程宛鈞 張敏建 史亞磊 危槧罡 潘旭東 林 勇 潘日潤 鄧日森 曾智承

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院（福建福州 350004）

流行病學(xué)調(diào)查顯示約有15%左右夫婦婚后同居1年未避孕無法成功生育，其中導(dǎo)致不孕不育的原因，男性因素約為50%左右。隨著環(huán)境污染、飲食生活不規(guī)律和社會競爭壓力的增加導(dǎo)致男性弱精子癥的發(fā)生率逐步增加[1-2]，因此對弱精子癥展開臨床治療和基礎(chǔ)研究有非常重大的現(xiàn)實意義。我們前期研究發(fā)現(xiàn)石萆湯在腎虛夾濕型弱精子癥患者中具有較好的治療作用，可改善腎虛夾濕證弱精子癥患者的精子活力參數(shù)，能夠激發(fā)精子線粒體酶活性和提高精漿鋅含量以及治療腎虛夾濕證臨床癥狀[3]。因此，為了進(jìn)一步研究石萆湯治療弱精子癥的靶點和通路，我們通過對90例弱精子癥患者和30例生殖體檢正常者進(jìn)行有關(guān)精子線粒體PHB蛋白的表達(dá)以及精子線粒體膜電位變化情況的研究?，F(xiàn)將結(jié)果匯報如下：

資料與方法

一、研究對象

選擇2016年8月～2018年6月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院男科門診就診的男性不育弱精子癥患者和生殖體檢者共120例，年齡25～50歲，平均年齡（35.5±4.7）歲。其中入選正常組 30 例，平均年齡（36.9±5.6）歲；弱精組 30 例，平均年齡（36.5±4.9）歲；腎虛夾濕型弱精子癥采用石萆湯治療組60例，平均年齡（35.2±3.1）歲。研究對象均符合本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)。使用研究對象精液標(biāo)本亦通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。排除性腺功能嚴(yán)重異常者、其他內(nèi)分泌疾病患者、肝腎功能障礙患者、生殖系統(tǒng)畸形患者、其他附屬性腺功能障礙患者和中藥過敏患者。

按照西醫(yī)弱精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[3,4]，進(jìn)行精液分析。精液量 ＞2mL，精子密度 ＞20×109/L，精子總數(shù)＞40×109/L，伴以下活力指標(biāo)有1項或1項以上異常為弱精子癥：60 min內(nèi)快速前向運動精子 （a級）+慢速前向運動精子數(shù)（b級）＜50%，或a級＜25%，或a級+b級+非前向運動精子（c級）＜60%者。

腎虛夾濕證辨證標(biāo)準(zhǔn)參照 《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[3,5]并加以修改。主癥：（1）舌淡紅苔厚膩，脈滑或沉細(xì)；（2）腰膝酸軟；（3）形寒肢冷。 次癥：（1）精液黏稠；（2）失眠健忘；（3）口干口苦；（4）嗜睡。 符合主癥 1項，同時兼具主癥其余各項中的任1項和次癥中任2項即可診斷

二、實驗分組及處理

根據(jù)精液常規(guī)分析數(shù)據(jù)分為3組，分別按精液采集要求留取精液標(biāo)本。正常組：符合正常精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)。弱精子組：符合弱精子癥精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)。治療組：符合弱精子癥標(biāo)準(zhǔn)，給予石萆湯治療。

處方：石菖蒲 20g、連翹 15g、枸杞子 20g、菟絲子30g、五味子 10g、覆盆子 10g、女貞子 15 g、黃精 15g、黃芪30g、懷牛膝10g、萆薢20g、墨旱蓮15g。由我院全成分中藥配方顆粒劑智能中藥房全封閉配制，每劑分成2包，早晚飯后各沖服1包，連續(xù)服用16周。

三、精液標(biāo)本的采集和精液常規(guī)分析

所有供精者均禁欲3～7d，常規(guī)手消毒后晾干，在男科實驗室取精室（環(huán)境溫度約26℃）通過手淫方式獲取全部精液，放入一次性無菌干燥帶蓋取精杯內(nèi)，靜置于37℃恒溫箱中使之液化，1 h內(nèi)開始檢測。待精液完全液化后，測定體積及pH值，取10μL滴加于Makler精液計數(shù)池中，使用光學(xué)顯微鏡40倍放大，按WHO第4版實驗室操作手冊的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]，用徐州北斗科貿(mào)公司生產(chǎn)的BD-8000G型計算機(jī)彩色精液分析儀（CASA）進(jìn)行精液密度和活力等參數(shù)的檢測。運用CASA對精液進(jìn)行常規(guī)分析，記錄精子密度、前向運動精子百分率、總運動精子百分率等參數(shù)的值。

四、主要試劑及實驗方法

（一）精液離心及預(yù)處理

將收集的精液標(biāo)本置于10mL離心沉淀管，常溫下800×g，離心 10min，除去精漿，用 0.01mmol/L，pH7.4的PBS緩沖液洗滌3次后，重懸精子，調(diào)整精子濃度至4×106/mL。將制備好的重懸后的標(biāo)準(zhǔn)精子混懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）Western blot檢測人精子線粒體 PHB蛋白的表達(dá)

Rabbit polyclonal anti-human prohibitin antibody（工作 濃 度 ：1:1000，ab28172）；HRP-conjugated monoclonal mouse anti-β-actin（工作濃度：1:5000，KC-5A08）；HRP-標(biāo)記的羊抗兔IgG（工作濃度：1:5000，Jackson）。將 SDS裂解液由-20℃升溫至4℃融化，然后取100μl SDS裂解液加入到各組預(yù)處理好的精子混懸液，裂解精子細(xì)胞提取蛋白，4℃溫度下17000×g離心10min，取上清。蛋白上樣量為50μg，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（Millipore公司，美國）。在抗體孵育盒內(nèi)，每個格子加入5%脫脂奶粉 （TBST緩沖液配置）5mL，放入剪切好的PVDF膜，上搖床，最小轉(zhuǎn)速，室溫孵育2.5h，隨后分別加HRP兔一抗和β-actin一抗4℃搖床過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，之后室溫下HRP兔二抗室溫下?lián)u床孵育2.5h，經(jīng)TBST洗滌2次后，每張膜加入1mL配置好的化學(xué)發(fā)光工作液（Beyotime，中國）避光操作，在雅培i4000化學(xué)發(fā)光分析（美國Abbot公司）上曝光拍照，結(jié)果通過Quantity One software（Alpha Ease FC，美國）分析。

（三）JC-1流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位

儀器及試劑有Flow Cytometer流式細(xì)胞儀（FAC Scalibur，America，BECTON Dickinson）；Dimethylsulphoxide（DMSO）（Sigma）；10 ×PBS Buffer pH7.4 （AmbionRTHERNA COMPANY）；JC-1 （Cat.no.M7512，Molecular Probes Inc）。

基本實驗方法：分別在治療組和弱精子組的一份標(biāo)準(zhǔn)精子混懸液中加入JC-1，而空白組加入等體積旳PBS來代替作為對照。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 30min，400×g離心 5 min，沉淀細(xì)胞并棄上清，除去游離的多余染料。用1mL預(yù)熱37℃的孵育液（incubation buffer）重懸細(xì)胞，立即用Flow Cytometer流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位，激發(fā)波長為568 mn，每個樣本均獲取約10 000個以上的細(xì)胞。首先檢測空白對照，之后是治療組和弱精子癥組，直到全部測完。采用Ce1l Quset軟件進(jìn)行圖像分析。整個實驗中注意避光。數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件統(tǒng)計結(jié)果。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

實驗完成后數(shù)據(jù)入庫封存，統(tǒng)計學(xué)處理由專業(yè)的統(tǒng)計學(xué)人員完成。實驗數(shù)據(jù)計量資料用±s表示，用Spss19.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析處理，組間比較用t檢驗。統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗水準(zhǔn)為0.05，P＜0.05的概率被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PHB蛋白表達(dá)情況

由Western Blot方法檢測線粒體膜蛋白PHB在正常組和弱精組以及治療組的線粒體膜蛋白PHB和β-actin的分子量分別為30000和45000，條帶清晰。PHB在各組精子細(xì)胞中均有表達(dá)，但與弱精組相比，PHB蛋白在正常組和石萆湯治療組中的相對表達(dá)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見圖1。

圖1 Western印跡檢測線粒體PHB蛋白在治療組（1-3）、正常組（4-6）、弱精子組（7-9）精子中表達(dá)情況及定量分析 β-actin為內(nèi)參。上樣量為50μg。 弱精子組=2.8，正常組和治療組分別與弱精子組相比，*P＜0.05

二、患者JC-1線粒體膜電位流式分析

通過對3組患者精子JC-1染色后進(jìn)行流式檢測發(fā)現(xiàn)弱精子癥組患者紅色熒光散點偏向下移，說明精子線粒體膜電位降低。而經(jīng)過石萆湯治療后流式散點上移，與弱精子組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，（P＜0.01圖 2）。

圖2 3組患者JC-1線粒體膜電位流式分析

討 論

石萆湯是福建名中醫(yī)張敏建教授經(jīng)驗方，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院的石菖蒲與萆薢同用可清熱利濕、分清化濁、溫暖下元被廣泛應(yīng)用于白濁屬下焦?jié)駸岚Y。大量臨床石萆湯的應(yīng)用觀察顯示其對男性弱精子癥具有極好的治療作用[3,7-10]，但其具體治療機(jī)制暫不明確[11-15]。大量文獻(xiàn)證明弱精子癥與線粒體膜蛋白PHB及線粒體膜電位具有密切關(guān)系[16]。Prohibitin(PHB)是精子線粒體上的一種高度保守的膜蛋白，其在線粒體中主要發(fā)揮分子伴侶作用[17]，可將已裂解的膜蛋白基質(zhì)轉(zhuǎn)運排出至線粒體外。PHB的缺失會導(dǎo)致精子線粒體膜去極化并增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生[18-20]，線粒體膜去極化后可導(dǎo)致線粒體膜電位降低線粒體凋亡增加極大影響線粒體功能[21-23]。精子線粒體的活力與線粒體膜電位呈正相關(guān)，即精子的活動能力取決于線粒體的功能完整性[24]。本研究中我們應(yīng)用Western blot方法檢測正常體檢者與弱精子癥經(jīng)過石萆湯治療后患者精子線粒體膜蛋白PHB蛋白表達(dá)量顯著高于發(fā)現(xiàn)弱精子癥患者（未被治療者）即在疾病狀態(tài)下精子PHB表達(dá)顯著降低。而通過對3組患者精子JC-1染色后進(jìn)行流式檢測證實了弱精子組患者紅色熒光散點偏向下移，即線粒體膜電位顯著降低。在對弱精組患者給予石萆湯治療后可顯著逆轉(zhuǎn)線粒體的去極化，膜電位增加，流式散點整體上移；弱精子癥組患者線粒體膜蛋白PHB的表達(dá)減少，使線粒體去極化進(jìn)程加快而使線粒體膜電位降低，加速了精子細(xì)胞的凋亡。治療組經(jīng)過石萆湯治療增加了線粒體膜蛋白PHB的表達(dá)，恢復(fù)精子線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡恢復(fù)線粒體功能，提升了精子活力。

綜上，精子活力異常導(dǎo)致的男性不育的發(fā)生可能與PHB表達(dá)異常有關(guān)，石萆湯治療腎虛夾濕型弱精子癥可能是通過調(diào)控精子線粒體膜蛋白PHB表達(dá)進(jìn)而上調(diào)精子線粒體膜電位最終提高精子活力，同時精子線粒體膜蛋白PHB檢測可作為評價不育男性精子質(zhì)量的指標(biāo)之一在臨床弱精子癥患者診斷及藥物研發(fā)中發(fā)揮較大意義。