陽 敏，劉 璐，吳 楨，吳天昊，譚穎琪，龍丹丹，高天翔，宋 娜

（1.中國海洋大學水產(chǎn)學院，山東 青島266003；2.浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江 舟山316022）

形態(tài)學方法是魚類群系劃分的一種傳統(tǒng)的、基本的方法［1］，早期的形態(tài)學研究主要對樣品的量度特征和分節(jié)特征等形態(tài)學指標進行統(tǒng)計分析［2］。在上世紀80年代出現(xiàn)的地標形態(tài)學則借助幾何學方法對魚體的二維或三維形態(tài)坐標點間的位置、距離等關(guān)系進行分析［3］，兩種方法結(jié)合使用可以更好地研究形態(tài)學差異［4］。硬骨魚類矢耳石在形成過程中其形態(tài)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，且具有物種和群系特異性［5-6］。隨著圖像分析技術(shù)的進步，耳石形態(tài)被越來越廣泛地應(yīng)用于種內(nèi)和種間的鑒別［7-9］。魚類耳石外部形態(tài)特征的分析方法通常有傳統(tǒng)耳石形態(tài)分析法和橢圓傅里葉分析法兩種［2］。前者側(cè)重對耳石體軸的分析，即對耳石形態(tài)量度特征（如耳石長、耳石寬、耳石面積等）或者將其進行幾何學組合得到的形態(tài)指標（如橢圓率、矩形趨近率、半徑比等）進行分析［10-11］；后者則側(cè)重對耳石外部輪廓進行分析［12-14］。

棱梭（Chelon affinis）隸屬硬骨魚綱，鯔形目，鯔科，梭屬（Chelon）［15］，作為梭屬魚類的一個重要魚種，因其背部在第一背鰭之前有一條正中縱走棱脊而明顯區(qū)別于其他梭屬魚類而得名。此外該魚類國內(nèi)又稱棱鮻［16］、前鱗龜鮻［17-18］等；拉丁學名Liza affinis［16］、Chelon affinis、Planiliza affinis［19］等都作為棱梭的學名出現(xiàn)，本研究采用目前國內(nèi)外普遍使用的Chelon affinis作為棱梭的學名。棱梭棲息于淺?；蚝涌谙痰粎R處，淡水至鹽度達38的海水中均能生長。棱梭的耐寒能力較強，性活潑，春季游向近岸，冬季于深水處越冬。性成熟魚年齡為3齡，產(chǎn)卵期為冬末春初，是重要的經(jīng)濟魚類之一［20］。國內(nèi)對與棱梭同為梭屬的梭魚（Chelon haematocheilus）的群體形態(tài)學研究已于2012年被報道［21］，但關(guān)于棱梭的形態(tài)學和耳石形態(tài)學研究目前未有報道。本研究從形態(tài)學、耳石形態(tài)學兩個角度對采自中國近海海域6個地點的棱梭群體的差異進行分析，以闡述棱梭種內(nèi)不同地理群體間的分化水平，為進一步的棱梭群體遺傳學研究提供參考，同時豐富魚類群體耳石形態(tài)學的研究內(nèi)容，比較形態(tài)學和耳石形態(tài)學兩種方法在群體差異研究中的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究于2013年10月至2015年11月分別采集了金門、廈門、虎門、湛江、北海、防城港各鄰近海域中共6個棱梭地理群體的樣品（圖1、表1）。樣品由碎冰包埋處理后運輸?shù)街袊Ｑ蟠髮W漁業(yè)生態(tài)學實驗室，選取性成熟個體經(jīng)形態(tài)學種類鑒定［22］后進行形態(tài)學測量，并摘取樣品的左右矢耳石。

圖1 棱梭樣品采集站位分布Fig.1 Distribution of the sampling sites for Chelon affinis

表1 棱梭樣品及矢耳石采集信息Tab.1 Sampling information of C.affinis and their sagittal otoliths

1.2 實驗方法

測定棱梭的14個可數(shù)特征（第一背鰭鰭棘數(shù)量、第二背鰭鰭棘數(shù)量/鰭條數(shù)量、胸鰭鰭棘數(shù)量、腹鰭鰭棘數(shù)量/鰭條數(shù)量、臀鰭鰭棘數(shù)量/鰭條數(shù)量、尾鰭鰭條數(shù)量，上/下鰓耙數(shù)量、脊椎骨數(shù)量、橫列鱗數(shù)量、縱列鱗數(shù)量）和16個可量特征（體重、體高、全長、體長、第一背鰭基長、第二背鰭基長、胸鰭長、腹鰭長、臀鰭基長、頭長、吻長、上頜長、眼徑、眼間隔、尾柄長、尾柄高）。此外，選取棱梭外部形態(tài)的9個坐標點構(gòu)建框架結(jié)構(gòu)（圖2）。根據(jù)設(shè)定的9個坐標點之間的直線距離，測量兩兩之間16個量度指標：D1-2（坐標點1與2之間的距離，以下類推）、D1-3、D2-3、D2-4、D2-5、D3-4、D3-5、D4-5、D4-7、D5-6、D6-7、D6-8、D6-9、D7-8、D7-9、D8-9。所有可數(shù)特征均由肉眼直接計數(shù)，體重由電子天平秤得（精確到0.1 g），其他量度指標均由游標卡尺測得（精確到0.01 cm）。

圖2 棱梭框架結(jié)構(gòu)測量示意Fig.2 Truss network for morphometrics measurements of C.affinis

將摘取的左右矢耳石置于已編號的離心管中，經(jīng)超聲波清洗，烘箱烘干［23］。用連于解剖鏡的數(shù)碼相機Nikon SMZ 1000對所有耳石的凹面進行拍照。使用Image-Pro Plus 6.0對獲得的耳石照片進行校準、測量，得出8個耳石尺寸指標：耳石面積（A）、耳石周長（P）、耳石長（L）、耳石寬（W）、耳石最大Feret徑長（Fmax）和最小Feret徑長（Fmin）、耳石最大半徑（Rmax）和耳石最小半徑（Rmin）［23］。利用以上8個耳石尺寸指標得到8個耳石形狀指標：橢圓率=（L-W）/（L+W）；形態(tài)因子=4πA/P2；矩形趨近率=A/（L×W）；環(huán)率=P2/A；圓度=4A/πL2；幅形比=L/W；耳石的Feret比=Fmax/Fmin；耳石的半徑比=Rmax/Rmin［11，23］。耳石大小、耳石擺放位置不同等因素會對分析結(jié)果產(chǎn)生影響，這可以通過耳石形狀指標消除［11］。

橢圓傅里葉分析方法側(cè)重于耳石二維輪廓和形態(tài)分析［24］。首先應(yīng)用Shape軟件包［25］對耳石二維影像進行處理得到傅里葉諧函數(shù)，而后依次使用Chaincoder.exe、CHC2NEF.exe、Prin Comp.exe軟件包將其轉(zhuǎn)換為傅里葉諧值，得到77個橢圓傅里葉參數(shù)［24］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 形態(tài)學數(shù)據(jù)分析 采用體長比值法（頭部指標量度值除以頭長、尾柄長除以尾柄高、其他參數(shù)值除以體長）［26-27］對測量數(shù)據(jù)進行校正以消除非同齡棱梭不同體長所帶來的差異。

①主成分分析：對28組校正后的形態(tài)學量度指標進行主成分分析，根據(jù)前兩個主成分得分繪制主成分散點圖。

②聚類分析：采用組之間聯(lián)接的方式，使用平方Euclidean距離系數(shù)對28組校正后的形態(tài)學量度指標平均值和4組可數(shù)特征的平均值進行聚類分析，構(gòu)建聚類關(guān)系樹。

③判別分析：對28組形態(tài)學量度指標進行判別分析，根據(jù)前兩個判別函數(shù)值制成散點圖。

④單因子方差分析：采用LSD法和Tamhane’s T2法對28組校正后的形態(tài)學量度指標進行單因子方差分析。

以上分析均通過SPSS 22.0軟件完成。

1.3.2 耳石形態(tài)數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 22.0軟件對棱梭的8個耳石形狀指標和77個橢圓傅里葉參數(shù)共85個耳石形態(tài)指標進行主成分分析、聚類分析和判別分析，具體方法參照“1.3.1”。

2 結(jié)果與討論

2.1 棱梭形態(tài)學結(jié)果

對6個群體的14個可數(shù)特征進行分析（表2），結(jié)果顯示：6個群體的腹鰭鰭棘數(shù)量、腹鰭鰭條數(shù)量、第一背鰭鰭棘數(shù)量、第二背鰭鰭棘數(shù)量、臀鰭鰭棘數(shù)量、臀鰭鰭條數(shù)量、尾鰭鰭條數(shù)量均為固定值，分別為1、5、4、1、3、9、14；縱列鱗數(shù)量介于26～43片之間，數(shù)值變化范圍較大，分布相對較為平均。橫列鱗數(shù)量介于10～17片之間，大多群體數(shù)量在11～14片之間，占總數(shù)的87.4%；胸鰭鰭棘數(shù)量在14～17條之間，大多群體數(shù)量在15～16條之間，其中以15條最多，占總數(shù)的76.9%；第二背鰭鰭條數(shù)量介于6～10條之間，大多群體數(shù)量為8條和9條，二者占總數(shù)的91.4%；上鰓耙數(shù)量介于25～28根之間，下鰓耙數(shù)量介于46～49根之間，分布均相對較為平均；脊椎骨數(shù)量介于22～25節(jié)之間，24節(jié)的個體最多，占總數(shù)的65.7%。不同棱梭群體之間的可數(shù)特征差異十分微小。

表2 棱梭群體可數(shù)特征Tab.2 Countable characteristics of C.affinis populations

使用體長校正法校正所有棱梭樣本的傳統(tǒng)形態(tài)學可量特征數(shù)據(jù)和框架數(shù)據(jù)，得到28個量度指標，對其進行主成分分析。量度指標包括體高/體長、第一背鰭基長/體長、第二背鰭基長/體長、胸鰭長/體長、腹鰭長/體長、臀鰭基長/體長、頭長/體長、吻長/頭長、上頜長/頭長、眼徑/頭長、眼間隔/頭長、尾柄長/尾柄高、D1-2/體長、D1-3/體長、D2-3/體長、D2-4/體長、D2-5/體長、D3-4/體長、D3-5/體長、D4-5/體長、D4-7/體長、D5-6/體長、D6-7/體長、D6-8/體長、D6-9/體長、D7-8/體長、D7-9/體長、D8-9/體長。將主成分根據(jù)其特征值大小排序，結(jié)果顯示前兩個主成分的貢獻率分別為27.623%和10.429%，特征值大于1的前8個主成分累積貢獻率為65.868%（表3）。第一主成分中框架數(shù)據(jù)載荷值較大，主要反映魚體比例特征；第二主成分中胸鰭長/體長、腹鰭長/體長、頭長/體長、D6-8/體長和D7-9/體長的載荷值較大，反映魚體胸鰭長、腹鰭長、頭長和尾柄長等特征。

表3 前8個主成分的特征值和貢獻率Tab.3 Eigenvalues and contributions of the first 8 principle components

根據(jù)第一主成分和第二主成分分析得分繪制散點圖（圖3），圖3中顯示，各群體有較大交叉，北海群體多位于散點圖縱軸的正半軸，廈門群體多位于散點圖縱軸的負半軸，其他群體則沒有呈現(xiàn)出明顯的分布傾向。

圖3 形態(tài)量度指標的前兩個主成分得分散點圖Fig.3 Scatter plots based on scores of the first two metrical characteristics from PCA

對棱梭的28個量度指標和4個可數(shù)特征（胸鰭鰭條數(shù)量、第二背鰭鰭條數(shù)量、縱列鱗數(shù)量和脊椎骨數(shù)量）的平均值進行聚類分析，構(gòu)建平均聯(lián)接的樹狀圖（圖4）。圖中顯示金門群體和北海群體形態(tài)特征上十分相近，首先聚為一支，然后依次與虎門、湛江、廈門和防城港聚在一起。

圖4 基于形態(tài)特征的6個棱梭群體聚類關(guān)系Fig.4 Dendrogram of the relationship of six C.affinis populations based on morphological characteristics

對6個棱梭群體的28個量度指標進行判別分析，結(jié)果顯示，6個群體的判別正確率在57.7%～93.1%之間，其中廈門群體判別正確率最高，為93.1%，湛江群體判別正確率最低，為57.7%，綜合判別正確率為75.9%（表4）。判別分析過程中，為了建立判別公式而從28個指標中篩選出對判別貢獻較大的9個參數(shù)，分別為體高/體長（A）、第二背鰭基長/體長（B）、腹鰭長/體長（C）、臀鰭基長/體長（E）、頭長/體長（F）、上頜長/頭長（G）、D1-2/體長（H）、D2-3/體長（I）、D7-9/體長（J）。所得判別正確率Y計算公式如下：

金門群體：

廈門群體：

虎門群體：

湛江群體：

北海群體：

防城港群體：

根據(jù)前2個判別函數(shù)值繪制散點圖（圖5），由圖5可知，虎門和廈門兩群體重疊嚴重，金門、防城港、北海3個群體相距較近，湛江個體則較為分散，與其他各個群體都有一定重疊。

表4 棱梭群體量度指標判別分析結(jié)果Tab.4 Results of discriminant analysis on metrical characteristics of C.affinis

圖5 基于量度指標的前兩個判別函數(shù)值散點圖Fig.5 Scatter plots based on the first two discriminant functions of metrical characteristics

對6個棱梭群體28組量度指標進行單因子方差分析，對具有方差齊性和不具有方差齊性的變量分別采用LSD法和Tamhane’s T2法分析，各組變量在0.05水平上顯著性差異。結(jié)果表明，除了變量第一背鰭基長/體長、吻長/頭長、尾柄長/尾柄高、D2-4/體長、D3-5/體長、D4-5/體長和D5-6/體長，不同群體之間的其他21個量度指標的均值都存在顯著差異。結(jié)果顯示，6個群體存在顯著差異的指標個數(shù)較多，其中，廈門群體與金門、北海和防城港群體之間均有11個指標存在顯著差異，為最多；湛江與金門群體之間僅有1個指標（即體高/體長）存在顯著差異，為最少。差異系數(shù)依據(jù)Mayr等（1953）提出的75%識別與劃分規(guī)則［28］求得，用差異系數(shù)大于等于1.28的亞種差異標準來衡量幾個群體間的差異程度，結(jié)果顯示所有兩兩群體之間、所有量度指標的差異系數(shù)小于1.28，介于0.000 3～1.035 1之間。

2.2 棱梭耳石形態(tài)

為了檢驗棱梭左右矢耳石的差異性，使用配對樣本t檢驗，對6個棱梭群體樣本的左右矢耳石（凹面）的8個原始耳石尺寸指標進行差異性分析。結(jié)果顯示棱梭左右耳石差異不明顯（p＞0.05）。因此，在后續(xù)的分析中統(tǒng)一對棱梭的左耳石進行分析。

對6個棱梭群體的85個耳石形態(tài)指標進行主成分分析，結(jié)果顯示特征值大于1的前23個主成分的累積貢獻率為79.290%，其中前9個主成分的累積貢獻率超過50%，為52.484%。第一主成分貢獻率為11.841%，第二主成分貢獻率為8.364%，第三主成分貢獻率為6.258%。根據(jù)前兩個主成分的得分情況繪制散點圖，結(jié)果顯示，湛江群體多位于散點圖縱軸的正半軸，北海群體多位于散點圖縱軸的負半軸。其他的群體則沒有呈現(xiàn)出明顯的分布傾向（圖6）。

圖6 耳石形態(tài)指標的前兩個主成分得分散點圖Fig.6 Scatter plots based on scores of the first two otolith morphological characteristics from PCA

對6個棱梭群體85個耳石形態(tài)指標的平均值進行聚類分析，構(gòu)建平均聯(lián)結(jié)的樹狀圖。圖中顯示金門群體和北海群體首先聚為一支，然后依次為湛江、廈門、防城港，最后是和虎門聚在一起（圖7）。

圖7 基于耳石形態(tài)特征的棱梭群體聚類關(guān)系Fig.7 Dendrogram of the relationship of six C.affinis populations based on otolith morphological characteristics

對6個棱梭群體的85個耳石形態(tài)指標進行判別分析。結(jié)果顯示，6個棱梭群體判別正確率僅在60.0%～78.6%之間，綜合判別正確率為69.3%。其中判別正確率最高的是金門群體，為78.6%，防城港群體判別正確率次之，為75.9%，廈門群體判別正確率最低，為60.0%。每個群體都有個體被誤判到金門群體、北海群體和防城港群體中（表5）。

根據(jù)典則判別函數(shù)散點圖可知，虎門群體和湛江群體與其他群體有較明顯的界線，其他4個群體交叉嚴重，沒有明顯的界線（圖8）。

表5 棱梭群體耳石形態(tài)特征判別分析結(jié)果Tab.5 Results of discriminant analysis on otolith morphological characteristics of C.affinis

2.3 討論

形態(tài)學研究將傳統(tǒng)形態(tài)學和地標形態(tài)學相結(jié)合，對棱梭的6個群體174尾樣品的形態(tài)學特征進行比較分析。從棱梭可數(shù)特征的實驗結(jié)果來看，棱梭橫列鱗數(shù)量為13片，腹鰭鰭棘數(shù)量為1條，腹鰭鰭條數(shù)量為5條，臀鰭鰭棘數(shù)量為3條，臀鰭鰭條數(shù)量為9條，第一背鰭鰭棘數(shù)量為4條，第二背鰭鰭棘數(shù)量為1條，尾鰭鰭條數(shù)量為14條，這些指標都為定值，且與1962年南海魚類志［29］、1963年東海魚類志［20］等相關(guān)分類資料中的記錄相一致。不同棱梭群體之間的可數(shù)特征差異十分微小，因此可數(shù)特征很難作為這6個棱梭群體的區(qū)分依據(jù)。

圖8 基于耳石形態(tài)特征的前兩個判別函數(shù)值的散點圖Fig.8 Scatter plots based on the first two discriminant functions of otolith morphological characteristics

在形態(tài)學分析中主成分分析結(jié)果顯示前8個主成分累積貢獻率為65.868%，遠小于臨界值85.000%，由本結(jié)果可以推斷這6個棱梭群體形態(tài)上的差異不能夠單獨依靠少數(shù)指標來判斷［30］。貢獻率最大的第1和第2主成分，主要反映了魚體比例特征、魚體胸鰭長、腹鰭長、頭長和尾柄長等特征。主成分散點圖顯示金門、虎門、湛江和防城港4個群體的關(guān)系密切，廈門和北海分別與其他群體之間略有差異（圖3）。聚類分析中金門、虎門、湛江和防城港4個群體的聚類結(jié)果說明群體間的主要指標差異的成因與地理距離有一定關(guān)聯(lián)，但是距離很近的金門群體與廈門群體差異較大，相距很遠的金門群體與北海群體卻首先聚為一支（圖4）。金門、北海近海海岸平直、海底地形平緩且水流通暢，其他4個地點包括廈門海岸線曲折、水動力環(huán)境復雜［31］，再者棱梭成魚為底層生活魚類，以攝食底棲生物為主，據(jù)此推測金門與廈門近海海底地形地貌和水動力環(huán)境等非生物環(huán)境差異以及其導致的餌料組成的差異［32］可能是這兩個棱梭群體形態(tài)差距大的主要原因，海底地形地貌和水動力環(huán)境也解釋了金門與北海群體的高相似度。

形態(tài)學判別分析結(jié)果顯示6個棱梭群體判別正確率在57.7%～93.1%之間，綜合判別正確率為75.9%。結(jié)合前兩個判別函數(shù)值繪制的散點圖可得出如下結(jié)論：虎門和廈門兩個棱梭群體關(guān)系密切，湛江與其他各群體均存在一定相似度（圖5）。通過以上數(shù)據(jù)分析可知由形態(tài)學特征得到的分類函數(shù)并不能精確地將6個群體的棱梭分開。單因素方差分析顯示湛江棱梭群體與其他群體在形態(tài)上存在顯著差異的量度指標較少，而其他兩兩群體之間的形態(tài)差異指標較多，說明這些棱梭群體間出現(xiàn)了一定程度的形態(tài)學差異。其中，湛江與金門群體之間僅有1個指標存在顯著差異，為最少。這與判別分析結(jié)果共同表明了地理位置位于6個地點中間的湛江群體與其他群體相似度高。通過差異系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，以上群體間量度指標的差異系數(shù)介于0.000 3～1.035 1之間，根據(jù)Mayr等提出的臨界值1.28判斷，這6個棱梭群體形態(tài)學差異并未達到亞種水平［28］。

對棱梭左右矢耳石（凹面）的6個尺寸指標進行配對t檢驗，結(jié)果表明棱梭左右矢耳石差異不顯著，表明棱梭耳石在種內(nèi)群體間具有高度同質(zhì)性［2］。對6個棱梭群體163個耳石樣本的85個耳石形態(tài)學參數(shù)進行主成分分析、聚類分析和判別分析，結(jié)果與形態(tài)學分析結(jié)果相近。主成分分析結(jié)果顯示前23個主成分（特征值大于1）的累積貢獻率為79.290%，說明不能使用少數(shù)因子判斷6個群體的差異。有學者對中國沿海黃鯽（Setipinna tenuifilis）［2］和斑尾復鰕虎魚（Synechogobius ommaturus）［33］不同地理群體的耳石形態(tài)差異進行研究，發(fā)現(xiàn)均能用少數(shù)因子判斷群體間耳石形態(tài)的差異，造成研究間差別的原因可能與研究的魚種、群體間地理遠近程度等因素有關(guān)?；诘谝?、第二主成分的得分散點圖顯示6個群體的耳石形態(tài)差異不明顯（圖6）。聚類分析結(jié)果顯示金門與北海群體最為相似，這一點與形態(tài)學研究結(jié)果相同（圖7）。6個群體判別正確率僅在60.0%～78.6%之間，綜合判別正確率為69.3%?；谇皟蓚€判別函數(shù)的散點圖表明，虎門和湛江群體與其他群體有相對明顯的界線（圖8）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學、地標形態(tài)學和耳石形態(tài)學，使用多元統(tǒng)計分析方法對中國東南沿海的6個棱梭地理群體的差異進行研究，魚體形態(tài)和矢耳石形態(tài)的分析結(jié)果基本一致。兩者共同顯示各群體間存在一定差異，且聚類分析結(jié)果均表明各群體間的差異與地理距離有關(guān)聯(lián)，此外棲息地環(huán)境、餌料組成和海流等可能是導致形態(tài)學差異和耳石形態(tài)差異形成的主要因素。同時，海流的通暢會使得各水域海水溫度、鹽度等理化因子相似，這會減弱群體間形態(tài)和耳石形態(tài)的差異，群體間的交流也是差異減弱的一個重要因素。通過兩種方法的結(jié)合，更好地揭示了地理群體間的關(guān)系，豐富了群體間差異研究的案例，為棱梭種質(zhì)資源的保護和利用提供了一定的研究基礎(chǔ)。