王文娟，蔡小芳，唐 潔，張喜榮，封 棣*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

食品接觸材料（food contact materials，F(xiàn)CM）中的有意添加物（intentionally added substance，IAS）（如單體添加劑、聚合物生產(chǎn)助劑等）以及非有意添加物（non intentionally added substance，NIAS）（如反應(yīng)產(chǎn)物、分解產(chǎn)物等）可能會(huì)在與食品接觸過(guò)程中遷移至食品，從而對(duì)人體健康造成潛在風(fēng)險(xiǎn)[1]?；瘜W(xué)分析測(cè)試是FCM化學(xué)遷移安全性評(píng)價(jià)中的重要組成部分，主要有2 種方式：一種是常規(guī)的符合性測(cè)試，是對(duì)IAS遷移物進(jìn)行有目標(biāo)地分析，產(chǎn)品除了要求使用成分必須列于歐盟相關(guān)法規(guī)的肯定清單中，還必須證明產(chǎn)品符合總遷移、特定遷移以及殘留限量的要求；另一種是對(duì)NIAS的無(wú)預(yù)期目標(biāo)物的測(cè)試[2]。一直以來(lái)，對(duì)NIAS的識(shí)別和量化非常困難，且耗時(shí)長(zhǎng)，是FCM化學(xué)遷移的安全評(píng)價(jià)所面臨的一大挑戰(zhàn)。近年來(lái)，隨著高靈敏、高分辨質(zhì)譜與高效分離色譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，以及高效多樣的樣品前處理技術(shù)的應(yīng)用，使得FCM中的化學(xué)遷移物（揮發(fā)性、中等揮發(fā)性以及難揮發(fā)性物質(zhì)）可以得到較全面地分析[3-9]。Bengtstr?m等[3]利用氣相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜和超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)顯示出芳香烴受體活性的回收比薩盒的提取液進(jìn)行了全面地非靶標(biāo)物質(zhì)初步鑒定；本實(shí)驗(yàn)室使用吹掃捕集[4-5]、固相微萃取[4,6-7]、超聲萃取技術(shù)[7]等前處理技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)食品接觸硅橡膠制品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析。但是由于FCM組成復(fù)雜，其對(duì)遷移物的分析不可能是完整詳盡的，也無(wú)法評(píng)價(jià)FCM化學(xué)遷移的整體安全性。

體外生物測(cè)定法是利用酵母、細(xì)菌或細(xì)胞等進(jìn)行的生物體外短期毒性實(shí)驗(yàn)，可有效針對(duì)生物體某一特異性效應(yīng)，評(píng)價(jià)測(cè)試物的危害性以及探索其毒性作用機(jī)制，符合動(dòng)物福利指導(dǎo)準(zhǔn)則3R原則（減少（reduce）、優(yōu)化（refine）和代替（replace）），是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的傳統(tǒng)替代技術(shù)[10-11]，具有成本低、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。歐洲議會(huì)發(fā)表在2016年10月的2015/2259/（INI）[12]報(bào)告提出：應(yīng)鼓勵(lì)將生物測(cè)試作為一種可選的預(yù)警措施，以確?；瘜W(xué)成分復(fù)雜FCM的安全性，并用于開(kāi)發(fā)FCM化學(xué)分析和毒理測(cè)試的研究。體外生物測(cè)定法可以檢測(cè)出不能通過(guò)化學(xué)分析或定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）預(yù)測(cè)的FCM的潛在毒性，能夠提供FCM化學(xué)遷移（混合物）的實(shí)際危險(xiǎn)和質(zhì)量評(píng)估的綜合信息[13]。目前，對(duì)FCM的體外生物測(cè)定主要集中在細(xì)胞毒性[14-15]、遺傳毒性[16-17]和內(nèi)分泌干擾[18-20]這3 類毒性終點(diǎn)，近年來(lái)已被應(yīng)用于塑料[14]、紙質(zhì)[21-23]、罐頭涂層[24]、納米材料[16]等FCM中化學(xué)遷移物的毒性評(píng)價(jià)。

1 細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性物質(zhì)通過(guò)干擾細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，破壞細(xì)胞完整性或細(xì)胞基礎(chǔ)功能，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡[13]。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用體外方法，以生物學(xué)性狀基本相同的細(xì)胞系（或株）為對(duì)象，避免了活體動(dòng)物的使用及其個(gè)體差異，操作簡(jiǎn)單；檢測(cè)終點(diǎn)靈敏度高，可以在細(xì)胞存活狀態(tài)下，觀察細(xì)胞毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的影響，分析作用機(jī)理和劑量-效應(yīng)關(guān)系。依據(jù)不同的檢測(cè)終點(diǎn)，細(xì)胞毒性檢測(cè)有多種方法。

1.1 細(xì)胞通透性的改變

細(xì)胞通透性的改變是常見(jiàn)的細(xì)胞毒性終點(diǎn)之一[13]。它的原理是將細(xì)胞暴露于待測(cè)物中，向其中加入實(shí)驗(yàn)所用染料并進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)染料對(duì)細(xì)胞的作用或者染料進(jìn)入細(xì)胞的情況，檢測(cè)細(xì)胞活力或者間接判斷細(xì)胞膜通透性的改變情況，獲得關(guān)于細(xì)胞通透性損傷的信息。最常用的檢測(cè)方法是中性紅攝入（neutral red uptake，NRU）實(shí)驗(yàn)。NRU實(shí)驗(yàn)是基于細(xì)胞對(duì)中性紅的攝入能力來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性的方法?；罴?xì)胞可以攝入中性紅，并在溶酶體中積累；當(dāng)細(xì)胞增殖加快，數(shù)量增多時(shí)，中性紅攝入量增加；當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，中性紅攝入量下降，通過(guò)檢測(cè)中性紅攝入量可以確定其對(duì)細(xì)胞的影響情況。

1.2 細(xì)胞增殖的破壞

細(xì)胞增殖的破壞也是常見(jiàn)的細(xì)胞毒性終點(diǎn)之一，它的原理是毒性物質(zhì)發(fā)揮作用殺死細(xì)胞或阻斷細(xì)胞周期，從而減少整個(gè)群體的增殖。檢測(cè)方法除了生化方法，如細(xì)胞中總蛋白質(zhì)含量（total protein content，TPC）測(cè)定實(shí)驗(yàn)和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）摻入實(shí)驗(yàn)[25]之外，還有細(xì)胞計(jì)數(shù)法和噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）或衍生物（MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt）、WST-1（4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate tetrazolium salt））實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)是利用顯色劑MTT檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。MTT能被活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶還原，成為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，并沉積在細(xì)胞內(nèi)；而死細(xì)胞則沒(méi)有這種功能。

1.3 RNA合成的抑制

RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)是將氚標(biāo)記的尿苷加入處理后的細(xì)胞RNA中，測(cè)量RNA合成動(dòng)力學(xué)，如果與陰性對(duì)照相比RNA合成的動(dòng)力降低30%或更多，則認(rèn)為待測(cè)物具有細(xì)胞毒性。RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)可靠、靈敏、重現(xiàn)性好。Riquet等[14]采用RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)研究分別由抗氧化劑Irgafos 168、抗氧化劑Irganox 1076和紫外線吸收劑Tinuvin 326制備的聚丙烯（polypropylene，PP）薄膜的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，在薄膜的模擬使用環(huán)境（微波和電子束）下，只有Irgafos 168制備的PP薄膜提取物在RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)中顯示出強(qiáng)細(xì)胞毒性。

1.4 測(cè)試方法的聯(lián)用

近20 年來(lái)用于評(píng)估FCM提取物細(xì)胞毒性的測(cè)定方法、原理及應(yīng)用總結(jié)如表1所示。

表1 近20 年來(lái)FCM提取物的細(xì)胞毒性生物測(cè)定方法Table 1 Cytotoxic bioassays for FCM extracts published in the literature in the last 20 years

由于每種測(cè)試方法指示的毒性途徑不同，研究人員將幾種測(cè)試方法聯(lián)用從而獲得更多的毒性信息。Maisanaba等[15]采用NRU、MTS實(shí)驗(yàn)對(duì)2 種用于FCM的硅烷改性黏土礦物進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，在選擇的質(zhì)量濃度范圍（0～250 μg/mL）內(nèi)，一種樣品在NRU和MTS實(shí)驗(yàn)中均無(wú)細(xì)胞毒性；而另一種樣品在2 種實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性。Mittag等[24]采用4 種測(cè)定方法（BrdU-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、WST-1、NRU、RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)）以及4 種細(xì)胞系（人宮頸癌細(xì)胞Hela-S3、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人肝癌細(xì)胞HepG2），評(píng)估2 種罐涂料（聚酯樹(shù)脂和環(huán)氧樹(shù)脂）95%乙醇遷移液的細(xì)胞毒性，最終不同方法顯示的細(xì)胞毒性結(jié)果也不同。相同的是，2 種罐涂料均對(duì)Caco-2細(xì)胞顯示出細(xì)胞毒性作用，但僅有環(huán)氧樹(shù)脂涂料對(duì)HepG2細(xì)胞顯示出顯著的細(xì)胞毒性。Maisanaba等[16]采用MTS、NRU、TPC方法分別研究了含有2 種改性黏土的聚乳酸（polylactic acid，PLA）納米復(fù)合材料的提取物對(duì)Caco-2和HepG2細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。在不同的細(xì)胞和暴露時(shí)間（24、48 h）條件下，3 種測(cè)試方法的結(jié)果均為陰性。Bradley等[21]用NRU、TPC和RNA合成抑制實(shí)驗(yàn)，在人喉癌上皮細(xì)胞系Hep-2、小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1c1c7、HepG2和HeLa細(xì)胞系中研究了19 份食品接觸紙或紙板的熱水、冷水、95%乙醇和Tenax提取物的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示水或Tenax提取物呈陰性，4 份樣品的95%乙醇提取液呈陽(yáng)性。Maisanaba等[26]使用Caco-2細(xì)胞系對(duì)暴露24 h和48 h后的2 種硅烷改性黏土進(jìn)行NRU和MTS實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示暴露24 h和48 h后2 種樣本均呈陰性。

2 遺傳毒性

遺傳毒性是指DNA在染色體水平、分子水平和堿基水平上受到各種損傷，從而造成基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量改變的毒性作用，可能引起癌癥、遺傳疾病和先天性缺陷。

2.1 致突變

致突變最常用的是鼠傷寒沙門氏菌/組氨酸回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)（Ames實(shí)驗(yàn)）。Ames實(shí)驗(yàn)需要在4 種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)菌株（鼠傷寒沙門菌TA98、TA97、TA100、TA102）上進(jìn)行，并分別進(jìn)行不加及加代謝活化系統(tǒng)（S9混合物）的檢測(cè)，是應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)基因突變的體外實(shí)驗(yàn)。其原理是檢測(cè)待測(cè)物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌/組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（his－）回復(fù)突變成野生型（his+）的能力。根據(jù)選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落數(shù)目，與對(duì)照組自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)目相比較，來(lái)測(cè)定化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)微生物基因突變的能力。該方法具有靈敏度高、檢出率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。Ames II實(shí)驗(yàn)作為Ames實(shí)驗(yàn)的一種有效替代方法，使用2 種菌株（TA98和混合菌株TA7001-7006）即可進(jìn)行檢驗(yàn)，其對(duì)誘變劑敏感性更強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性更好，實(shí)驗(yàn)室間差異小[27]。

Maisanaba等[16]用Ames實(shí)驗(yàn)評(píng)估了2 種PLA納米復(fù)合材料提取物的致突變性，結(jié)果為陰性。Mittag等[24]使用Ames II實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了2 種罐涂料（聚酯纖維和環(huán)氧樹(shù)脂）的95%乙醇提取液，結(jié)果均為陰性，但是該研究沒(méi)有添加外源代謝系統(tǒng)（S9混合物），因此可能產(chǎn)生假陰性數(shù)據(jù)。徐峰等[28]對(duì)二氧化碳基塑料進(jìn)行了Ames實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性，表明該材料沒(méi)有致突變性。

2.2 DNA原始損傷

2.2.1 彗星實(shí)驗(yàn)（Comet實(shí)驗(yàn)）

Comet實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)的實(shí)驗(yàn)。它可以檢測(cè)到DNA單、雙鏈斷裂，堿基活性損傷以及DNA修復(fù)期間產(chǎn)生的DNA鏈斷裂。在Comet實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞DNA受到損傷產(chǎn)生鏈斷裂，其碎片進(jìn)入凝膠中，在凝膠電泳時(shí)碎片離開(kāi)核DNA形成尾狀帶，未損傷的DNA部分保持球形。Comet實(shí)驗(yàn)具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏的特點(diǎn)，少量細(xì)胞就可以分析，無(wú)需放射性標(biāo)記，適用于任何可制成單細(xì)胞懸液的真核細(xì)胞，而且適用范圍廣、敏感性高。

Ozaki等[22]利用人早幼粒急性白血病細(xì)胞系HL-60進(jìn)行了Comet實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 份紙板樣品中有6 份呈顯著陽(yáng)性。蔡亞云等[29]用Comet實(shí)驗(yàn)研究了不同粒徑（10 nm～1 μm）的聚苯乙烯（polystyrene，PS）塑料顆粒對(duì)斑馬魚腮細(xì)胞的毒性影響，結(jié)果呈陽(yáng)性。Riquet等[14]使用Comet實(shí)驗(yàn)研究分別由抗氧化劑Irgafos 168、Irganox 1076和紫外線吸收劑Tinuvin 326制備的PP薄膜的遺傳毒性，12 種提取物的測(cè)試結(jié)果全部為陰性。Maisanaba等[26]使用Caco-2細(xì)胞系對(duì)暴露24 h和48 h后的2 種硅烷改性黏土進(jìn)行Comet實(shí)驗(yàn)以評(píng)估其遺傳毒性，結(jié)果均呈陰性。

2.2.2 BlueScreen HC測(cè)定法

BlueScreen HC測(cè)定法是基于人體細(xì)胞報(bào)告基因的一種檢測(cè)方法，專為高通量篩選化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性而設(shè)計(jì)。其原理是利用Gaussia熒光素酶，檢測(cè)經(jīng)基因修飾的包含GADD-45a啟動(dòng)子的人類淋巴母細(xì)胞TK6。目前已經(jīng)在藥物制劑和香精香料等領(lǐng)域驗(yàn)證了該方法的可行性[30]。Koster等[31]利用該法（加或不加S9混合物）檢測(cè)了3 種紙板提取物的遺傳毒性，結(jié)果為陰性。

2.3 染色體和染色體組畸變

2.3.1 微核實(shí)驗(yàn)

微核（micronuclei，MN）實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)位于人類或嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系間期細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的MN，從而有效檢測(cè)致癌物和致敏物?？捎糜贛N實(shí)驗(yàn)的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞有骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。

2.3.2 姐妹染色單體交換實(shí)驗(yàn)

姐妹染色單體交換（sister chromatid exchange，SCE）實(shí)驗(yàn)是用于檢測(cè)雙染色體姐妹染色單體之間DNA相互交換的生物測(cè)定法。SCE實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)核心是差異地標(biāo)記姊妹染色單體，即利用BrdU摻入DNA分子中觀察姐妹染色單體，觀察不同數(shù)量胸腺嘧啶核苷組成的染色體區(qū)域[32]。Ergene等[33]在人類血液淋巴細(xì)胞上進(jìn)行SCE實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估多種聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）瓶裝飲用水的遺傳毒性，結(jié)果均為陰性。

2.3.3 染色體畸變實(shí)驗(yàn)

染色體畸變（chromosome aberration，CA）實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)影響染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的基本方法，其原理是將哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于待測(cè)物中，在暴露后的預(yù)定時(shí)間間隔內(nèi)，用中期停滯物質(zhì)（秋水仙堿）處理細(xì)胞，收集細(xì)胞并染色，用顯微鏡分析以檢查CA情況。

2.4 測(cè)試方法的聯(lián)用

由于每種測(cè)試方法指示的毒性途徑不同，研究人員將幾種測(cè)試方法聯(lián)用從而獲得更多的遺傳毒性信息。Nakai等[34]利用Ames實(shí)驗(yàn)和CA實(shí)驗(yàn)（中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL/IU）評(píng)估了與食品接觸PS材料中丙酮提取物的遺傳毒性，測(cè)試結(jié)果均為陰性。Bach等[17]采用Ames實(shí)驗(yàn)和MN實(shí)驗(yàn)（HepG2細(xì)胞）測(cè)試暴露在陽(yáng)光或高溫條件下PET瓶裝飲用水提取物的遺傳毒性，結(jié)果均為陰性。Maisanaba等[15]采用Ames和Comet實(shí)驗(yàn)對(duì)2 種用于FCM的硅烷改性黏土礦物進(jìn)行評(píng)價(jià)，一種樣品在2 種實(shí)驗(yàn)中均為陰性，另一種樣品則在2 種實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的DNA氧化損傷。Bradley等[21]用Ames實(shí)驗(yàn)和Comet實(shí)驗(yàn)對(duì)用不同提取物（熱水、冷水、95%乙醇、Tenax）提取的19 份食品接觸紙或紙板以及1 份非食品接觸紙板進(jìn)行研究。Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20 份樣品的乙醇提取物中有1 份呈陽(yáng)性，Comet實(shí)驗(yàn)中水或Tenax提取物呈陰性。Lionti等[35]用Ames實(shí)驗(yàn)和MN實(shí)驗(yàn)研究3 種用于合成食品接觸涂料常見(jiàn)前體的遺傳毒性，包括原硅酸四乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS）、甲基三乙氧基硅烷（methyltriethoxysilane，MTES）和3-縮水甘油氧基丙基三乙氧基硅烷（3-glycidyloxypropyltriethoxysilane，GPTES）。Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加或不加S9混合物的情況下，TEOS和MTES均無(wú)致突變性，GPTES在TA100和TA1535菌株中觀察到陽(yáng)性反應(yīng)；MN實(shí)驗(yàn)中，3 種樣本全部呈陰性。Séverin等[36]采用Ames實(shí)驗(yàn)和MN實(shí)驗(yàn)評(píng)估聚碳酸酯上2 種溶膠-凝膠涂料的體外遺傳毒性，結(jié)果均為陰性。Souton等[37]通過(guò)Comet實(shí)驗(yàn)和MN實(shí)驗(yàn)研究回收紙板起始和最終產(chǎn)品的遷移物在人肝癌細(xì)胞（HepG2/HepaRG）上誘導(dǎo)的遺傳毒性，結(jié)果呈陽(yáng)性，此外，F(xiàn)CM起始物表現(xiàn)出的DNA損傷可能會(huì)得到進(jìn)一步的修復(fù)，而最終產(chǎn)品可能會(huì)將DNA損傷轉(zhuǎn)化為染色體突變，從而證實(shí)了評(píng)價(jià)最終產(chǎn)品提取物危害的重要性。

近20 年來(lái)用于評(píng)估FCM提取物遺傳毒性的生物測(cè)定方法、原理總結(jié)見(jiàn)表2。

表2 近20 年來(lái)FCM提取物遺傳毒性的生物測(cè)定方法Table 2 Genetic toxicity bioassays for FCM extracts published in the literature in the past 20 years

3 內(nèi)分泌干擾效應(yīng)

內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）主要包括性激素（雌/雄/孕激素）干擾物、腎上腺皮質(zhì)激素（糖/鹽皮質(zhì)激素）干擾物等，可通過(guò)干擾人體內(nèi)天然激素的活動(dòng)過(guò)程從而對(duì)生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等功能產(chǎn)生影響。EDCs可以與人體和動(dòng)物體內(nèi)特定的激素受體結(jié)合，從而干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。研究發(fā)現(xiàn)從食品包裝遷移到食品中的化學(xué)物質(zhì)（如雙酚A（bisphenol A，BPA）、鄰苯二甲酸鹽）會(huì)導(dǎo)致EDCs對(duì)人體的入口暴露[38-39]，因此內(nèi)分泌干擾逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究人員高度關(guān)注的問(wèn)題，也是評(píng)估FCM安全性的一個(gè)重要毒性終點(diǎn)。FCM內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的測(cè)試方法主要有人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（E-Screen實(shí)驗(yàn)）和報(bào)告基因測(cè)試法。

3.1 E-Screen實(shí)驗(yàn)

E-Screen實(shí)驗(yàn)的原理是雌激素活性物質(zhì)可以與雌激素受體（estrogen receptor，ERs）結(jié)合并刺激ER+細(xì)胞增殖，因其簡(jiǎn)單易行而被廣泛應(yīng)用于雌激素活性物質(zhì)的篩選。實(shí)驗(yàn)比較在不存在雌激素（陰性對(duì)照）、存在17β-雌二醇（陽(yáng)性對(duì)照）、存在待測(cè)物的情況下，接種MCF-7細(xì)胞所獲得的細(xì)胞數(shù)量。Wagner等[18]利用E-Screen實(shí)驗(yàn)分析18 種包裝在玻璃瓶或PET瓶中的礦泉水，結(jié)果18 份樣品中的11 份樣品檢測(cè)到雌激素活性。武宗高等[40]利用該法檢測(cè)3 種增塑劑鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、BPA和壬基酚（nonyl phenol，NP）的雌激素活性及其聯(lián)合效應(yīng)，結(jié)果表明DBP、BPA和NP均能夠促使細(xì)胞進(jìn)入S期（DNA合成期），顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖，具有雌激素活性。Lopez-Espinosa等[23]檢測(cè)40 種紙或紙板乙醇提取物的雌激素活性，結(jié)果90%樣品的提取物呈陽(yáng)性。

3.2 報(bào)告基因測(cè)試

3.2.1 酵母菌雌（雄）激素篩選實(shí)驗(yàn)

在酵母菌雌（雄）激素篩選（yeast estrogen screen，YES）/（yeast androgen screen，YAS）測(cè)定中，酵母菌株含有穩(wěn)定整合的人類雌（雄）激素受體（hERα/hAR）基因和受雌（雄）激素反應(yīng)元件（ERE/ARE）控制的含有l(wèi)acZ報(bào)告基因（編碼β-半乳糖苷酶）的表達(dá)質(zhì)粒。酵母中的雌（雄）激素受體基因被雌（雄）激素活性物質(zhì)激活，在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和合成過(guò)程中，報(bào)告基因也同時(shí)被激活，編碼β-半乳糖苷酶的基因表達(dá)并轉(zhuǎn)錄生成β-半乳糖苷酶，通過(guò)測(cè)定其活性來(lái)定量出待測(cè)物的類雌（雄）激素活性。它可以檢測(cè)雌（雄）激素活性（YES/YAS）及抗雌（雄）激素（YAES/YAAS）活性。該實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是原理簡(jiǎn)單、易于操作、費(fèi)用低廉，且酵母不具有內(nèi)源性受體，不存在核受體干擾現(xiàn)象。

G u a r t等[19]使用YA E S/YA A S分析方法研究Tritan? BPA替代樹(shù)脂和聚碳酸酯的遷移。在40 ℃水中放置10 d后，檢測(cè)結(jié)果為陰性。Wagner等[41]使用YES檢測(cè)法分析20 種包裝在玻璃瓶或PET瓶中的礦泉水，結(jié)果60%的樣品檢測(cè)出雌激素活性。此后，Wagner等[42]又用YAES和YAAS分析18 種瓶裝水的抗雌激素活性和抗雄激素活性，結(jié)果表明，13 種樣品有抗雌激素活性，16 種樣品有抗雄激素活性。Kirchnawy等[43]對(duì)不同食品包裝用塑料的提取物進(jìn)行研究，首先使用YES實(shí)驗(yàn)分析了PET、PP、聚乙烯（polyethylene，PE）、PS和復(fù)合薄膜提取物的雌激素效應(yīng)，結(jié)果顯示42 個(gè)樣品中有7 個(gè)樣品出現(xiàn)雌激素受體陽(yáng)性，11 種PET樣品的雌激素活性均為陰性；然后使用YES、YAS并結(jié)合化學(xué)分析（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）對(duì)樣品中的雌激素和雄激素活性物質(zhì)進(jìn)行了表征，結(jié)果表明，18 個(gè)樣品中的4 個(gè)樣品在YES測(cè)定中顯示雌激素活性。Mertl等[44]研究3 種食物接觸紙板的提取物，其中2 種在YAAS中顯示出抗雄性激素活性。

3.2.2 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

熒光素酶是生物體內(nèi)催化熒光素或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，可分為螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是以熒光素為底物，靠酶和底物的相互反應(yīng)發(fā)光，通過(guò)熒光測(cè)定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀或液閃測(cè)定儀檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性的實(shí)驗(yàn)。這一實(shí)驗(yàn)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)。

Bach等[17,45]使用HepG2細(xì)胞系和人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB453-kb2研究了暴露于陽(yáng)光（2、6、10 d）和高溫（40、50、60 ℃）下PET瓶裝水及玻璃瓶裝水的雌激素活性和抗雄激素活性，結(jié)果均為陰性。Plotan等[20]利用報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)合固相萃取技術(shù)，研究了14 個(gè)品牌（共42 份樣品）瓶裝礦泉水的內(nèi)分泌干擾能力，結(jié)果在78%的樣本中發(fā)現(xiàn)雌激素受體（ER）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）活性。Maggioni等[46]使用Hela細(xì)胞分析了在意大利市場(chǎng)購(gòu)買的5 種PET瓶裝礦泉水的雌激素受體活性，結(jié)果為陰性。Chevolleau等[47]使用Hela細(xì)胞系研究7 種PET瓶裝水和4 種玻璃瓶裝水的多種激素活性（ER、AR、PR、GR、甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）），結(jié)果為陰性。Séverin等[36]使用HepG2細(xì)胞系通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè)評(píng)估聚碳酸酯上2 種溶膠-凝膠涂料的雌激素活性，結(jié)果為陰性。Veyrand等[48]使用人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS對(duì)PS/PE塑料杯中抗氧化劑亞磷酸三壬基酚酯（tris(nonylphenyl) phosphite，TNPP）的降解產(chǎn)物4-壬基酚（4-nonyl phenol，4-NP）進(jìn)行雌激素活性和抗雄激素活性，結(jié)果均為陽(yáng)性。Rosenmai等[49]在人卵巢腺癌細(xì)胞系BG1Luc4E2、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系A(chǔ)TCC、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH-3T3、大鼠肝癌細(xì)胞H4IIE和U2OS細(xì)胞系中，對(duì)20 個(gè)食品接觸類紙和紙板進(jìn)行8 種報(bào)告基因（AR、ER、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、過(guò)氧化酶增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、GR、視黃酸受體（retinoic acid receptor，RAR）、核轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2，Nrf2）和腫瘤抑制基因53（transformation-related protein 53，p53））測(cè)定，結(jié)果顯示，20 種樣本中11 種具有AR活性和抗AhR活性，9 種具有ER活性，12 種具有PPARγ活性，16 種具有Nrf2活性，6 種具有p53活性，但是20 種樣本對(duì)RAR和GR受體均為陰性。

3.3 測(cè)試方法的聯(lián)用

表3 FCM內(nèi)分泌干擾性的生物測(cè)定Table 3 ndocrine disruption bioassays for FCM extracts

表3 FCM內(nèi)分泌干擾性的生物測(cè)定Table 3 ndocrine disruption bioassays for FCM extracts

檢測(cè)方法 FCM 提取物 菌株/細(xì)胞 結(jié)果 參考文獻(xiàn)PET/玻璃 水 MCF-7細(xì)胞陽(yáng)性（23/29樣本雌激素活性）陽(yáng)性（11/29樣本抗雌激素活性）陽(yáng)性（8/29樣本雄激素活性）陽(yáng)性（12/29樣本抗雄激素活性）[50]E-Screen PET/玻璃 水 MCF-7細(xì)胞 陽(yáng)性（11/18樣本雌激素活性） [18]BPA替代樹(shù)脂（PS/TritanTM） 乙醇 MCF-7細(xì)胞 不同（不同聚合物、包裝和過(guò)程） [51]DBP/BPA/NP DMSO MCF-7細(xì)胞 陽(yáng)性（雌激素活性） [40]紙/紙板 乙醇 MCF-7細(xì)胞 陽(yáng)性（36/40樣本雌激素活性） [23]PET/PP/PE/PS/復(fù)合薄膜/紙板 DMSO 重組酵母菌株陽(yáng)性（4/18樣本雌激素活性）陰性（雄激素活性)陽(yáng)性（大多數(shù)樣本拮抗活性）[43]報(bào)告基因檢測(cè)酵母YAES/YAAS奶制品紙盒 DMSO 重組酵母菌株 陽(yáng)性（2/3樣本抗雄激素活性） [44]PET/PP/PE/PS/復(fù)合薄膜 乙醇 重組酵母菌株 陽(yáng)性（7/42樣本雌激素活性） [43]Tritan TM/聚碳酸酯 水 重組酵母菌株 陰性（2/2樣本（抗）雌激素和（抗）雄激素活性） [19]PET/玻璃（YES） 水 重組酵母菌株 陽(yáng)性（12/20樣本雌激素活性） [41]PET（YAES/YAAS） 水 重組酵母菌株 陽(yáng)性（13/18樣本抗雌激素活性）陽(yáng)性（16/18樣本抗雄激素活性） [42]PET/玻璃 水 PALM細(xì)胞 陽(yáng)性（8/29樣本雄激素活性）陽(yáng)性（12/29樣本抗雄激素活性） [50]（PS/TritanTM） 乙醇 大鼠肝癌細(xì)胞（H4IIE） 陽(yáng)性（雌激素活性） [51]BPA替代樹(shù)脂PET 水 MDA-kb2/HepG2細(xì)胞 陰性（抗雄激素和雌激素活性） [17, 45]PET 水 MCF-7/T47D細(xì)胞[20]熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)陽(yáng)性（16/42樣本雌激素活性）陽(yáng)性（16/42樣本雄激素活性）陽(yáng)性（12/42樣本抗雄激素活性）陽(yáng)性（15/42樣本孕激素活性）陽(yáng)性（23/42樣本糖皮質(zhì)激素活性）PET 水 HeLa細(xì)胞 陰性（5/5樣本雌激素活性） [46]PET/玻璃 水 HeLa細(xì)胞 陰性(11/11樣本類雌（雄）激素活性） [47]PS/PE DMSO U2OS細(xì)胞 陽(yáng)性 [48]食品接觸紙/紙板 DMSO ATCC細(xì)胞（AR）H4IIE細(xì)胞（AhR）BG1Luc4E2細(xì)胞（ER）NIH-3T3細(xì)胞（PPARγ）U2OS細(xì)胞（GR/RAR/Nrf2/p53）11/20樣本AR陽(yáng)性；11/20樣本抗AhR陽(yáng)性；9/20樣本ER陽(yáng)性；12/20樣本PPARγ陽(yáng)性；16/20樣本Nrf2陽(yáng)性；6/20樣本p53陽(yáng)性）20/20樣本RAR和GR陰性[49]溶膠-凝膠涂料 乙醇 HepG2細(xì)胞 陰性（2/2樣本雌激素活性） [36]

Real等[50]應(yīng)用E-Screen實(shí)驗(yàn)和人前列腺癌細(xì)胞PALM的螢光素酶測(cè)定法調(diào)查了西班牙南部市售的29 種飲用水（PET及玻璃瓶包裝）的激素活性（雌激素、雄激素激動(dòng)劑和拮抗劑作用）。E-Screen實(shí)驗(yàn)證明了所有樣品中都含有至少一種激素活性；PALM細(xì)胞螢光素酶實(shí)驗(yàn)中，29 個(gè)樣品中8 個(gè)顯示雄激素受體活性，12 個(gè)樣品為抗雄激素受體活性。Bittner等[51]采用E-Screen實(shí)驗(yàn)和報(bào)告基因測(cè)試對(duì)14 種熱塑性樹(shù)脂的提取物（10%、50%、100%乙醇和鹽水）進(jìn)行研究，結(jié)果表明，3 種TritanTM樹(shù)脂在鹽水提取后表現(xiàn)出顯著的ER活性。近年來(lái)用于評(píng)估FCM內(nèi)分泌干擾性的生物測(cè)定方法、原理及應(yīng)用總結(jié)見(jiàn)表3。

4 結(jié) 語(yǔ)

體外生物測(cè)定法可以針對(duì)特定的毒理學(xué)終點(diǎn)進(jìn)行研究，具有敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)。目前針對(duì)FCM危害的體外生物測(cè)定的研究主要集中在FCM提取物的細(xì)胞毒性、遺傳毒性和內(nèi)分泌干擾性方面。體外生物測(cè)定法可以檢測(cè)出不能通過(guò)化學(xué)分析或QSAR預(yù)測(cè)的潛在毒性（特別是NIAS），由于包含了“雞尾酒效應(yīng)”（由于累加效果甚至協(xié)同效應(yīng)，使得混合化學(xué)品的毒性超過(guò)各自單獨(dú)效應(yīng)的總和），它能夠提供FCM提取物的實(shí)際危險(xiǎn)和質(zhì)量評(píng)估的綜合信息，還可與化學(xué)分析結(jié)合，共同應(yīng)用于FCM的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)FCM安全性評(píng)價(jià)的體外生物測(cè)定的相關(guān)研究極少。鑒于體外生物分析方法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)與快速篩選能力，建議深入研究并推廣其在FCM安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用，并探索評(píng)價(jià)方法的標(biāo)準(zhǔn)化，積極推進(jìn)通用、快速、有效的FCM安全性評(píng)估生物測(cè)定方法體系的建立。