摘要：本文從細(xì)胞生物學(xué)方面闡述了無融合生殖甜菜M14絨氈層異常導(dǎo)致花粉敗育的機理、通過解剖花藥及壓片法技術(shù)觀察小孢子發(fā)生機制，利用生物學(xué)手段化學(xué)誘導(dǎo)的方法，克隆部分與絨氈層特異表達(dá)相關(guān)的基因，無融合生殖型和減數(shù)分裂型同時存在于甜菜M14之中，運用生物技術(shù)手段實現(xiàn)絨氈層對無融合生殖甜菜花粉發(fā)育的調(diào)控未能成功，花粉敗育率達(dá)80%左右j

關(guān)鍵詞：無融合生殖;絨氈層;花粉敗育

無融合生殖甜菜（apomixis）是指通過種子進行繁殖的特殊的無性繁殖方式【1】，產(chǎn)生的子代基因型與親本精確相同，因此，能固定雜種優(yōu)勢，具有重要的應(yīng)用前景。

研究表明，絨氈層細(xì)胞發(fā)育過程中的任何異常，都可能直接或間接導(dǎo)致花粉粒的敗育，形成雄性不育[2.31植物絨氈層作為花藥壁最內(nèi)層細(xì)胞，是向花粉母細(xì)胞運輸物質(zhì)的樞紐，對花粉母細(xì)胞及后期小孢子的正常發(fā)育起著至關(guān)重要的作用【4】。絨氈層細(xì)胞徑向膨大，細(xì)胞內(nèi)含物極少，其營養(yǎng)無法滿足自身發(fā)育需要，反而通過徑向伸長以吸取小孢子四分體中營養(yǎng)，導(dǎo)致小孢子營養(yǎng)流失不能正常生長發(fā)育而形成花粉敗育[5】。研究無融合生殖甜菜絨氈層細(xì)胞發(fā)育對花粉敗育機理的影響，將有助于對無融合生殖甜菜的深入研究，在遺傳育種方面研創(chuàng)優(yōu)良品系同樣具有非常重要的意義。目前為止，國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)對無融合生殖甜菜M14花粉敗育機理的研究分析及報道，因此，啟動了本項研究工作。

1材料及方法

1.1試驗材料

黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院甜菜課題組于1988年開始利用栽培甜菜與野生白花甜菜雜交，由于當(dāng)時選擇了適宜的非整倍體初級三體PT6（W+ 1C，2n =18+1）作為雜交親本，提供了一個不減數(shù)配子（2n）與引種于英國皇家植物園的帶有無融合生殖特性的野生種白花甜菜（Beta corolliflora ZOSS，cccc，2n=4x =36）雜交。獲得了一株真實雜種（VVCC，2n= 36）的雜種F1代，利用PT6回交，經(jīng)過細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定表明：共獲得9種類型的單體附加系系列，其中M14株系為帶有白花甜菜第9號染色體的栽培型甜菜單體附加系，表明將帶有無融合生殖基因的一條白花甜菜染色體轉(zhuǎn)移到栽培甜菜（ PT6）中，使原來只能進行有性生殖的栽培甜菜可以高效表達(dá)無融合生殖特性[6-7]。本文中的M14傳遞率高達(dá)96. 5%能穩(wěn)定傳遞后代，經(jīng)過十余年的雜交工作首次在世界上獲得帶有一條白花甜菜染色體的栽培型（Ⅸ）甜菜單體附加系M14（Beta vulgaris L，VV+1C、2n=18+1），通過胚胎學(xué)判定為兼性無融合生殖【8】。單體附加系甜菜M14近100%傳遞和異緣三倍體甜菜（wc）傳遞率達(dá)80%以上的材料均屬世界首創(chuàng)，為進一步克隆無融合生殖基因提供極具研究價值的優(yōu)質(zhì)實驗材料【9-10】。

1.2試驗方法

在夏季6-7月份，到田間取甜菜的花序，用卡諾固定液固定24h，再轉(zhuǎn)入70%酒精中放人4℃冰箱長期固定。通過解剖鏡將花藥分離，用鹽酸乙醇混合液1：1解離，石炭酸品紅染色，壓片，使細(xì)胞分散并處在同一平面內(nèi)，不重疊以便于觀察、統(tǒng)計計數(shù)及分析。用丁香油（ clove oil）封片。在OLYMPUS-BX51型熒光顯微鏡下通過熒光顯微鏡技術(shù)觀察和攝影并進行統(tǒng)計處理和數(shù)據(jù)分析。制片觀察分析樣本，以證明花粉敗育情況和無融合生殖甜菜小孢子發(fā)生機制。

利用100-150ppm的利用100-150ppm的2，4-D、萘乙酸（ NAA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、激動素（KT）及秋水仙素等植物生長激素，在甜菜M14和異緣三倍體甜菜（wc）開花季節(jié)（6-8月），用微型噴霧器噴灑在正在開花的花序枝條上，選取不同株系的異緣三倍體甜菜（wc）和單體附加系甜菜M14，同一株系以不同分支為單位，噴灑200 - 500朵花，10月份按不同處理分別收取種子，冬季溫室播種按鏡檢方法統(tǒng)計傳遞率。

2結(jié)果與分析

2.1無融合生殖甜菜M14不同花序傳遞率分析

隨機選取3株甜菜，每株取5 -10個花序，各株系不同花序的單體附加系后代傳遞率高且差異較小。傳遞率分別為96 5%、95 2%和94 7%。說明單體附加系甜菜傳遞率高而穩(wěn)定。

無融合生殖甜菜單體附加系（ VV+1C，2n=19）在開放傳粉條件下繁殖時，可結(jié)實形成種子傳遞后代，連續(xù)多年傳遞率檢查，產(chǎn)生頻率變化范圍在6 .83% - 13 70%，而異緣三倍體甜菜（ wc，2n=27）的傳遞率變化在24 86% - 27 08%.二倍體甜菜（w，2n=18）變化在55 76% - 60 33%。結(jié)果證明，異緣三倍體甜菜和單體附加系甜菜是可以高頻穩(wěn)定傳遞的，但傳遞過程中會同時產(chǎn)生少量的非整倍體和二倍體，從而異緣三倍體甜菜（ vvc，2n=27）的傳遞率和后代觀察中無融合生殖后代可分為兩種類型：無融合證明材料具有兼性無融合生殖特性。

2.2不同激素的影響結(jié)果

利用激素刺激試圖提高無融合生殖傳遞率，用2，4-D、萘乙酸（ NAA）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），激動素（KT）及秋水仙素等植物生長激素的溶液噴灑在花期的無融合生殖甜菜的花序。根據(jù)處理的花數(shù)與結(jié)實粒數(shù)之比，計算出結(jié)實率與普通栽培甜菜比較，無融合生殖甜菜的結(jié)實率都比較低，一般小于10%。不同激素處理結(jié)果2，4-D結(jié)實率較高，45.1% -91 .6%。萘乙酸（NAA）結(jié)實率大5 3%-91 6%。其他激素誘發(fā)結(jié)實率都較低，不同株系之間也有差異。雖然激素誘發(fā)刺激結(jié)實，增加了結(jié)實效率，但所結(jié)實空殼率很高，出苗率很低，說明化學(xué)刺激誘發(fā)了花萼的發(fā)育而不能提高無融合生殖甜菜的傳遞效率。

3討論

從無融合生殖甜菜的利用來看，希望獲得穩(wěn)定傳遞的無融合生殖類型，證實來自白花甜菜的一條染色體或染色體組決定了無融合生殖或兼性無融合生殖。但實驗過程中發(fā)現(xiàn)材料存在兩種類型：無融合生殖型和減數(shù)分裂型。之前對無融合生殖不夠深入了解，沒有控制好兩種類型的傳遞。由于減數(shù)分裂型甜菜接受外來花粉的能力較強，因此，在后代中產(chǎn)生了各種非整倍體的現(xiàn)象。

在高頻傳遞具有無融合生殖基因的背景下，由于該甜菜結(jié)實率較低，希望通過化學(xué)誘發(fā)提高傳遞率和結(jié)實率。表面上看種子膨大了，但實際上并沒有形成胚而發(fā)育成種子。種子膨大的結(jié)果是激素刺激了萼片的發(fā)育，而沒有促進胚珠的形成和發(fā)育。不能真正提高無融合生殖的傳遞率。當(dāng)然不排除藥物濃度不恰當(dāng)及藥物種類選擇的不適宜，還有可能是與試驗的次數(shù)少有關(guān)。為了進一步證實無融合生殖花粉敗育的機理，還應(yīng)當(dāng)進一步深入研究。

參考文獻

【1】Nogler G A.Genetics of apospory in apomictic. Ranuncu-lus auricomus V.Conclusio ns Bot Helv，1984，94： 411 - 422

【2】劉麗萍，劉巧紅.唐艷.陶鑫.甜菜染色體操縱材料遺傳學(xué)特性及經(jīng)濟性狀的研究【J】黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2017，34（06）：708 - 713

【3】Huang MD. Hsing Yl， Huang AH .Transcriptomes of theanther sporophyte availability and uses 【J】Plant Cell Physiol，2011， 52（ 09）：1459 -1466

【4】Pacini E.Tapetum character states： analytical keys for tape-tum types and activities[J】Can J Bot，1997， 75（09）： 1448 -1459

[5】劉麗萍，劉巧紅，閆賡，郭德棟單體附加系甜菜及空中搭載實驗材料相關(guān)性狀的研究【J】中國農(nóng)學(xué)通報，2018，34（30）：37 - 41

[6]鄭佳玲，劉麗萍遠(yuǎn)緣雜交甜菜M14野生基因相關(guān)性狀的研究【J】吉林農(nóng)業(yè)，2018，（20）：052-054

【7】郭德棟，康傳紅，劉麗萍等異緣三倍體甜菜（ VVC）無融合生殖的研究【J】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，（04）：113-114

【8】梅其文，胡偉明，吳燁東，李海英甜菜M14品系特異表達(dá)基因ESTs的生物信息學(xué)分析【J】黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2007，（05）.