白 妍，葛雨珺，向迎春，李 苑，丁 甜，胡亞芹,*

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；2.重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶 408000）

作為人類賴以生存和發(fā)展的重要物質(zhì)前提，食品的質(zhì)量安全直接影響國民身體健康及生命安全。微生物導(dǎo)致的腐敗變質(zhì)是威脅食品質(zhì)量安全、造成食品工業(yè)中巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要因素之一，因此，殺菌成為食品加工過程中的必要工序。食品工業(yè)中應(yīng)用的殺菌方法主要包括熱殺菌和非熱殺菌，其中熱殺菌（如巴氏殺菌、高溫瞬時(shí)殺菌等）因滅菌效果好、操作方便等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。然而，由于高溫可能會(huì)對(duì)食品品質(zhì)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致食品顏色變化、產(chǎn)生異味、營養(yǎng)損失等不良后果，同時(shí)高溫殺菌具有污染環(huán)境、能源消耗量大等劣勢，因此非熱殺菌技術(shù)日益成為新型殺菌技術(shù)研究和開發(fā)的重點(diǎn)[1]。

非熱殺菌技術(shù)是食品工業(yè)新型加工技術(shù)，具有殺菌條件易控、受外界條件影響較小等優(yōu)點(diǎn)；非熱殺菌處理過程中，食品物料可以保持相對(duì)較低的溫度，對(duì)食品的色、香、味以及營養(yǎng)成分影響較小，同時(shí)有利于保持食品中各種功能成分的生理活性，可以滿足消費(fèi)者對(duì)高品質(zhì)食品的要求[1]。目前食品工業(yè)中滅活芽孢的非熱殺菌技術(shù)主要有如高靜壓（high hydrostatic pressure，HHP）技術(shù)、高壓CO2（high-pressure CO2，HPCD）技術(shù)、低溫等離子體（non-thermal plasma，NTP）技術(shù)、紫外輻射（ultraviolet light，UV）技術(shù)、脈沖電場（pulsed electric field，PEF）技術(shù)等，本文綜述這些非熱殺菌技術(shù)獨(dú)立處理或與其他處理技術(shù)相結(jié)合對(duì)芽孢滅活的效果及其機(jī)理，分析各種非熱殺菌技術(shù)的研究進(jìn)展和應(yīng)用前景，著重討論其在食品行業(yè)中的應(yīng)用以及芽孢滅活的分子機(jī)制，以期為生產(chǎn)安全食品、降低不同種類食品中微生物污染提供解決方案。

1 芽孢與食品安全

芽孢是由產(chǎn)芽孢桿菌在營養(yǎng)條件缺乏時(shí)產(chǎn)生的休眠體，廣泛存在于環(huán)境中，是食品工業(yè)中的主要微生物污染源之一，易引起食品安全事故。19世紀(jì)后半葉，芽孢作為細(xì)菌休眠體被研究者發(fā)現(xiàn)，并因其高抗性逐漸受到重視，已有大量研究致力于探究芽孢抵抗外界極端環(huán)境的分子機(jī)制。盡管芽孢在休眠狀態(tài)下代謝并不明顯，但其仍能持續(xù)監(jiān)測周圍環(huán)境的營養(yǎng)狀況，并在適宜的環(huán)境條件下萌發(fā)和恢復(fù)生長[2]。此外，芽孢對(duì)濕熱和干熱、紫外線輻射和γ射線輻射、極端干燥（包括真空）和氧化劑等不利條件均具有高抗性，因此在加工處理中芽孢極有可能存在于最終產(chǎn)品中，并在一定條件下萌發(fā)生長，最終導(dǎo)致食品腐敗，甚至引起食源性疾病[3]，芽孢的滅活效果可用來評(píng)價(jià)食品的殺菌程度[4]。

溫度低于100 ℃的熱殺菌處理可以殺滅致病菌以及其他有害微生物，但不足以殺滅抗逆性極強(qiáng)的細(xì)菌芽孢[5]。芽孢的高度抗逆性主要是由于其獨(dú)特的多層結(jié)構(gòu)（孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、內(nèi)膜、芽孢核等）所致[6]，這些結(jié)構(gòu)可以起到保持芽孢內(nèi)部水分含量、限制有害物質(zhì)進(jìn)入等作用，常規(guī)的食品工業(yè)殺菌工藝很難將其危害性消除。對(duì)芽孢進(jìn)行滅活的應(yīng)用和分子機(jī)制研究一直以來都是食品工業(yè)所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和重要課題。

2 HHP技術(shù)

2.1 HHP殺菌技術(shù)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

HHP技術(shù)是目前食品商業(yè)殺菌中應(yīng)用最廣泛的新型非熱殺菌技術(shù)[7]，主要是在冷藏或室溫（4～25 ℃）下，利用高壓（400～600 MPa）對(duì)食品進(jìn)行處理以延長其貨架期，保持食品新鮮，其殺菌效果與巴氏殺菌相當(dāng)，與傳統(tǒng)熱殺菌相比可以較好地保持食品的品質(zhì)[8]。近年來HHP技術(shù)在食品殺菌中的應(yīng)用逐漸成熟，國內(nèi)外關(guān)于HHP滅活芽孢的研究報(bào)道逐漸增多（表1），無論是在純培養(yǎng)條件還是在食品介質(zhì)中，HHP技術(shù)都具有優(yōu)良的芽孢滅活效果。

表1 HHP技術(shù)滅活芽孢效果Table 1 Efficacy of HHP in inactivation of spores

目前，HHP技術(shù)在滅活芽孢中的應(yīng)用仍處于基礎(chǔ)研究階段，少見對(duì)商品化的產(chǎn)品進(jìn)行芽孢殺滅，HHP滅活芽孢受到pH值、溫度等多種外部因素的影響：在低pH值條件下進(jìn)行HHP處理時(shí)，芽孢的熱抗性更低[14]；H H P處理溫度影響芽孢的萌發(fā)狀況，Black等[15]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)芽孢釋放吡啶二羧酸（dipicolinic acid，DPA）并萌發(fā)的最佳溫度隨壓力的變化而發(fā)生改變；Robertson等[16]研究了兩種加壓流體的HHP處理對(duì)芽孢桿菌屬芽孢的滅活效果，結(jié)果表明使用硅油作為加壓流體的HHP處理具有更好的滅活效果。由此可見，HHP技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中需要根據(jù)產(chǎn)品的實(shí)際情況確定生產(chǎn)參數(shù)以優(yōu)化芽孢滅活效果。

此外，對(duì)HHP滅活芽孢動(dòng)力學(xué)的研究也取得了一定進(jìn)展。Olivier等[17]首次將F值（在一定殺菌壓力和溫度下，殺死一定濃度的某種微生物所需時(shí)間）用于全面定量地確定HHP滅活芽孢的效果；Uchida等[18]利用Weibull模型對(duì)600 MPa處理?xiàng)l件下不同糖度的麥芽提取物肉湯中A. acidoterrestris芽孢滅活過程進(jìn)行擬合，并確定一級(jí)動(dòng)力學(xué)參數(shù)；Doona等[19]通過HHP設(shè)計(jì)了芽孢萌發(fā)動(dòng)力學(xué)的“準(zhǔn)化學(xué)”模型，將萌發(fā)和滅活的微分方程模型整合到一個(gè)由HHP建立的芽孢動(dòng)力學(xué)綜合模型中。

2.2 HHP滅活芽孢機(jī)制

HHP滅活芽孢的機(jī)制可以歸結(jié)為3 個(gè)階段，其中包括高壓誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)階段、芽孢多層結(jié)構(gòu)的破壞階段以及芽孢的最終滅活階段[9]。HHP處理過程中高壓及其變化直接導(dǎo)致芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，使其產(chǎn)生一定的機(jī)械損傷，同時(shí)改變芽孢膜蛋白的理化性質(zhì)以及芽孢內(nèi)部的水分含量，引起其內(nèi)部DPA釋放、酸溶性小蛋白（small acid-soluble proteins，SASPs）降解、萌發(fā)受體（germinant receptors， GRs）激活等一系列生理變化，進(jìn)而引起芽孢亞致死損傷、萌發(fā)和失活[20]。

近年來，對(duì)HHP誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的研究取得了很大進(jìn)展，尤其是HHP誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的分子機(jī)制[6]，隨著HHP處理壓力的變化，誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)的機(jī)制也會(huì)發(fā)生變化。低壓（100～150 MPa）可以誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)。Black等[21]的研究表明，150 MPa、37 ℃處理7 min可使約90%芽孢萌發(fā)，這種萌發(fā)是通過誘導(dǎo)GRs實(shí)現(xiàn)的。一旦GRs被低壓處理激活，芽孢內(nèi)核釋放Ca-DPA從而激活芽孢內(nèi)主要的皮質(zhì)溶解酶（cortex lytic enzymes，CLEs）。低壓條件下，由于萌發(fā)蛋白酶的激活，芽孢中的SASPs會(huì)發(fā)生降解，從而導(dǎo)致芽孢比更高壓力（500 MPa）單獨(dú)處理下更易滅活，這也說明SASP在芽孢熱抗性中的重要作用[22]。中高壓（500～600 MPa）也可以誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，其機(jī)制與低壓誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)不同[23]。中高壓主要通過作用于芽孢內(nèi)膜上的DPA通道誘導(dǎo)DPA以及其他小分子物質(zhì)釋放，從而激活芽孢內(nèi)的CLEs。這種機(jī)制在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）芽孢和蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）芽孢中都得到了證明，表明中高壓處理可以誘導(dǎo)部分具有皮層水解機(jī)制芽孢的萌發(fā)[24]。此外，孫靜等[25]的研究表明，無論低壓還是中高壓HHP處理都可以促進(jìn)芽孢核中Ca-DPA的釋放和皮層的降解，從而降低芽孢的熱抗性，而在350 MPa和550 MPa的中高壓處理下，B. subtilis芽孢熱抗性降低的原因是高壓誘導(dǎo)芽孢產(chǎn)生的亞致死損傷，而不是芽孢萌發(fā)。

因此，HHP可以調(diào)節(jié)芽孢的萌發(fā)機(jī)制，降低其對(duì)后續(xù)滅活處理的抗性。然而，高壓誘導(dǎo)的芽孢萌發(fā)只發(fā)生于芽孢桿菌屬，對(duì)于梭菌屬則沒有這種效應(yīng)[24]。由于部分芽孢對(duì)目前工業(yè)上應(yīng)用的HHP處理（例如650 MPa、50 ℃）具有抗性以及芽孢自身獨(dú)特的生理特性，因此可以改進(jìn)HHP工藝或配合其他殺菌條件來滅活芽孢，如間歇HHP工藝可以先誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)，瀉壓后施加更高的壓力滅活芽孢；HHP與熱處理、超聲波、PEF、UV、輻照、細(xì)菌素、化學(xué)試劑等滅菌技術(shù)相結(jié)合可以降低HHP所需壓力、縮短處理時(shí)間并降低處理成本。這種基于現(xiàn)代柵欄技術(shù)、以HHP為主的復(fù)合殺菌方法將成為非熱殺菌領(lǐng)域最具潛力和經(jīng)濟(jì)效益的一項(xiàng)技術(shù)[20]。

3 HPCD技術(shù)

3.1 HPCD殺菌技術(shù)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

HPCD是一種通過CO2的分子效應(yīng)及其他未知機(jī)理而起到滅活微生物作用的一種新型殺菌技術(shù)，一般來說，HPCD主要利用50 MPa以下處于特殊形態(tài)的CO2，包括超臨界態(tài)和亞臨界態(tài)CO2，其中應(yīng)用較多的是超臨界CO2[26]。自1951年Fraser等[27]首次將HPCD作為殺菌技術(shù)滅活大腸桿菌菌體細(xì)胞，在過去的60多年中，HPCD的殺菌效能及其機(jī)理逐漸成為非熱殺菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。與傳統(tǒng)殺菌方式相比，HPCD殺菌技術(shù)具有一定優(yōu)勢：CO2不易燃且無毒，這意味著HPCD處理是環(huán)境友好的，且無有毒物質(zhì)殘留；用于滅菌的CO2壓力（通常低于30 MPa）遠(yuǎn)低于HHP（100～600 MPa）處理，這使得HPCD技術(shù)中使用的壓力更易于控制；此外，與熱處理相比，HPCD處理時(shí)溫度更低，因此對(duì)食品的營養(yǎng)成分和理化性質(zhì)的影響較小[5]。李鳳娟[28]采用響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)對(duì)HPCD滅活B. subtilis芽孢效能進(jìn)行了研究，在壓力25.6～28.8 MPa、溫度40～47 ℃、保壓時(shí)間36.5～47.0 min的條件下，芽孢失活率可達(dá)到3.48 個(gè)數(shù)量級(jí)，這表明HPCD對(duì)芽孢具有良好的殺滅效果，其中壓力、溫度、保壓時(shí)間都是重要的影響因素。

雖然HPCD可以有效殺滅致病菌、腐敗菌、酵母以及霉菌的營養(yǎng)細(xì)胞（低于30 MPa、20～40 ℃），HPCD在較溫和的溫度（20～40 ℃）下難以使結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的細(xì)菌芽孢失活[5]。因此，為了增強(qiáng)HPCD技術(shù)對(duì)芽孢的滅活效果，大量研究將HPCD與熱處理、循環(huán)加壓、化合物處理等技術(shù)結(jié)合，利用HPCD復(fù)合殺菌技術(shù)提高滅活細(xì)菌芽孢的效能。高媛等[29]的研究表明45 ℃預(yù)熱處理可以提高HPCD（20 MPa）芽孢失活率1.4 個(gè)數(shù)量級(jí)；Karajanagi等[30]提高HPCD處理（7～9 MPa）B.subtilis芽孢的溫度（60～70 ℃），殺滅芽孢數(shù)量可達(dá)7（lg（CFU/mL））；Spilimbergo等[31]使用循環(huán)加壓的方法處理B.subtilis芽孢，在較低溫度（36～50 ℃），殺滅芽孢數(shù)量可達(dá)0.8～2.0（lg（CFU/mL））；Spilimbergo等[32]將HPCD與PEF技術(shù)相結(jié)合（20 MPa、40 ℃、900 min）處理B.cereus芽孢，殺滅芽孢數(shù)量約為1.5（lg（CFU/mL））。此外，有研究表明，HPCD處理與乙醇、乙酸、檸檬酸、H2O2、PAA等化合物協(xié)同處理也可提高芽孢的滅活效果[5]。

3.2 HPCD滅活芽孢機(jī)制

目前對(duì)于HPCD滅活芽孢的機(jī)理主要有兩種主流的假設(shè)：一部分學(xué)者通過HPCD滅活芽孢的動(dòng)力學(xué)研究，提出“萌發(fā)滅活機(jī)制”，即芽孢在HPCD處理過程中首先被活化和萌發(fā)，然后被滅活[33]；此外，有學(xué)者通過HPCD處理后芽孢失活的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)分析，提出了“結(jié)構(gòu)破壞和失活機(jī)制”，這是另一種可能的HPCD處理芽孢使其失活的假設(shè)機(jī)制，即芽孢結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致芽孢死亡[34]。Rao Lei等[35]對(duì)B.subtilis芽孢進(jìn)行HPCD處理，對(duì)芽孢的萌發(fā)、內(nèi)膜和皮層的滲透性、DPA的釋放情況以及芽孢形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明HPCD處理不會(huì)使芽孢萌發(fā)也不會(huì)降低其熱抗性，但會(huì)增加芽孢內(nèi)膜和皮層的滲透性，破壞芽孢的結(jié)構(gòu)。此外，根據(jù)B.subtilis芽孢在HPCD處理下的滅活動(dòng)力學(xué)，可以將滅活過程分為兩個(gè)階段：第一階段滅活率較低，而第二階段芽孢顯著失活。第一階段中，CO2滲透進(jìn)入芽孢外部結(jié)構(gòu)中，可能導(dǎo)致一部分重要化學(xué)物質(zhì)的釋放從而促進(jìn)芽孢在結(jié)構(gòu)不被破壞的狀態(tài)下失活[36]；也有研究提出HPCD滅活芽孢與一些酶的失活有關(guān)，由于CO2的水合產(chǎn)物導(dǎo)致芽孢內(nèi)部pH值的降低從而抑制芽孢內(nèi)部的正常代謝[37]。這些機(jī)制可能在處理過程中同時(shí)發(fā)生，并最終導(dǎo)致芽孢的失活。

雖然已有研究提出了幾種HPCD處理滅活芽孢的機(jī)制，但由于缺乏豐富和明確的數(shù)據(jù)，HPCD滅活芽孢的機(jī)理很難得到完全闡明，需要進(jìn)行更深入和更全面的分析來探明HPCD處理滅活細(xì)菌芽孢的機(jī)理[38]。雖然近期的研究表明“結(jié)構(gòu)破壞和失活機(jī)制”更具說服力，但目前HPCD是如何準(zhǔn)確地作用于芽孢并破壞孢子的內(nèi)膜的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來研究內(nèi)膜特性的變化，并鑒定其損傷導(dǎo)致HPCD處理芽孢失活的特定蛋白質(zhì)。此外，還需要加強(qiáng)HPCD滅菌的數(shù)學(xué)模型的建立，以闡明滅菌機(jī)理并確定最佳工藝條件[5]。

4 NTP技術(shù)

4.1 NTP殺菌技術(shù)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

等離子體被稱為除固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)以外的第4種物質(zhì)存在狀態(tài)，廣泛存在于宇宙之中，由完全或部分離子化、整體呈現(xiàn)電中性的多種活性粒子（原子、電子、放電粒子、UV光子等）組成。當(dāng)對(duì)氣體施加的能量超過其本身分子間作用力時(shí)，氣體分子會(huì)被激發(fā)產(chǎn)生自由電子，這些自由電子會(huì)與周圍的分子或者原子發(fā)生碰撞，從而產(chǎn)生能量更高的激發(fā)態(tài)原子、離子以及自由電子[39]，各種粒子的混合體即為等離子體。在NTP中，電子的溫度遠(yuǎn)低于其他粒子的溫度，從而保持一種熱力學(xué)不平衡狀態(tài)，因此NTP的整體溫度可以保持在相對(duì)較低的溫度（低于60 ℃）[40]。與傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)相比，NTP技術(shù)處理溫度較低、殺菌速度快，具有一定的優(yōu)勢，同時(shí)應(yīng)用于食品殺菌時(shí)，具有無有害成分殘留的優(yōu)點(diǎn)[41]。

NTP技術(shù)可以有效殺滅食品介質(zhì)中的芽孢，不同類型等離子體激發(fā)裝置對(duì)芽孢均可以產(chǎn)生滅活效果，Kim等[42]使用微波NTP處理洋蔥粉中的B.cereus芽孢，其殺滅芽孢數(shù)量可達(dá)1.1～2.1（lg（CFU/mL））；Los等[43]用空氣介質(zhì)阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）等離子體處理谷粒中的萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）芽孢，其殺滅芽孢數(shù)量約為5（lg（CFU/mL））；Hertwig等[44]使用射頻等離子體射流處理黑胡椒中的B.subtilis和B.atrophaeus芽孢，其殺滅芽孢數(shù)量為2.4～2.8（lg（CFU/mL））。

NTP對(duì)芽孢滅活效果受很多因素的影響，如工作氣體組成、輸入功率、處理時(shí)間等處理參數(shù)，這些參數(shù)會(huì)改變等離子體的電子密度、帶電粒子和自由基的濃度以及UV光子的數(shù)量等理化性質(zhì)；此外，基質(zhì)組成和尺寸、水分活度、有機(jī)物等外部環(huán)境條件以及芽孢自身的性質(zhì)也是影響等離子體對(duì)芽孢滅活效果的重要因素[45]。

NTP滅活芽孢的影響因素總結(jié)如表2所示。

表2 NTP滅活芽孢的影響因素Table 2 Factors affecting the inactivation of spores by NTP

4.2 NTP滅活芽孢機(jī)制

迄今為止，NTP滅活芽孢細(xì)胞的確切機(jī)制仍不清楚，等離子體誘導(dǎo)的芽孢損傷是否會(huì)致其萌發(fā)尚無定論。近年來，研究集中于從等離子體對(duì)芽孢的外部結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部成分等不同靶點(diǎn)來探究NTP滅活芽孢的機(jī)理。

Raguse等[52]研究表明，等離子體作用于B. subtilis芽孢外膜、內(nèi)膜、芽孢衣等結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致芽孢滅活，通過原子力顯微鏡可以觀察到經(jīng)過等離子體處理后的芽孢表面粗糙度增加并產(chǎn)生裂紋，這可能是由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等自由基的作用以及離子轟擊與積累對(duì)這些芽孢結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵產(chǎn)生破壞[53]。而對(duì)于等離子體產(chǎn)生的UV光子，其主要作用靶點(diǎn)是位于芽孢核內(nèi)的DNA，DNA受UV輻射會(huì)產(chǎn)生對(duì)芽孢具有潛在致命危害的光產(chǎn)物胸腺嘧啶聚合物[54]。Roth等[55]發(fā)現(xiàn)，缺乏核苷酸切除修復(fù)和α/β型DNA結(jié)合SASPs的B. subtilis芽孢對(duì)NTP具有更高的敏感性，而缺乏芽孢光產(chǎn)物裂解酶DNA修復(fù)途徑芽孢的敏感性較低，因此可見，NTP是通過芽孢光產(chǎn)物形成以外的機(jī)制導(dǎo)致DNA損傷。此外，NTP對(duì)芽孢中的關(guān)鍵代謝蛋白（Ger A、Ger B和Ger K）、離子和DPA通道（SpoV）、其他萌發(fā)相關(guān)酶（如CLEs、CwlJ、SleB）[54,56]產(chǎn)生影響進(jìn)而導(dǎo)致芽孢失活。因此，等離子體滅活芽孢可分為兩個(gè)階段：在第一階段，NTP的UV光子、自由基或離子迅速滅活位于頂部的大多數(shù)芽孢；隨著等離子體粒子滲透得更深，到達(dá)滅活的第二階段，即芽孢外部結(jié)構(gòu)、DNA和蛋白質(zhì)逐漸受到活性物質(zhì)（如RNS、ROS和離子）的蝕刻作用，導(dǎo)致芽孢滅活[45]。

NTP對(duì)細(xì)菌芽孢具有優(yōu)越的滅活效果，在食品殺菌中具有廣闊前景，然而其誘導(dǎo)芽孢滅活的機(jī)制尚沒有得到完全闡述，NTP的殺菌效果與等離子體種類、參數(shù)設(shè)置以及環(huán)境因素等密切相關(guān)，這也增加了實(shí)際應(yīng)用和優(yōu)化加工條件的難度[57]。

5 UV技術(shù)

5.1 UV殺菌技術(shù)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

紫外光的波長位于100～400 nm范圍內(nèi)，包括UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）、UV-C（200～280 nm）、VUV（100～200 nm）。其中在食品工業(yè)中主要利用波長在200～280 nm范圍內(nèi)的UV-C進(jìn)行殺菌，UV輻射廣泛用于液體介質(zhì)食品的殺菌以及延長固體食品如新鮮產(chǎn)品、肉制品和蛋制品的貨架期[58]。一般稱UV及其鄰近可見光譜范圍與其他能量較低的輻射為非電離輻射，而X射線、γ射線以及電離粒子（β射線、α射線、質(zhì)子）等則為電離輻射，非電離輻射的吸收可以導(dǎo)致原子和分子產(chǎn)生激發(fā)電子[59]。

UV輻射對(duì)菌體細(xì)胞的殺菌機(jī)理主要是其可以產(chǎn)生大量能量使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞DNA中的嘧啶堿基形成二聚體，從而干擾DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[60]。然而，芽孢比營養(yǎng)細(xì)胞的UV抗性更強(qiáng)，有研究表明殺滅90%炭疽桿菌芽孢所需的UV強(qiáng)度為810 J/m2，而殺滅90%同一菌株?duì)I養(yǎng)細(xì)胞所需的UV強(qiáng)度為60 J/m2[61]；可見芽孢對(duì)UV輻射具有抗性，該抗性是由于部分芽孢可以在UV輻射損傷后進(jìn)行修復(fù)[62]，這種修復(fù)可能是由于光解酶可以與UV形成的二聚體結(jié)合，并利用從可見光中獲得的能量來逆轉(zhuǎn)二聚體的形成[63]。為了克服芽孢對(duì)UV的抗性和光解酶修復(fù)的現(xiàn)象，有研究利用準(zhǔn)分子UV激光照射來增強(qiáng)芽孢滅活效率[64]。此外，將UV處理與熱、H2O2等處理結(jié)合可以提高UV輻射對(duì)芽孢滅活的效果[65]。

UV輻射作為非熱殺菌技術(shù)，在液體食品的殺菌和固體食品貨架期的延長等方面具有重要應(yīng)用。然而，由于芽孢對(duì)UV輻射具有較強(qiáng)抗性以及光修復(fù)能力，選擇合適的UV輻射劑量和協(xié)同處理方法是應(yīng)用中需要重點(diǎn)關(guān)注的問題。此外，由于UV可通過各種有機(jī)光反應(yīng)在食品中產(chǎn)生自由基從而對(duì)食品品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，如蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)氧化、顏色變化、異味、營養(yǎng)物質(zhì)損失等[59]，在UV輻射應(yīng)用中應(yīng)選擇適宜的食品進(jìn)行處理以減少其品質(zhì)的降低。

5.2 UV滅活芽孢機(jī)制

UV主要通過對(duì)芽孢的外部結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞進(jìn)而滅活芽孢。Esbelin[66]研究了芽孢衣缺陷菌株、α、β型SASPs缺陷菌株與野生菌株的芽孢在320～1 770 mJ/cm2脈沖UV和25～150 mJ/cm2連續(xù)UV-C處理下的滅活情況，結(jié)果表明芽孢衣缺陷型菌株對(duì)脈沖UV的敏感性顯著高于野生型菌株，α和β型SASPs缺陷菌株芽孢對(duì)兩種處理的敏感性均高于野生型菌株，表明芽孢的外部結(jié)構(gòu)在保護(hù)芽孢抵抗UV中具有重要作用，而α、β型SASPs是芽孢進(jìn)行光修復(fù)的重要成分。此外，Warriner等[67]研究發(fā)現(xiàn)UV（27.10 J/mL）和溫和熱處理（60 ℃、3.58 min）協(xié)同作用可以將殺滅B. coagulan芽孢的數(shù)量提高2（lg（CFU/mL）），這表明UV處理可能導(dǎo)致芽孢的熱敏性增強(qiáng)從而提高芽孢滅活效果。

6 PEF技術(shù)

6.1 PEF殺菌技術(shù)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

PEF技術(shù)主要利用短周期脈沖電流滅活食品中的微生物[68]，PEF殺菌常用電路強(qiáng)度一般為15～100 kV/cm、脈沖1～100 kHz、放電頻率1～20Hz[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，PEF具有許多優(yōu)于巴氏殺菌的特點(diǎn)，但是PEF的應(yīng)用仍然僅限于液體產(chǎn)品中[69]，其對(duì)于半固體或固體產(chǎn)品滅菌的適用性尚未確定。PEF對(duì)食品品質(zhì)的影響較小，可以在保持食品營養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)滅活微生物營養(yǎng)細(xì)胞，但其滅活細(xì)菌芽孢的應(yīng)用相對(duì)較少[70]。為了有效滅活細(xì)菌芽孢，有研究將PEF與熱處理或抗菌化學(xué)提取物結(jié)合。據(jù)報(bào)道，PEF在195 kJ/kg下與133 ℃熱處理結(jié)合，B.subtilis芽孢殺滅芽孢數(shù)量可達(dá)4（lg（CFU/mL）），模型分析結(jié)果表明熱處理和PEF處理的殺滅芽孢數(shù)量分別為1.15（lg（CFU/mL））和3.2（lg（CFU/mL））[70]。此外，有研究表明抗菌化學(xué)提取物（如精油和多酚）與PEF協(xié)同作用對(duì)于芽孢桿菌屬芽孢有較好的滅活效果，如各種精油具有的活性成分可以作為萌發(fā)物與受體結(jié)合的屏障，抑制芽孢萌發(fā)，對(duì)B.subtilis芽孢抑制活性最高的是豆蔻精油，其殺滅芽孢數(shù)量約為3.12（lg（CFU/mL））[71]。

6.2 PEF滅活芽孢機(jī)制

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)PEF的研究相對(duì)比較成熟，對(duì)其殺菌機(jī)理提出了電崩解理論、電穿孔理論、臭氧效應(yīng)、黏彈極性形成模型等假說，其中電崩解理論和電穿孔理論更為廣大學(xué)者所接受[69]。電崩解理論是指外加電場強(qiáng)度可以增大細(xì)胞膜上的跨膜電位差，并且電位差隨著電場的增強(qiáng)不斷增大，細(xì)胞膜厚度減小，當(dāng)電位差達(dá)到臨界崩解電位差時(shí)細(xì)胞膜就會(huì)發(fā)生破裂穿孔[72]；而電穿孔理論是指PEF作用于微生物細(xì)胞膜會(huì)改變其脂肪和蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，使微生物細(xì)胞膜收縮形成小孔，隨著電場強(qiáng)度的增強(qiáng)，細(xì)胞膜形成大量小孔，細(xì)胞膜通透性增大，胞內(nèi)物質(zhì)泄漏進(jìn)而導(dǎo)致微生物失活[73]。

PEF滅活芽孢的機(jī)理主要與芽孢多層結(jié)構(gòu)在PEF處理下發(fā)生的變形有關(guān)（表3）。Barsotti等[74]研究表明，在電場強(qiáng)度為15 kV/cm、脈沖時(shí)間為5 s的脈沖作用下，鹽溶液中的B.atrophaeus芽孢表面形成多相分布的孔隙，由短周期脈沖引起的損傷可以在短期內(nèi)被封存，在此期間芽孢可以保持抗性并使PEF的滅活效率低下[75]；但是，如果脈沖持續(xù)時(shí)間較長，則其造成的損害是不可逆轉(zhuǎn)的[76]。此外，PEF處理效果受芽孢種類等因素的影響[77]，當(dāng)PEF處理B.atrophaeus時(shí)，芽孢具有明顯的孔隙，然而當(dāng)PEF處理芽孢桿菌屬其他芽孢時(shí)，芽孢數(shù)量并未顯著降低，這表明芽孢的萌發(fā)狀態(tài)及其種類會(huì)影響PEF的殺菌效果[78]。

表3 非熱殺菌技術(shù)滅活芽孢效果與機(jī)理Table 3 Mechanisms of action of non-thermal sterilization technologies in the inactivation of spores

7 其他非熱殺菌技術(shù)

電離輻射、超聲、臭氧處理等方法也是常用的非熱殺菌技術(shù)。朱軍等[79]研究發(fā)現(xiàn)利用60Co γ射線可以殺滅核桃粉中的微生物，當(dāng)控制適宜的輻射殺菌劑量（8～9 kGy）時(shí)，輻射在不影響核桃粉品質(zhì)的同時(shí)對(duì)核桃粉中的菌落總數(shù)、耐熱芽孢和耐熱桿菌芽孢等都具有很好的殺滅效果；超聲處理常常作為其他殺菌技術(shù)的輔助處理方法，例如超聲輔助加熱[80]、超高壓協(xié)同聲熱[81]、超聲協(xié)同表面活性劑[82]等，這些協(xié)同殺菌技術(shù)可提高獨(dú)立超聲處理的殺菌效果；臭氧溶液可以對(duì)B.subtilis芽孢產(chǎn)生一定損傷，其機(jī)理可能是臭氧可破壞芽孢的內(nèi)膜[83]。此外，使用化學(xué)試劑（環(huán)氧乙烷、二氧化氯等）也是具有良好滅活芽孢效果的方法之一，但在使用時(shí)應(yīng)考慮其在具體加工環(huán)境的使用劑量及其對(duì)食品的影響[84]。

8 結(jié) 語

細(xì)菌芽孢的滅活是當(dāng)前食品工業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)，近年來出現(xiàn)了大量滅活芽孢的非熱殺菌技術(shù)，這些技術(shù)在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行，避免了高溫對(duì)食品品質(zhì)的不良影響，其中研究相對(duì)成熟的主要有HHP技術(shù)、HPCD技術(shù)、NTP技術(shù)、UV技術(shù)以及PEF技術(shù)。

HHP不僅可以導(dǎo)致芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)的改變，還可以誘導(dǎo)芽孢萌芽降低其抗性以獲得更好的滅活效果，但HHP對(duì)設(shè)備的要求較高，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中具有一定局限性。HPCD滅活芽孢的機(jī)制尚有爭議，目前認(rèn)為HPCD主要破壞芽孢結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致滅活，單獨(dú)處理對(duì)芽孢的滅活效果不佳時(shí)可與其他殺菌方式相結(jié)合以優(yōu)化HPCD滅活效果。NTP技術(shù)具有溫度低、速度快、能耗低、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，自由基、離子以及UV光子等各種活性成分的積累和滲透可對(duì)芽孢外部結(jié)構(gòu)和DNA、蛋白質(zhì)等內(nèi)部成分產(chǎn)生破壞，然而目前NTP技術(shù)主要作用于物料表面，處理不規(guī)則食品時(shí)需要提高其殺菌均勻性。UV技術(shù)在食品的殺菌和貨架期延長等具有重要應(yīng)用，但應(yīng)用UV技術(shù)需考慮其對(duì)食品品質(zhì)的不良影響。

此外，由于部分非熱殺菌技術(shù)滅活芽孢的程度有限，滅活機(jī)理尚未得到完全闡明，且獲得的結(jié)果變化很大，嚴(yán)重阻礙其在食品工業(yè)中的應(yīng)用；因此非熱殺菌技術(shù)對(duì)芽孢滅活的影響因素及其機(jī)理是未來研究的重要內(nèi)容。此外，從現(xiàn)有殺菌技術(shù)的協(xié)同滅活芽孢的效果來看，誘導(dǎo)萌發(fā)和滅活技術(shù)相結(jié)合是保持食品新鮮品質(zhì)和保護(hù)食品免受芽孢桿菌侵染的有效途徑，柵欄技術(shù)是具有前景的芽孢滅活方法。