張 哲 金滋潤 楊宇卓 張海濤1, 祝雨田1, 張洪亮,5 毛加明

劉德風2 趙連明1,2 唐文豪1,2,5 林浩成1,2 洪 鍇1,2 邢國剛3,4,* 姜 輝1,2,5,*

1．北京大學第三醫(yī)院泌尿外科（北京 100191）；2.北京大學第三醫(yī)院男科；3.北京大學神經(jīng)科學研究所；4.北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院神經(jīng)生物系；5.北京大學第三醫(yī)院精子庫

近年來隨著環(huán)境污染的加劇、生活節(jié)奏的加快和生育年齡的延遲，不育癥的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為了一個重大公共健康問題[1,2]。全球約有10%～15%的育齡期夫婦受到不育癥的困擾，其中男性因素占不育原因的一半左右[3]。少弱精子癥是導致男性不育的主要原因之一，目前雖然針對少弱精子癥的藥物治療取得了一定進展，但仍有部分患者的療效不盡人意[4]。本研究擬通過生殖毒性藥物奧硝唑（ornidazole,ORN）建立少弱精子癥大鼠模型，觀察葆生精對少弱精子癥模型大鼠生殖功能的影響，探索葆生精治療少弱精子癥的機制，為臨床男性不育的藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、試劑與儀器

奧硝唑（ORN，貨號：MB1173，大連美侖生物技術(shù)有限公司），羧甲基纖維素鈉（貨號：30036365，國藥集團化學試劑有限公司），0.9%氯化鈉注射液（NS，石家莊四藥有限公司），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（貨號：A005,南京建成生物科學研究所）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（貨號：S0109,碧云天生物技術(shù)有限公司），抗Bcl-2兔多克隆抗體 （貨號：bs-4563R，Bioss）、抗Caspase3兔多克隆抗體 （貨號：bs-0081R，Bioss），精子計數(shù)板（南寧松景天倫生物科技有限公司），水浴鍋（北京市長風儀器有限公司），計算機輔助精子分析系統(tǒng) （北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司，型號：WLJY-9000）。 普通光學顯微鏡（Olympus），臺式冷凍離心機（型號：5417R，eppendorf）。

二、動物分組與實驗

34只健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～230g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（京）2006-0008。將大鼠按體質(zhì)量隨機分為溶劑對照組（vehicle）7 只、少弱精子癥模型組（ORN）8 只，生理鹽水對照模型組 （ORN+NS）9只和葆生精治療模型組（ORN+BSJ）10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠均自由采食、飲水，飼養(yǎng)過程中，每天換水，隔日換籠中的墊料以保持清潔干燥。環(huán)境溫度20～25℃，光照:白天12 h/夜晚 12 h。 （1）ORN 組：奧硝唑溶液灌胃， 400mg/（kg·d），連續(xù)灌胃至治療結(jié)束[5]。（2）vehicle組：給與等體積的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液。奧硝唑溶液制備：0.25g奧硝唑加入1 mL 0.2%羧甲基纖維素鈉溶液 （0.2g羧甲基纖維素鈉加入100 mL滅菌的雙蒸水，同時加入兩滴100μLTween-20）置于干凈研缽中研碎至糊狀。以快速前向運動的a級精子數(shù)和慢速前向運動的b級精子數(shù)之和小于50%，或快速前向運動的a級精子數(shù)小于25%作 為 造 模 成 功 的標準。（3）ORN+BSJ組：從奧硝唑灌胃的第15天開始，給與大鼠沙棘汁灌胃，ORN 400 mg/（kg·d）+BSJ 514 mg/（kg·d）。 （4）ORN+NS 組：從奧硝唑灌胃的第15天開始，給與大鼠生理鹽水灌胃，ORN 400 mg/（kg·d）+ 等體積 NS。大鼠每日稱量，藥物現(xiàn)用現(xiàn)配，每日一次，連續(xù)3周。

三、標本采集與精子活力檢測

各組大鼠在治療結(jié)束后1 d腹腔注射過量水合氯醛處死，應(yīng)用擴散法收集附睪尾精子進行精子活力分析實驗[6]。將雙側(cè)附睪尾部放入標記好的含2 mL（37℃預熱）0.9%氯化鈉溶液的一次性培養(yǎng)皿中，用小剪刀在附睪尾部，輕輕地剪3刀，37℃水浴鍋中放置2 min，輕輕混勻，取20 μL加到37℃預熱的精子計數(shù)板上，選取6個視野，于2 min內(nèi)完成測試。運用計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測主要測試指標：精子密度、精子活力、a級精子比例、（a+b）級精子比例、曲線運動速度(VCL)、直線運動速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性(LIN)、前向性(STR)、精子頭側(cè)擺幅度(ALH)。

四、大鼠睪丸組織勻漿GSH-Px及SOD活性測定

取1側(cè)睪丸組織按質(zhì)量(g)：體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(PBS)，冰水浴條件下剪碎組織后一起加入勻漿管中。將玻璃勻漿管置于冰水浴條件下，手動勻漿，30 s/次，重復6～8次，制成10%的勻漿液，4℃、2 500×g離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書操作方法測定GSH-Px和SOD活性。

五、大鼠睪丸組織中4-HNE、Bcl-2、Caspase3蛋白表達檢測

取1側(cè)睪丸組織按質(zhì)量(g)：體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的RIPA裂解液，用勻漿器將組織充分研磨成不可見顆粒，冰上裂解1 h；然后將組織勻漿液離心 12 000×g，4 ℃，10 min， 取上清。 用 BCA(bicinchoninic acid)蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Pierece公司)進行蛋白定量，在Model680酶標儀 （美國BIO·RAD公司）上讀板，測量波長為570 nm；以標準品濃度為橫坐標，校正吸光度為縱坐標作標準曲線。按照標準曲線計算出蛋白濃度。將蛋白加入10%的SDS-PAGE凝膠中電泳，將分離出的蛋白100V恒壓轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。完畢，將有蛋白的PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉I h。取出封閉好的PVDF膜孵育相應(yīng)一抗，4℃冰箱孵育過夜。第2天，取出一抗反應(yīng)結(jié)束的PVDF膜，TBST洗3次，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h。結(jié)合二抗后的PVDF膜用TBST洗3次后顯色觀察蛋白表達的含量變化。之后采用Quantity One軟件統(tǒng)計蛋白灰度。

六、大鼠睪丸組織形態(tài)學檢測

將睪丸組織于4%溶液中固定24 h后，20%蔗糖脫水，依次用乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，5 μm厚切片，二甲苯和酒精梯度脫蠟，蘇木素和伊紅染色，脫水，透明，樹膠封片，置于光鏡下觀察玻片。

七、統(tǒng)計學分析

各組實驗數(shù)據(jù)采用Prism7.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準誤（±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析，及Bonferroni post-hoc檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、葆生精可顯著改善少弱精子癥模型大鼠的精子質(zhì)量

與正常對照組相比，模型大鼠附睪精子質(zhì)量，包括精子密度、活力和直線速率、曲線速率等運動參數(shù)都明顯下降（P＜0.01），說明成功構(gòu)建了少弱精子癥大鼠模型。給予葆生精治療后，少弱精子癥大鼠附睪精子的各項指標均有顯著改善，精子活力、精子密度及運動參數(shù)都有明顯的增加（見表1及表2）。

二、大鼠睪丸組織形態(tài)學變化

由圖1可以看出，正常對照組大鼠睪丸組織中各級生精細胞排列整齊，生精小管基底膜完整，管腔內(nèi)充滿精子;少弱精子癥模型組大鼠睪丸組織中部分生精細胞脫落，層次排列紊亂，生精上皮細胞變薄，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。給予葆生精治療后，雖然各級生精細胞排列略稀疏，但生精上皮形態(tài)基本恢復，各級生精細胞及管腔內(nèi)精子數(shù)目都有明顯增加。

三、葆生精可改善少弱精子癥大鼠睪丸中的氧化應(yīng)激狀態(tài)

與正常對照組相比，模型大鼠睪丸組織中SOD的酶活力和GSH-Px的酶活力都明顯下降（P＜0.01），而給予葆生精治療后，大鼠睪丸組織中SOD的酶活力及GSH-Px的酶活力則都較對照組有明顯的增加（P＜0.01）。見表3。

四、葆生精可減少少弱精子癥大鼠的生精細胞凋亡

如圖2所示，與正常對照組相比，模型大鼠睪丸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有所下降，葆生精治療模型組（ORN+BJS組）大鼠睪丸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯增加（P＜0.01）。同時我們觀察到少弱精子癥模型組大鼠睪丸組織凋亡蛋白Caspase-3的表達明顯增加 （P＜0.05），給予葆生精治療后大鼠凋亡蛋白Caspase-3 的表達明顯下降（P＜0.05）。

表1 葆生精對少弱精子癥模型大鼠精子活力及密度的影響

表2 葆生精對少弱精子癥模型大鼠精子運動參數(shù)的影響

表3 各組大鼠睪丸組織抗氧化應(yīng)激酶活性的比較

圖1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)學改變（HE:×200）

圖2 各組大鼠睪丸組織中Bcl-2及Caspase-3的蛋白表達

討 論

少弱精子癥的發(fā)病原因十分復雜，如精索靜脈曲張、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)異常和不良生活習慣等均可引起精子的數(shù)量減少和活力減弱[7,8]。多項流行病學調(diào)查統(tǒng)計均發(fā)現(xiàn)少弱精子癥約占男性不育的一半以上，少弱精子癥一直是男性不育治療的重點和熱點。構(gòu)建合適的少弱精子癥動物模型，可用于少弱精子癥新的治療方法和作用機制的探索。奧硝唑（ORN）是一種硝基咪唑類厭氧菌抗生素，臨床上主要應(yīng)用于預防和治療脆弱擬桿菌、狄氏擬桿菌等敏感厭氧菌所引起的多種感染性疾病，但同時發(fā)現(xiàn)ORN對生殖系統(tǒng)有一定的毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)低劑量的ORN能可逆性地抑制大鼠附睪精子活力，高劑量的ORN可破壞睪丸的生精功能，精子密度和活力均顯著下降，其病理變化接近男性不育患者的臨床特征[9,10]。本研究中少弱精子癥模型大鼠睪丸生精細胞脫落，層次排列紊亂，管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少，其造模效果與之前研究相似，說明少弱精子癥模型制備成功。

氧化還原系統(tǒng)動態(tài)平衡調(diào)控對精子發(fā)生和男性生育力維持具有重要的調(diào)控作用[11]。精原干細胞的自我更新需要活性氧（reactive oxygen species，ROS）來維持，二倍體的精原細胞分化為單倍體精子細胞的過程也需要一定濃度的ROS。睪丸中細胞分裂活躍，且酶類調(diào)控系統(tǒng)復雜，位于線粒體嵴的呼吸鏈氧化磷酸化酶復合體，如黃嘌呤、NADPH氧化酶、細胞色素P450等多種途徑均可產(chǎn)生ROS，這就意味著線粒體氧消耗和ROS產(chǎn)生速率均較高；且睪丸中富含非飽和脂肪酸易受ROS的攻擊而導致功能損傷[12,13]。為了防止ROS產(chǎn)生過多所帶來的損傷效應(yīng)，睪丸中具有包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在內(nèi)的多種抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化小分子。但如果ROS產(chǎn)生過多超過了睪丸的抗氧化能力時，睪丸就會處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導致組織細胞內(nèi)線粒體崩解脫落、膜脂質(zhì)過氧化等，損害細胞的正常生理功能[14,15]。越來越多的研究表明氧化應(yīng)激損傷在男性不育的發(fā)病過程中起著重要作用，在臨床上使用維生素E、左卡尼丁等抗氧化劑治療男性不育也取得了一定療效[16-18]。

葆生精是一種新型的天然多元小分子營養(yǎng)素，主要成分蔓越莓和沙棘具有抗炎、抗氧化作用。葆生精經(jīng)微生物復合發(fā)酵工藝獲取多組分抗氧化營養(yǎng)素，克服了傳統(tǒng)抗氧化劑單組分或多組分簡單疊加無法全面平衡人體復雜結(jié)構(gòu)性氧化應(yīng)激的技術(shù)瓶頸；其特有的網(wǎng)絡(luò)抗氧化能力，經(jīng)機體代謝途徑可直接清除體內(nèi)多種過量氧自由基，并同步抑制其鏈式反應(yīng)。臨床研究初步發(fā)現(xiàn)葆生精可改善男性不育患者的精液質(zhì)量，但其具體的分子機制仍尚未完全闡明。我們通過構(gòu)建大鼠少弱精子癥動物模型發(fā)現(xiàn)，ORN可通過降低抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，誘導生精細胞凋亡并嚴重損傷大鼠的精子質(zhì)量。SOD是催化超氧化物歧化反應(yīng)的金屬酶，通過將超氧化物轉(zhuǎn)化為破壞性較弱的分子氧和過氧化氫以消除ROS引起的氧化損傷；GSH-Px是體內(nèi)分解過氧化物的主要酶類，對過氧化氫具有較強的清除能力[19]。給予葆生精治療后，少弱精子癥大鼠睪丸內(nèi)SOD和GSH-Px的酶活力明顯增加，說明葆生精可增加大鼠生殖系統(tǒng)的抗氧化能力。我們進一步觀察到睪丸組織中凋亡蛋白Caspase-3的表達下降而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯增加，在睪丸組織形態(tài)學上我們也能觀察到大鼠生精小管管腔內(nèi)的生精細胞和精子數(shù)目也都有所恢復，同時使用葆生精治療組大鼠附睪的精子數(shù)目和活力也得到了明顯提升。

綜上所述，葆生精可通過提高少弱精子癥模型大鼠的抗氧化能力，修復生殖系統(tǒng)的氧化損傷，抑制生精細胞凋亡，從而提高精子濃度和活力。本研究結(jié)果表明，葆生精對生育力受損的少弱精子癥大鼠模型有明顯的生殖保護作用，對臨床少弱精子癥患者的治療具有一定的參考價值。但本研究未觀察不同藥物劑量的治療效果，葆生精發(fā)揮生殖保護作用的具體機制不夠詳盡，仍需進一步研究探索。