岳艷玲，郭瑛琪,2

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650201；2.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明 650223）

大白菜（Brassica campestrisL.ssp.pekinensis）屬于十字花科蕓薹屬白菜種，原產(chǎn)于中國，有悠久的栽培歷史，是我國十分重要的蔬菜作物。大白菜為兩性花異花授粉植物，雜種優(yōu)勢非常顯著，但大白菜花器比較小，很難通過人工授粉的方式滿足F1雜交種子的商業(yè)化利用。

雄性不育（male sterility）是指植物雄蕊退化或不能形成有活力花粉的現(xiàn)象，在自然界中廣泛存在，是大白菜實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。應(yīng)用雄性不育系進(jìn)行雜交種子生產(chǎn)，雜種純度高，不存在母本自交種子混雜問題。因此，雄性不育發(fā)生機(jī)理及其應(yīng)用研究受到生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。1995 年，F(xiàn)ENG 等[1]發(fā)現(xiàn)了一類大白菜核不育的遺傳機(jī)制，提出了“復(fù)等位基因遺傳假說”。復(fù)等位核雄性不育具有雄蕊退化徹底、不育性穩(wěn)定等特點(diǎn)，不育度和不育株率均為100%，且不受細(xì)胞質(zhì)影響，沒有正、反交遺傳效應(yīng)，是一類比較理想的大白菜雄性不育材料。2005 年，岳艷玲等[2-4]以“復(fù)等位基因遺傳假說”為理論基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了合成轉(zhuǎn)育方法和定向轉(zhuǎn)育方法，成功將該不育基因向不同生態(tài)型大白菜中進(jìn)行轉(zhuǎn)育，育成多個(gè)大白菜核基因雄性不育系，并對其雄性不育的敗育機(jī)制進(jìn)行研究。10L03是在大白菜復(fù)等位基因雄性不育系定向轉(zhuǎn)育過程中經(jīng)過多代回交獲得的近等基因系，不育株雄蕊敗育徹底，雌蕊正常，無不良性狀伴生，植株結(jié)籽特性好。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)大白菜花藥絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，四分小孢子不能發(fā)育成正常的單核小孢子，最終藥腔空癟，發(fā)生敗育[5]。為進(jìn)一步深入研究該雄性不育材料的敗育機(jī)制，本研究采用透射電子顯微技術(shù)，觀察小孢子敗育過程花藥絨氈層細(xì)胞及小孢子的發(fā)育動(dòng)態(tài)，明確不育發(fā)生時(shí)期及敗育細(xì)胞的超微特征，為揭示該核不育小孢子的敗育機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大白菜核不育近等基因系10L03，系統(tǒng)內(nèi)兄妹交后代育性保持1∶1 分離，可育株自交后代可育株與不育株3∶1分離，材料由本課題組選育而成。試材種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地大棚內(nèi)，于盛花期取不同育性的大白菜花序的花藥用于固定。

1.2 方法

采用2.5%戊二醛固定液（PBS pH=7.4）進(jìn)行可育、不育花藥前固定，抽真空，4 ℃固定48 h。PBS 浸洗3 次，每次15 min，加入2%的鋨酸后固定4 h。PBS 浸洗3 次，每次15 min。梯度乙醇50%、70%、95%、100%逐級脫水，樹脂包埋。使用LEICA EM TRIM 樹脂修塊機(jī)進(jìn)行修塊，LEICA EM UC6超薄切片機(jī)先切600～1000 nm的半薄切片，1%甲苯胺藍(lán)染色10 s，OLYMPUS CX31 顯微鏡觀察花藥發(fā)育時(shí)期。然后70 nm 連續(xù)切片，100 目銅網(wǎng)撈片，醋酸雙氧鈾染色25 min，雙蒸水涮洗，檸檬酸鉛染色8～15 min，雙蒸水涮洗終止染色，并放入標(biāo)好號的濾紙上。EOL JEM-1200EX Ⅱ電子顯微鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 可育花藥細(xì)胞發(fā)育過程

透射電鏡觀察花粉母細(xì)胞時(shí)期可育花藥結(jié)構(gòu)，花藥外層細(xì)胞分化明顯，視野中可以清晰地看到花藥中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞，絨氈層細(xì)胞牙齒狀排列緊湊，徑向長度5 μm以上，可以看到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?；ǚ勰讣?xì)胞位于藥腔中央，細(xì)胞排列緊密，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見，絨氈層和花粉母細(xì)胞飽滿，內(nèi)含物充實(shí)（圖1A）。進(jìn)一步放大觀察絨氈層細(xì)胞，細(xì)胞核核仁電子密度大，幾乎與細(xì)胞核等大，細(xì)胞質(zhì)中含有淀粉等物質(zhì)（圖1B）?；ǚ勰讣?xì)胞較大，可看到核仁和核質(zhì)，細(xì)胞之中含有豐富的內(nèi)含物（圖1C）。

花粉母細(xì)胞之后，可育絨氈層細(xì)胞核完整，細(xì)胞核輪廓清晰，核仁較大，電子密度高（圖1D）?；ǚ勰讣?xì)胞細(xì)胞核、核仁明顯，核膜完整，清晰可見（圖1E）。可育花藥繼續(xù)發(fā)育到四分體時(shí)期，絨氈層細(xì)胞仍可見細(xì)胞核，且核仁電子密度明顯大于核質(zhì)，有的絨氈層為單層細(xì)胞（圖1F），而有的為2層或3層細(xì)胞（圖1G），絨氈層細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物豐富（圖1F、圖1G），細(xì)胞間存在細(xì)胞間隙，而絨氈層靠近外層細(xì)胞的細(xì)胞膜可見，放大可看到絨氈層細(xì)胞中的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分泌小泡(圖1H)。四分小孢子圓潤飽滿，小孢子電子密度大，小孢子表面和細(xì)胞間可見胼胝質(zhì)，小孢子內(nèi)含物豐富，可見脂滴體（圖1I）。

可育花藥單核早期小孢子呈三葉草形（圖1J）。絨氈層細(xì)胞電子密度大，可見細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞邊緣有分泌小泡，絨氈層細(xì)胞含有淀粉粒等，可見核小體（圖1K）。單核小孢子細(xì)胞核很大位于小孢子中央，核膜清晰可見，核仁染色深，電子密度大，無明顯液泡，但細(xì)胞質(zhì)中可見許多囊泡（圖1L）。

圖1 可育花藥花粉母細(xì)胞至單核早期細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 1 Cell ultrastructure of the fertile anther during pollen mother cell to early stage of mononuclear microspore

小孢子繼續(xù)發(fā)育，絨氈層細(xì)胞間隙進(jìn)一步變寬，同一時(shí)期絨氈層細(xì)胞電子密度比小孢子大（圖2A），絨氈層細(xì)胞淀粉粒等物質(zhì)增多，觀察到的細(xì)胞核無明顯核膜，但核仁清晰（圖2B），單核小孢子中出現(xiàn)液泡，可見細(xì)胞核核仁及核膜、線粒體及分泌小泡，形狀從三葉草形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形（圖2C）。

到了單核晚期，絨氈層細(xì)胞電子密度降低，小孢子繼續(xù)向圓形轉(zhuǎn)變（圖2D），絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步降解，細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒等更為豐富，細(xì)胞形態(tài)無規(guī)則，有的絨氈層細(xì)胞隱約可見細(xì)胞核，細(xì)胞周圍有分泌小泡（圖2E）。小孢子內(nèi)有大液泡，液泡膜清楚可見，核膜清晰，核仁色深，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見小囊泡，線粒體以及脂滴體（圖2F）。

雙核期絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡，徑向變短，橫向變長，此時(shí)絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本消失，觀察不到完整的細(xì)胞器。小孢子基本圓形，可見兩個(gè)細(xì)胞核，液泡變?。▓D2G）。絨氈層細(xì)胞看不到細(xì)胞核、細(xì)胞器及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間縫隙進(jìn)一步變大，絨氈層細(xì)胞基本消失（圖2H）。小孢子進(jìn)一步放大觀察可見分泌小泡、糖類、脂滴體等（圖2I）。

花藥成熟時(shí)期，可育花藥絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，花粉粒電子密度極大（圖2J），絨氈層細(xì)胞只剩薄薄的一層，但不同位置薄厚不一，有的絨氈層細(xì)胞已經(jīng)完全消失，外側(cè)細(xì)胞含有線粒體和小囊泡（圖2K）?；ǚ哿A形飽滿，電子密度極大，可見細(xì)胞核（圖2L）。

圖2 可育花藥單核至成熟期細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 2 Cell ultrastructure of the fertile anther during mononuclear microspore to mature stage

2.2 不育花藥細(xì)胞發(fā)育過程

透射電鏡觀察花粉母細(xì)胞時(shí)期不育花藥結(jié)構(gòu)，視野中可見花藥表皮細(xì)胞、內(nèi)壁細(xì)胞、中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞，絨氈層細(xì)胞狀排列緊湊呈牙齒狀，花粉母細(xì)胞位于藥腔中央，排列緊湊，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核清晰可見，絨氈層和花粉母細(xì)胞飽滿，內(nèi)含物充實(shí)（圖3A）。絨絨氈層細(xì)胞核及核仁明顯，核膜可見，細(xì)胞質(zhì)中含有淀粉粒等（圖3B）?；ǚ勰讣?xì)胞較大，核仁電子密度大，核質(zhì)電子密度小，細(xì)胞之中含有豐富內(nèi)含物（圖3C）。

花粉母細(xì)胞后期，不育絨氈層細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙，細(xì)胞核裂解出現(xiàn)核小體（圖3D），說明絨氈層細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞程序性死亡?；ǚ勰讣?xì)胞的細(xì)胞核、核仁以及核膜都明顯可見（圖3E）；花粉母細(xì)胞可以完成減數(shù)分裂發(fā)育成四分體，此時(shí)絨氈層細(xì)胞膨大，四分小孢子變形（圖3F），細(xì)胞內(nèi)有空泡，核內(nèi)可觀察到核小體（圖3G），說明此時(shí)小孢子發(fā)生細(xì)胞程序性死亡。絨氈層細(xì)胞空泡化明顯，細(xì)胞核電子密度大，可以看到核小體（圖3H）。

圖3 不育花藥花粉母細(xì)胞至四分體時(shí)期細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 3 Cell ultrastructure of the fertile anther during pollen mother cell to tetrad stage

四分體之后，絨氈層細(xì)胞空泡化現(xiàn)象加重，細(xì)胞或變形（圖4A）或異常膨大（圖4C），之后發(fā)生降解（圖4D）。小孢子有的細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的小囊泡，胼胝質(zhì)仍然包裹小孢子（圖4B），說明包圍四分小孢子的胼胝質(zhì)并未被及時(shí)降解，沒能順利釋放單核小孢子。絨氈層細(xì)胞和小孢子的敗育過程并不同步，特征也不完全一致，有的絨氈層細(xì)胞會發(fā)生徑向伸長繼續(xù)膨大（圖4A、圖4C、圖4E），有許多分泌小泡，同一腔室中小孢子敗育程度也有不同，有的皺縮，有的勉強(qiáng)維持圓形（圖4E），但都已看不到任何細(xì)胞器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但胼胝質(zhì)仍然存在。成熟期，不育花藥絨氈層細(xì)胞和小孢子已經(jīng)無法分清層次結(jié)構(gòu)（圖4F、圖4G）。15K 倍數(shù)下可見細(xì)胞壁層疊狀，藥腔中可見電子密度極大的細(xì)胞殘?bào)w（圖4H）。

圖4 四分體之后不育花藥敗育的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Figure 4 Cell ultrastructure of the fertile anther during the stage after tetrad

3 討論與結(jié)論

花粉發(fā)育是有性繁殖植物完成其世代交替的重要生命過程，涉及到一系列的細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)變化，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生改變都可能會導(dǎo)致花粉發(fā)育異常，從而引起雄性不育[6]。在大白菜不育系中，敗育可發(fā)生在小孢子發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，如無花粉囊型敗育型，發(fā)生在孢原細(xì)胞時(shí)期，造孢細(xì)胞無法形成或相互黏連；花粉母細(xì)胞敗育型，表現(xiàn)為減數(shù)分裂異常，小孢子無法分離，四分體無法散開；單核花粉敗育型表現(xiàn)為花粉壁形成異常，花粉無活性[7-13]。PU 等[5]利用制作石蠟切片，采用光學(xué)顯微技術(shù)觀察10L03 不育花藥發(fā)育過程，花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂可以形成四分體，但小孢子發(fā)生變形，絨氈層變厚，提前降解，說明10L03 花藥不育發(fā)生在四分體時(shí)期。本研究對10L03 花藥細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)的不育花藥絨氈層細(xì)胞細(xì)胞核在減數(shù)分裂時(shí)已經(jīng)分解形成核小體，說明此時(shí)絨氈層細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，花藥發(fā)生敗育的時(shí)期應(yīng)是花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，也說明了細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果較組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果更準(zhǔn)確。

絨氈層是藥室的最內(nèi)層，由雄蕊原基的L2、L3 層共同發(fā)育而來，包圍著花粉母細(xì)胞和小孢子并與其相互作用，絨氈層的發(fā)育及其降解對小孢子的發(fā)生和發(fā)育起著至關(guān)重要作用[14-15]。絨氈層缺失、過早或延遲降解，甚至不降解，均可導(dǎo)致植物雄性不育[16]。郭瑛琪等[17]觀察發(fā)現(xiàn)10L03 不育花藥絨氈層提前降解，本研究電鏡觀察結(jié)果與郭瑛琪等觀察結(jié)果一致，但觀察到絨氈層細(xì)胞多泡化、膨大空泡化及縱向延伸膨大空泡化3種不同的敗育形式。通過透射電鏡，本研究觀察到10L03不育花藥絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)期細(xì)胞核裂解形成核小體，敗育小孢子細(xì)胞也出現(xiàn)核裂解現(xiàn)象，這是一個(gè)明顯的細(xì)胞程序性死亡特征，說明10L03不育花藥敗育過程中出現(xiàn)異常PCD過程，這與郭瑛琪等[17]采用TUNNEL法檢測的結(jié)果相一致。

胼胝質(zhì)（callose）是一種以β-1,3-鍵結(jié)合的葡聚糖，廣泛分布于高等植物的篩管、細(xì)胞板和胞間連絲，在植物細(xì)胞分裂、細(xì)胞到細(xì)胞的分子運(yùn)動(dòng)及抗生物、非生物脅迫等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。胼胝質(zhì)還是花粉發(fā)育的重要調(diào)控者特定發(fā)育階段的胼胝質(zhì)沉積和降解是小孢子發(fā)生和花粉形成的重要前提[19]。在減數(shù)分裂前，胼胝質(zhì)開始在花粉母細(xì)胞的細(xì)胞壁中沉積，減數(shù)分裂后四個(gè)子細(xì)胞由胼胝質(zhì)隔開，參與胞質(zhì)分裂，整個(gè)四分體都被胼胝質(zhì)壁包裹著，隨后胼胝壁被消化而釋放小孢子，花粉外壁形成、花粉萌發(fā)和花粉管生長也需要胼胝質(zhì)的參與[20-21]。四分體周圍的胼胝質(zhì)壁提前降解或延遲降解以及花粉外壁中胼胝質(zhì)沉積異常均會影響小孢子進(jìn)一步發(fā)育，引起花粉敗育，導(dǎo)致雄性不育[22-23]。PU 等[5]利用Aniline blue 染色和熒光檢測發(fā)現(xiàn)10L03花藥敗育過程中，包裹著小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解，不能發(fā)育成單核小孢子，花藥特異表達(dá)胼胝質(zhì)酶基因AtA6的同源基因BraA04g008040、BraA07g009320、BraA01g030220、BraA03g040850在不育花藥減數(shù)分裂后低表達(dá)可能促進(jìn)了小孢子胼胝質(zhì)的沉積[5]。胼胝質(zhì)酶是由絨氈層細(xì)胞合成并分泌到藥腔中，降解包裹四分體的胼胝質(zhì)，從而釋放單核小孢子。本研究電鏡觀察到不育花藥絨氈層細(xì)胞提前發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，導(dǎo)致胼胝質(zhì)酶合成不足，包裹著小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解，四分小孢子無法釋放單核小孢子，小孢子無法進(jìn)一步發(fā)育，最終敗育。

從本研究觀察結(jié)果可以看到，絨氈層細(xì)胞敗育起始早于小孢子敗育，說明絨氈層細(xì)胞提前發(fā)生細(xì)胞程序性死亡是導(dǎo)致小孢子敗育的重要原因?？捎ㄋ幇l(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞質(zhì)電子密度大，含有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器；不育花藥敗育過程中，絨氈層細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞器數(shù)量明顯低于可育花藥，細(xì)胞內(nèi)空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞器少，提前降解，說明不育花藥絨氈層細(xì)胞無法持續(xù)提供小孢子發(fā)育所需的物質(zhì)，因而包裹四分小孢子的胼胝質(zhì)不能被降解，無法釋放單核小孢子，小孢子無法進(jìn)一步發(fā)育進(jìn)而發(fā)生敗育。