翟曉光，辛 芳，韓玉翠，夏雪姣，朱 婷，菅明陽，丁 勤，馬翎健

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，其總產(chǎn)量居世界首位；小麥消費(fèi)量同樣位居世界首位，并且隨著人口的增長和消費(fèi)水平的不斷提高，預(yù)計消費(fèi)量將繼續(xù)增加[1]。如何提高小麥單產(chǎn)、改善品質(zhì)和增強(qiáng)適應(yīng)性對我國乃至世界糧食安全有著重大意義。雜種優(yōu)勢利用是作物產(chǎn)量提高的一條重要途徑，可使小麥單產(chǎn)增加3.5%～15%，但全球雜交小麥種植面積不到小麥總面積的0.2%[2-3]。雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，因此對雄性不育的研究意義重大[4-5]。

絨氈層位于植物花藥壁細(xì)胞的最內(nèi)一層，為雄配子發(fā)育提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，其合成分泌的酶類和花粉壁前體物質(zhì)對小孢子的正常發(fā)育有重要作用[6]。對擬南芥[7]、水稻[8]、油菜[9]、玉米[10]和小麥[11]的研究發(fā)現(xiàn)，敗育原因大多數(shù)都與絨氈層的異?；顒佑嘘P(guān)。絨氈層的提前或延遲程序性死亡會導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常和花粉敗育，但是不同材料的敗育時期和花藥細(xì)胞學(xué)特征不盡相同[12-15]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)絨氈層分泌合成的孢粉素是小孢子發(fā)育階段的關(guān)鍵蛋白，RAFTIN1基因又與孢粉素轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，將RAFTIN1基因沉默導(dǎo)致植株出現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象。對水稻不育機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，參與絨氈層發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子EAT1突變體不育系中的兩個天冬氨酸蛋白酶基因(OsAP25和OsAP37)的表達(dá)量與保持系相比顯著提高，促使絨氈層細(xì)胞提前降解導(dǎo)致敗育[17]。

前人對小麥不同類型雄性不育系花藥發(fā)育細(xì)胞學(xué)研究較多[18-22]，但對小麥雄性不育系花藥發(fā)育過程中絨氈層亞顯微結(jié)構(gòu)的研究報道較少，分析絨氈層結(jié)構(gòu)變化與相關(guān)基因表達(dá)之間關(guān)系的研究更少。本研究對K型非1B/1R小麥雄性不育系花藥絨氈層結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)觀察，并對與孢粉素轉(zhuǎn)運(yùn)和絨氈層細(xì)胞降解相關(guān)的兩個基因RAFTIN1和APs進(jìn)行表達(dá)模式分析，旨在明確其敗育機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

K型非1B/1R小麥雄性不育系K519A及其保持系519B，由西北農(nóng)林科技大學(xué)雜交小麥課題組創(chuàng)制，具有敗育徹底、穩(wěn)定、恢復(fù)源廣、農(nóng)藝性狀良好和不產(chǎn)生單倍體等優(yōu)點。2016年10月3日將其種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗田(陜西楊凌)，每個材料各種4行，行長2 m，行距25 cm，株距5 cm，3次重復(fù)，田間管理同常規(guī)。

按宋喜悅等[23]描述的方法，根據(jù)小麥外部形態(tài)取幼穗小花花藥制片(1%醋酸洋紅染色)，于顯微鏡下觀察，確定花藥發(fā)育時期。分別取處于小孢子母細(xì)胞期、四分體期、單核期、二核期和三核期的花藥各10粒，迅速投入4%戊二醛中固定，利用真空泵抽氣使花藥浸沒，然后4 ℃避光保存，用于透射電鏡制樣。取上述發(fā)育時期的小麥花藥各0.1 g (15～20穗)，每個時期設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，迅速放入液氮冷凍后置于-80 ℃保存，用于總RNA的提取。

1.2 切片觀察和小孢子細(xì)胞壁厚度的測定

參照Geng等[24]的方法，將戊二醛固定的花藥制成半薄和超薄切片。用Leica RM2265全自動半薄輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica，德國)切1 μm的半薄切片，0.03 mol·L-1甲苯胺藍(lán)染色15 s，并用Axio Imager M2生物顯微鏡(ZEISS，德國)觀察拍照；用Leica-S型切片機(jī)(Leica，德國)超薄切片，放置在200目的銅網(wǎng)上，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，于Hitach H7700透射電鏡(HITACHI，日本)觀察拍照。

從照片中隨機(jī)選花粉粒細(xì)胞壁的20個點，測量胞壁厚度(d)，計算小孢子細(xì)胞壁的真實厚度(h)。h=d/x，x為放大倍數(shù)。

1.3 qRT-PCR分析

利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa，日本)提取總RNA，按照PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa，日本)操作說明合成cDNA第一鏈， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)RAFTIN1(GenBank登錄號AJ575663.1)、APs(GenBank登錄號AK332620.1)和Actin(GenBank登錄號AB181991.1)基因序列，應(yīng)用軟件Primer Premier 6.0 設(shè)計引物，并在Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)檢測引物的特異性。引物序列分別為ActinF:5′-TACTCCCTCACAACAA- CCGC-3′,ActinR:5′-CTCCTAGCCGTTTCCA- GCTC-3′;RAFTIN1F:5′-GCGCCACCGATGA- ATACAAG-3′,RAFTIN1R:5′-AAGAACACC- GTCGTCGTCTC-3′;APsF:5′-CTTCAACACG- GACGAGGTGG-3′,APsR:5′-TGTGGATCAG-CGTGTTCTCC-3′，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

參照SYBR Premix ExTaqⅡ(TaKaRa，日本)說明書進(jìn)行體系配置和程序擴(kuò)增，用Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex熒光定量儀(ABI，美國)進(jìn)行qRT-PCR。用2-△△CT法[25]計算基因的相對表達(dá)量，用Excel軟件和SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 K型不育系花藥絨氈層的顯微結(jié)構(gòu)

對比K519A不育系與其保持系的整個發(fā)育時期，發(fā)現(xiàn)不育系絨氈層細(xì)胞提前異常降解。在小孢子母細(xì)胞時期，保持系花藥絨氈層細(xì)胞排列整齊緊密，而不育系花藥絨氈層細(xì)胞之間間隙較大，且與保持系相比體積明顯較大(圖1A、1F)。至四分體時期，保持系花藥的絨氈層細(xì)胞體積明顯增大，特別是橫向細(xì)胞間距增大，具有濃厚細(xì)胞質(zhì)。而不育系花藥的絨氈層開始萎縮，部分絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)雙核，絨氈層提前異常降解，少數(shù)降解異常的絨氈層細(xì)胞侵入藥室內(nèi)(圖1B、1G)。發(fā)育進(jìn)入單核期，保持系絨氈層細(xì)胞萎縮，部分邊緣模糊化，細(xì)胞整體輪廓仍正常且排列依然緊密，小孢子細(xì)胞呈圓形。而此時不育系絨氈層細(xì)胞異常肥大，細(xì)胞粘連在一起難以分清界限，細(xì)胞邊緣模糊并逐漸解體，細(xì)胞質(zhì)染色較淺。此時期不育系小孢子細(xì)胞形狀不規(guī)則，且與保持系相比小孢子細(xì)胞壁較厚(圖1C、1H)。至二核期，絨氈層迅速降解，保持系絨氈層細(xì)胞剩余殘跡，而不育系絨氈層細(xì)胞只剩下細(xì)胞輪廓，小孢子細(xì)胞壁明顯增厚，不育系部分小孢子染色異常(圖1D、1I)。三核期保持系絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步自溶而降解，為小孢子的發(fā)育提供各種營養(yǎng)物質(zhì)，不育系花藥壁只剩表皮和花藥內(nèi)壁。小孢子形態(tài)各異，保持系中可觀察到小孢子內(nèi)存在液泡和細(xì)胞核，而不育系花粉粒染色異常，液泡較小，甚至一部分花粉粒全部染色，大部分花粉粒細(xì)胞壁內(nèi)出現(xiàn)一圈空囊(圖1E、1J)。

2.2 K型不育系花藥絨氈層的亞顯微結(jié)構(gòu)

與半薄組織切片觀察相比，超薄切片更能清晰地觀察絨氈層的發(fā)育過程。花藥小孢子母細(xì)胞時期，保持系花藥絨氈層細(xì)胞之間存在間隙，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，絨氈層細(xì)胞正處在有絲分裂中期，細(xì)胞核較大且核中染色體短粗，染色很深，數(shù)目清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一的囊泡，細(xì)胞器豐富，小孢子母細(xì)胞緊貼絨氈層細(xì)胞(圖2A)。而不育系花藥絨氈層細(xì)胞間隙明顯比保持系的大，且絨氈層細(xì)胞橫向距離達(dá)到最大，細(xì)胞多為雙核細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)有大小不一的小泡，此時期不育系絨氈層細(xì)胞同保持系花藥四分體時期絨氈層細(xì)胞的發(fā)育程度相似(圖2G)。

發(fā)育至四分體時期，保持系花藥絨氈層細(xì)胞之間的間隙增大，絨氈層細(xì)胞橫向增大，有絲分裂結(jié)束，細(xì)胞核縮小、核仁出現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)濃厚，內(nèi)含豐富的細(xì)胞器，囊泡變大(圖2B)。不育系花藥絨氈層細(xì)胞開始萎縮，部分絨氈層細(xì)胞降解并脫離中層細(xì)胞侵入藥室內(nèi)(圖2H)。

發(fā)育至單核期，保持系花藥絨氈層細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞開始降解。不育系花藥絨氈層降解更為明顯，且絨氈層藥室側(cè)的細(xì)胞膜上出現(xiàn)烏氏體(圖2C、2I)。此時期小孢子增大，靠近絨氈層細(xì)胞，保持系花藥小孢子細(xì)胞壁厚度僅為0.43 μm，而不育花藥小孢子細(xì)胞壁厚度為1.01 μm，是保持系花藥小孢子細(xì)胞壁厚度的2.35倍(圖2C、2I)。

發(fā)育至二核期，絨氈層迅速降解，只剩下部分殘跡和絨氈層膜，保持系花藥絨氈層細(xì)胞膜表面附著大量烏氏體，而不育系花藥絨氈層細(xì)胞膜表面附著的烏氏體量較少。中層細(xì)胞降解完全，花藥內(nèi)壁細(xì)胞增厚，細(xì)胞質(zhì)濃厚，不育系的花藥內(nèi)壁液泡化程度增大，液泡幾乎占據(jù)了整個細(xì)胞。此時期小孢子細(xì)胞壁增厚，保持系小孢子細(xì)胞壁增厚至3.05 μm，不育系小孢子細(xì)胞壁厚度為2.81 μm，小孢子細(xì)胞表面附著大量孢粉素，細(xì)胞質(zhì)變濃(圖2D、2J)。

Ⅰ-stage：小孢子母細(xì)胞期；Ⅱ-stage：四分體期；Ⅲ-stage：單核期；Ⅳ-stage：二核期；Ⅴ-stage：三核期。放大倍數(shù)：400。

Ⅰ-stage:Microspore mother cell stage; Ⅱ-stage:Tetrad stage; Ⅲ-stage:Mononuclear stage; Ⅳ-stage:Binuclear stage; Ⅴ-stage:Trinuclear stage.Magnification:400.

圖1保持系519B(圖A～E)和不育系K519A(圖F～J)的花粉囊及小孢子發(fā)育過程

Fig.1Cytologicalstructuresofantherandmicrosporeofmaintainer519B(panelsAtoE)andmalesterilelineK519A(panelsFtoJ)

至三核期，絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步自溶和降解，保持系絨氈層膜上附著了大量烏氏體，與保持系花藥相比，不育系花藥絨氈層細(xì)胞膜表面附著的烏氏體量明顯較少(圖2E、2K)。保持系花藥小孢子細(xì)胞壁繼續(xù)增厚，細(xì)胞核較大、核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)濃厚，有清晰的液泡(圖2F)；而不育系花藥發(fā)育形成異常的花粉粒，部分?jǐn)∮ǚ郯l(fā)育畸形，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核不明顯，大部分花粉出現(xiàn)明顯質(zhì)壁分離的敗育現(xiàn)象，而且細(xì)胞質(zhì)收縮導(dǎo)致電子密度異常增大(圖2L)。三核期保持系花粉粒細(xì)胞壁厚度為3.33 μm，不育系花粉粒細(xì)胞壁厚度為2.99 μm。與保持系花粉粒細(xì)胞壁相比，不育系花粉粒細(xì)胞壁較薄，僅是保持系花粉粒細(xì)胞壁厚度的89%(圖2F、2L)。

2.3 絨氈層相關(guān)基因在K型不育系中的表達(dá)

RAFTIN1在保持系519B中的表達(dá)水平呈高-低-高-低的變化趨勢。小孢子母細(xì)胞期，RAFTIN1相對表達(dá)量為0.95，是四分體期和單核期的3.17倍和3.06倍；二核期的相對表達(dá)量為1.00，達(dá)到最大值，極顯著高于單核期相對表達(dá)量，是小孢子母細(xì)胞期的1.05倍；發(fā)育至三核期，該基因相對表達(dá)量降到最低值(圖3)。

在不育系K519A中，RAFTIN1的相對表達(dá)量雖然也呈高-低-高-低的變化趨勢，但是升高和降低的時期不同于保持系，以小孢子母細(xì)胞期表達(dá)水平最高，三核期最低。小孢子母細(xì)胞期至單核期，不育系中RAFTIN1的相對表達(dá)量都明顯高于保持系，是保持系中相對表達(dá)量的2.62倍(小孢子母細(xì)胞期)、2.83倍(四分體期)和4.45倍(單核期)；不育系RAFTIN1在二核期的相對表達(dá)量低于保持系，僅為保持系中相對表達(dá)量的一半；到三核期，保持系和不育系中的相對表達(dá)量基本相同(圖3)。

天冬氨酸蛋白酶基因APs在保持系花藥中的相對表達(dá)量比較穩(wěn)定，在單核期相對表達(dá)量最高，其次是小孢子母細(xì)胞期和二核期，四分體時期較三核期稍高(圖3)。而在不育系中，APs相對表達(dá)量變化非常明顯，小孢子母細(xì)胞期最高，且與其他時期差異很大，整個發(fā)育過程持續(xù)下降，到三核期基本不表達(dá)(圖3)。小孢子母細(xì)胞期、四分體期和單核期不育系A(chǔ)Ps基因的相對表達(dá)量都明顯高于保持系，分別是保持系的10.85、3.90和1.85倍；而二核期和三核期保持系的APs相對表達(dá)量都高于不育系，分別是不育系相對表達(dá)水平的1.17倍和2.71倍。

A和G：小孢子母細(xì)胞期；B和H：四分體期；C和I：單核期；D和J：二核期；E和K：三核期；F和L：三核期花粉粒。放大倍數(shù)：A、B、C、E、G、H和I圖，2 000×；K和L圖，2 500×；D、F和J圖，3 000×。Ep：表皮；En：藥室內(nèi)壁；ML：中層；T：絨氈層；Msp：小孢子；N：細(xì)胞核；Nu：核仁；Ve：小泡；TM：絨氈層膜；U：烏氏體；Va：液泡。

A and G:Microspore mother cell stage; B and H:Tetrad stage; C and I:Mononuclear stage; D and J:Binuclear stage; E and K:Trinuclear stage; F and L:Pollen grains at trinuclear stage. Magnification:2 000× for panels A,B,C,E,G,H and I; 2 500× for panels K and L; 3 000× for panels D,F and J. Ep:Epidermis; En:Endothecium; ML:Middle layers cells; T:Tapetum; Msp:Microspore; N:Nucleus; Nu:Nucleolus; Ve:Vesicle; TM:Tapetum membrane; U:Ubisch body; Va:Vacuole.

圖2保持系519B(圖A～F)和不育系K519A(圖G～L)花藥發(fā)育的亞顯微結(jié)構(gòu)

Fig.2Ultrastructureofantherandmicrosporeofthemaintainer519B(panelsAtoF)andthemalesterilelineK519A(panelsGtoL)

值得一提的是，RAFTIN1和APs的相對表達(dá)量在小孢子母細(xì)胞期至單核期均表現(xiàn)為不育系明顯高于保持系，而在二核期則低于保持系，到三核期兩基因的相對表達(dá)量都降到最低值。三核期RAFTIN1在不育系和保持系中的表達(dá)水平相似，而不育系A(chǔ)Ps的相對表達(dá)量顯著低于保持系。

Ⅰ：小孢子母細(xì)胞期；Ⅱ：四分體期；Ⅲ：單核期；Ⅳ：二核期；Ⅴ：三核期。誤差線上小寫字母不同表示同一材料中基因相對表達(dá)量在不同時期間差異顯著(P<0.05)。

Ⅰ:Microspore mother cell stage; Ⅱ:Tetrad stage; Ⅲ:Mononuclear stage; Ⅳ:Binuclear stage; Ⅴ:Trinuclear stage.Different lower-case letters above the error bars indicate significant difference of gene expression level among different stages for the same line (P<0.05).

圖3保持系519B和不育系K519A絨氈層細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的相對表達(dá)量

Fig.3Relativeexpressionlevelsofthegenesrelatedtotapetumdevelopmentinthemaintainer519BandthemalesterilelineK519A

3 討 論

眾多研究表明，不育系花藥絨氈層活動異常可能是導(dǎo)致花粉敗育的重要原因[11,14-15,18-22]。本試驗通過對K型非1B/1R小麥雄性不育系不同發(fā)育時期花藥絨氈層結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)絨氈層細(xì)胞在四分體時期提前異常降解侵入藥室，三核期出現(xiàn)部分形狀不規(guī)則的小孢子，推測絨氈層提前異常降解侵入藥室，侵害了小孢子正常發(fā)育的空間，導(dǎo)致部分小孢子在此時期敗育，小孢子后期不能正常發(fā)育，表現(xiàn)為花粉粒形狀不規(guī)則。這印證了Scoles等[26]的研究結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)黑麥雄性不育系花藥絨氈層細(xì)胞過度肥大和解體的絨氈層細(xì)胞形成周原質(zhì)團(tuán)侵入藥室而擠壓小孢子引起敗育。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)不育系花藥絨氈層細(xì)胞在四分體時期提前降解，到二核期基本降解完全，只剩下絨氈層細(xì)胞膜和其附著的少量烏氏體，二核期不育系絨氈層細(xì)胞膜上的烏氏體明顯少于保持系，且三核期不育系花粉壁與保持系花粉壁相比明顯變薄，推測這可能是由于不育系絨氈層提前降解致使二核及以后時期營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，導(dǎo)致花粉細(xì)胞壁附著孢粉素減少變薄，并導(dǎo)致三核時期出現(xiàn)花粉粒質(zhì)壁分離現(xiàn)象，最終導(dǎo)致花粉敗育。因此，推測K型小麥雄性不育系敗育可能是由于絨氈層細(xì)胞提前異常降解導(dǎo)致。

對于K型小麥雄性不育系的敗育時期，前人研究推斷K型小麥雄性不育系敗育時期為單核期到三核期[27-29]，從絨氈層結(jié)構(gòu)變化及異常降解的角度看，本研究結(jié)果與前人報道一致，但本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)花粉敗育還可能出現(xiàn)在四分體時期，并推斷K型小麥雄性不育系敗育關(guān)鍵時期在四分體時期和二核期。

花粉敗育與絨氈層異常發(fā)育有關(guān)的推論也得到基因表達(dá)結(jié)果的支持。Luo等[8]在水稻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中發(fā)現(xiàn)一個WA352突變基因，在小孢子發(fā)育時期WA352蛋白在絨氈層上積累抑制了定位于線粒體上并由核基因控制表達(dá)的COX11蛋白的代謝功能，誘導(dǎo)絨氈層提前降解導(dǎo)致花粉敗育。還有研究證實，在水稻[17]和小麥[30]中天冬氨酸蛋白酶(APs)參與調(diào)控絨氈層降解的過程，導(dǎo)致小孢子敗育。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)，絨氈層分泌合成的孢粉素是小孢子發(fā)育階段的關(guān)鍵蛋白，RAFTIN1基因與孢粉素轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，將RAFTIN1基因沉默后，植株出現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象。盛 英等[31]利用生理型小麥雄性不育材料，研究發(fā)現(xiàn)與絨氈層降解和定向轉(zhuǎn)運(yùn)孢粉素的RAFTIN1的表達(dá)量高低直接相關(guān)。本研究首次對RAFTIN1和APs基因在K型小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系花藥不同發(fā)育時期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在小孢子母細(xì)胞至單核時期，不育系花藥RAFTIN1和APs基因的相對表達(dá)量都高于保持系花藥，可能是由于不育系絨氈層提前降解導(dǎo)致。短時期釋放的有效營養(yǎng)物質(zhì)被小孢子直接吸收，孢粉素在短期內(nèi)快速積累，使得不育系單核時期的小孢子細(xì)胞壁變厚。到二核期在不育系花藥中的相對表達(dá)量都低于保持系，表明此時期保持系絨氈層仍能為花粉發(fā)育提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，小孢子生長正常，但是不育系絨氈層提前降解導(dǎo)致后期小孢子營養(yǎng)不足，RAFTIN1的相對表達(dá)量明顯低于保持系，孢粉素的轉(zhuǎn)運(yùn)積累減少，從而導(dǎo)致二核期到三核期不育系小孢子細(xì)胞壁較薄，而二核期又是小孢子聚集孢粉素的關(guān)鍵時期，推測二核期可能是敗育的關(guān)鍵時期。RAFTIN1和APs基因的表達(dá)分析和細(xì)胞學(xué)結(jié)果正好相契合，故推測這兩個基因很有可能參與了K型小麥雄性不育系的敗育過程。本研究細(xì)胞學(xué)觀察與基因表達(dá)分析結(jié)果相互印證，提高了結(jié)論的可靠性。

麥類作物學(xué)報 2018,38(12):1408-1413Journal of Triticeae Cropsdoi:10.7606/j.issn.1009-1041.2018.12.03