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1水平降低，說(shuō)明缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并減少細(xì)胞自噬，成功構(gòu)建了缺氧心肌細(xì)胞損傷模型。

Sirt1被認(rèn)為是機(jī)體自我保護(hù)分子，調(diào)控細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)、衰老，Sirt1可以通過(guò)調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞中p53、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子、成肌分化蛋白、組蛋白、核因子κB等的活性發(fā)揮作用[15-18]。Sirt1與心血管系統(tǒng)疾病有關(guān)，參與心肌肥大、心肌衰老等病理過(guò)程[19]。白藜蘆醇可以提高心肌細(xì)胞自噬程度的同時(shí)能夠提高Sirt1表達(dá)水平，Sirt1可能在缺氧心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)Sirt1在缺氧心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)Sirt1減少缺氧心肌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)自噬蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)，說(shuō)明Sirt1可抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)自噬，具有抗缺氧心肌細(xì)胞損傷的作用，本文結(jié)果與上述研究結(jié)果相符，證實(shí)了Sirt1在缺氧心肌細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明Sirt1在體外缺氧心肌細(xì)胞凋亡和自噬中的作用，通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬和減少細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，這為研究Sirt1在心肌損傷中的作用提供了依據(jù)。目前對(duì)于Sirt1在心肌損傷保護(hù)中的作用機(jī)制尚不明確，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)探討。