張賢益,宋也好,李 露,尹術華,付王威,吳睿婷,潘 猛,吳文英,湯小芳,李文娟*
(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047)
衰老是一種由多因素決定的涉及多器官的自然生理過程,而腦衰老是機體衰老過程中常見的生理現(xiàn)象,其在機體健康與疾病的平衡中扮演著重要角色[1-2]。近年來,由于機體衰老而導致的腦疾病發(fā)病率逐年升高,而我國老齡人口數(shù)量龐大,截至2014年底我國60 歲及以上人口約占總?cè)丝诘?6%,老年群體的腦衰老疾病給我國經(jīng)濟、社會、家庭帶來了沉重負擔[3],因此,加強對腦衰老的研究具有重要的現(xiàn)實意義。白藜蘆醇(resveratrol,RSV)即3,4',5-三羥基反式二苯乙烯,是一種具有順、反2 種結(jié)構的非黃酮類植物多酚[4],其主要存在于葡萄、花生、桑樹等植物中,因具有抗衰老、抗氧化、抗癌等多種重要活性而成為研究熱點[5-6]。腦神經(jīng)細胞是組成腦神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單位,其正常的生長、發(fā)育、分化是維持大腦功能的基礎[7];而在機體衰老過程中,神經(jīng)細胞的凋亡會日益增加,導致線粒體功能紊亂。Brenowitz等[8]研究發(fā)現(xiàn),在腦神經(jīng)細胞凋亡過程中活性氧(reactive oxygen species,ROS)會過度積累,線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)顯著降低,此變化標志著線粒體功能損傷明顯[9];Guo Xiaoqian等[10]發(fā)現(xiàn),損傷的線粒體在機體衰老過程中會通過Bcl-2家族成員促進凋亡因子釋放來加速細胞凋亡和機體衰老;Geng Huixia等[11]發(fā)現(xiàn)線粒體在神經(jīng)細胞凋亡過程中通過釋放細胞色素c(cytochrome c,Cyt c)與凋亡蛋白誘導因子pro-Caspase-9等結(jié)合形成凋亡復合體,促進Caspase家族蛋白酶活化,弱化線粒體功能,促使腦神經(jīng)細胞凋亡[12-13],最終導致腦記憶減退、神經(jīng)衰弱,甚至誘使機體發(fā)展成阿爾茨海默病等相關疾病[14]。因此,加強對RSV的腦神經(jīng)細胞保護作用研究具有重要意義。本研究利用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)建立小鼠衰老模型[15],檢測RSV對小鼠體質(zhì)量、腦器官指數(shù)、腦記憶水平、神經(jīng)細胞凋亡、ROS水平、MMP變化、線粒體Caspase-9和Caspase-3活力、線粒體Cyt c和胞漿Cyt c表達情況的影響,探究RSV是否通過線粒體機制對衰老小鼠腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用。
BALB/c清潔級小鼠60 只,雌雄不拘,6~8 周,體質(zhì)量(30±2)g,購自江西中醫(yī)藥大學。生產(chǎn)許可證號:SCXK(贛)2006-0001。
D-gal、RSV、羅丹明123 美國Sigma公司;2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescein dilacerate,DCFH-DA) 美國Molecular Probes公司;Cyt c抗體美國BD Pharmingen公司;Annexin V試劑盒(含碘化丙啶(propidium iodide,PI)) 法國國際免疫公司;Caspase-3、Caspase-9試劑盒 美國BioVision公司;生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)為自制。
Mettler Toledo AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;3K15冷凍離心機 德國Sigma公司;SHP-150生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;FACSCaliburTM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司;-80 ℃超低溫冰箱 美國Thermo Scientific公司;超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司。
1.3.1 實驗分組、模型建立、RSV處理
實驗條件及分組:小鼠于18~22 ℃、相對濕度50%~60%條件下飼養(yǎng),12 h晝夜交替,自由攝食和飲水。實驗中嚴格遵守動物管理條例和倫理委員會鑒定許可,墊料、飼料、飲水均符合使用標準。小鼠按照體質(zhì)量均分為5 組:Control組、D-gal組、D-gal+RSV(6.25)組、D-gal+RSV(12.5)組、D-gal+RSV(25)組。每組12 只,編號。
模型建立:除Control組外,其他各組每日按100 mg/kg mb腹腔注射D-gal,Control組按相同劑量注射生理鹽水,持續(xù)10 周,建立小鼠衰老模型。
RSV處理:從第7周開始,3 個RSV處理組分別按6.25、12.50、25.00 mg/kg mb灌胃RSV,其他組按100 mg/kg mb灌胃生理鹽水,持續(xù)4 周,第10周結(jié)束后處死小鼠。
1.3.2 腦神經(jīng)細胞的制備
參照文獻[16]的方法。無菌摘除小鼠大腦置于預冷的生理鹽水中,分離大腦皮質(zhì),稱質(zhì)量,將大腦皮質(zhì)剪碎,于37 ℃條件下加入1.25 mg/mL胰酶消化8 min,胎牛血清終止消化;接著采用全培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)神經(jīng)細胞,再將細胞懸浮培養(yǎng)在含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,再分別加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素,同時在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)細胞,細胞濃度不超過5×105個/mL,每日換液以維持細胞良好狀態(tài),待后續(xù)實驗使用。
1.3.3 指標檢測
腦器官指數(shù):取出小鼠腦組織用生理鹽水清洗后并稱質(zhì)量。腦器官指數(shù)按下式計算。
記憶水平:參照Morris等[17]的方法,采用圓形水池和隱藏平臺制成簡易水迷宮。實驗中水面高出平臺約1 cm,水溫為(22.0±0.5)℃,將水染成黑色以隱藏平臺。將小鼠放入水池中自由游泳,記錄120 s內(nèi)小鼠找到平臺的時間;如果120 s內(nèi)小鼠未找到平臺,將其引至平臺并停留20 s以加強記憶,每天訓練4 次,共訓練4 d,第5、6天撤去平臺,記錄120 s內(nèi)小鼠穿越原平臺所在位置的次數(shù)以評價RSV對衰老小鼠記憶水平的影響。
細胞凋亡率[18]:在室溫下加入250 μL 1.25 mg/mL胰酶處理神經(jīng)細胞,10 min后用DMEM培養(yǎng)基終止消化,收集神經(jīng)細胞于離心管,2 000 r/min離心5 min,收集沉淀細胞,PBS洗滌2 次,加入適量胰蛋白酶抑制劑和RNA酶緩沖液,在室溫下反應10 min;然后加入Annexin V和PI染色液各5 μL,避光反應5 min,冰浴10 min,在流式細胞儀中進行測定。
細胞R O S水平:以2',7'-二氯熒光素(2',7'-dichlorofluorescein,DCF)的熒光強度表示細胞內(nèi)ROS水平,熒光強度越強表明ROS水平越高[19]。以DCFH-DA作為ROS特異熒光探針并檢測其水平。取1.3.2節(jié)生長狀況良好的神經(jīng)細胞加入0.5 mL 20 μmol/L DCFH-DA,在37 ℃、避光條件下孵育,20 min后移去培養(yǎng)基,PBS漂洗細胞3 次,在激發(fā)光波長525 nm下使用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平。
細胞MMP:根據(jù)線粒體攝取Rho123熒光染料后可發(fā)出綠色熒光,其強度與MMP成正相關的工作原理[20],取1.3.2節(jié)生長狀況良好的細胞,用含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化,并用PBS漂洗2~3 次制成細胞懸液,在4 ℃、1 500 r/min條件下離心10 min,再避光加入0.5 mL 5 mg/L Rho123染液置于培養(yǎng)箱中染色30 min,PBS漂洗1 次;在4 ℃、1 500 r/min條件下離心10 min,過200 目尼龍濾網(wǎng),使用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm條件下檢測Rho123的熒光強度。
細胞Caspase-9和Caspase-3活力:嚴格按照試劑盒說明書操作,測定Caspase-3和Caspase-9活力。調(diào)節(jié)細胞濃度至2×105~5×105個/mL,冰浴10 min,1 000 r/min離心1 min后測定蛋白質(zhì)濃度,加入50 μL細胞裂解液將蛋白樣品稀釋至100 μL,每個樣品中分別加入2×緩沖液(50 μL)和4 mmol/L LEHD-pNA底物(5 μL),再于37 ℃溫育1 h。同時,將未誘導的細胞設為陰性對照組,通過比較RSV處理組與Control組水平以測定Caspase-9和Caspase-3活力。
Western blotting法檢測Cyt c表達:取待用細胞懸液,PBS漂洗3 次,按體積比1∶8加入勻漿液進行勻漿,在4 ℃、1 000 r/min條件下離心10 min,取上清液,在4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min,繼續(xù)取上清液,在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min,分裝上清液,進行凍存[21]。按照Bradford法測定蛋白質(zhì)量濃度,再嚴格按照Western blotting方法配制質(zhì)量分數(shù)15%分離膠、3%濃縮膠,于每個上樣孔中加入20 μg蛋白樣品,在150 V電壓下電泳30 min;再在100 V電壓下分別電轉(zhuǎn)移15、30、60、90、120 min,將硝酸纖維素膜浸入1%麗春紅溶液中顯色3 min后用蒸餾水沖洗;最后將膜浸入質(zhì)量分數(shù)1% Tween 20、5%脫脂乳粉中封閉1 h,加入按1∶300體積比稀釋的Cyt c抗體,4 ℃孵育過夜,用TBST(Tris buffered saline Tween)洗膜3 次后加入按1∶2 000體積比稀釋的二抗,室溫孵育1 h,TBST洗膜3 次后進行電化學發(fā)光(electro-chemiluminescence,ECL)顯色[22]。
表1 RSV對小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of RSV on body mass in mice
體質(zhì)量是機體生長發(fā)育的一個重要指標,其變化能反映小鼠的生長情況。實驗周期內(nèi)每周相同時間稱量并記錄一次小鼠體質(zhì)量。由表1可知,各組小鼠在實驗初期的平均體質(zhì)量基本相同,組間無顯著差異(P>0.05),在第7周進行RSV灌胃后,由于灌胃操作可能會對胃腸黏膜造成損害,導致小鼠食欲低下,體質(zhì)量短時間內(nèi)小幅下降,適應本操作后小鼠體質(zhì)量又有所增長,說明RSV的劑量在本實驗周期內(nèi)未對小鼠體質(zhì)量造成影響,不影響實驗小鼠的正常生長發(fā)育。
表2 RSV對小鼠腦器官指數(shù)的影響Table 2 Effect of RSV on brain index in mice
腦器官指數(shù)能反應腦組織的健康狀況,與腦組織的健康程度呈正相關。由表2可知,與Control組相比,D-gal組小鼠腦器官指數(shù)明顯減小,且具有顯著性差異(P<0.05),表明D-gal對小鼠腦組織造成明顯損傷。而與D-gal組相比,RSV處理組腦器官指數(shù)均有不同程度的提高,其中D-gal+RSV(25)組效果最為明顯,與D-gal組具有顯著性差異(P<0.05)。此結(jié)果表明RSV能提高D-gal致衰老小鼠的腦器官指數(shù),對腦組織具有保護作用。
表3 RSV對小鼠穿越隱藏平臺次數(shù)的影響Table 3 The effect of RSV on the number of crossing platform in mice
由表3可知,與Control組相比,D-gal組小鼠穿越隱藏平臺的次數(shù)明顯減少,表明D-gal能使小鼠記憶水平降低,損傷記憶功能;與D-gal組相比,RSV處理組小鼠穿越隱藏平臺次數(shù)均有所提高,但無顯著差異(P>0.05),結(jié)果表明RSV在一定程度上能提高D-gal致衰老小鼠的記憶水平,改善記憶功能。
圖1 RSV對D-gal誘導小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡的影響Fig. 1 Effect of RSV on D-gal-induced apoptosis of cerebral cortical neurons in mice
由圖1可知,與Control組相比,D-gal組小鼠腦神經(jīng)細胞凋亡率由3.66%增加至37.99%,存在極顯著差異(P<0.01),說明D-gal引起腦神經(jīng)細胞凋亡明顯,所造衰老模型成功。而與D-gal組相比,RSV處理組小鼠腦神經(jīng)細胞凋亡率分別降至28.32%、21.38%、18.56%,均有極顯著差異(P<0.01),且抑制效果與RSV劑量呈正相關,表明RSV對D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞凋亡具有抑制作用。
由圖2可知,與Control組相比,D-gal組DCF熒光強度由105.64±5.20增加至155.88±13.77,差異極顯著(P<0.01),說明D-gal組小鼠腦神經(jīng)細胞ROS積累明顯;而與D-gal組相比,D-gal+RSV(6.25)、D-gal+RSV(12.5)、D-gal+RSV(25)組DCF熒光強度分別減至121.48±9.35、92.56±8.71、87.67±15.43,均有極顯著差異性(P<0.01),且其DCF熒光強度與RSV呈劑量依賴性相關,表明RSV能夠有效抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞中ROS的積累。
圖2 RSV對D-gal誘導小鼠腦神經(jīng)細胞ROS相對含量的影響Fig. 2 Effect of RSV on ROS production in cerebral cortical neurons of aging mice induced by D-gal
圖3 RSV對D-gal誘導小鼠腦神經(jīng)細胞線粒體膜電位的影響Fig. 3 Effect of RSV on MMP in cerebral cortical neurons of aging mice induced by D-gal
由圖3可知,Control組Rho123熒光強度最強,而D-gal組Rho123熒光強度最弱,兩者之間具有極顯著性差異(P<0.01),結(jié)果顯示D-gal能使小鼠腦神經(jīng)細胞MMP極顯著降低,造成線粒體損傷。而與D-gal組相比,D-gal+RSV(6.25)、D-gal+RSV(12.5)、D-gal+RSV(25)組Rho123熒光強度均有極顯著增強(P<0.01),且MMP的增強效果與RSV劑量呈正相關。此結(jié)果說明RSV可促進D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞MMP增強,對線粒體具有保護作用。
由圖4可知,與Control組相比,D-gal組線粒體Cyt c表達下降,胞漿Cyt c表達增強;而與D-gal組相比,RSV處理組線粒體Cyt c表達均增強,胞漿Cyt c表達均降低;表明RSV可顯著促進D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞中線粒體Cyt c的表達,抑制胞漿Cyt c的表達。
另一方面,與Control組相比,D-gal組線粒體中Caspase-9和Caspase-3活力極顯著上升(P<0.01);表明D-gal組Caspase家族蛋白酶已被活化。而與D-gal組相比,RSV處理組中Caspase-9和Caspase-3活力均極顯著降低(P<0.01),且與RSV劑量呈正相關。說明RSV可有效抑制腦神經(jīng)細胞中Caspase-9和Caspase-3活化,對線粒體產(chǎn)生保護作用,從而有效抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞凋亡。
圖4 RSV對D-gal誘導小鼠腦神經(jīng)Cyt c表達及對Caspase-9和Caspase-3活力的影響Fig. 4 Effect of RSV on the expression of cytochrome c and the activity of caspase-9 and caspase-3 in cerebral cortex of D-gal-induced aging mice
綜上可知,對D-gal致衰老小鼠灌胃RSV 4 周后,RSV能抑制D-gal引起的線粒體凋亡通路相關參數(shù)Cyt c表達和Caspase-3、Caspase-9活力的變化,表明RSV通過線粒體通路來抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞的凋亡。
機體在衰老過程中易引起線粒體功能損傷、代謝紊亂、自由基過剩等,最終導致細胞凋亡。因細胞凋亡與機體衰老過程中組織、器官功能的退化以及老年癡呆等疾病的發(fā)生密切相關,所以細胞凋亡會加速機體衰老,因此神經(jīng)細胞凋亡也是導致機體衰老的一個重要因素[23-24]。神經(jīng)細胞是組成神經(jīng)系統(tǒng)基本單位,在機體衰老過程中,腦神經(jīng)細胞逐漸發(fā)生壞死或凋亡,從而出現(xiàn)記憶損傷、意識模糊等病癥[25]。D-gal致衰老模型是指對動物長期注射適宜劑量D-gal使其產(chǎn)生一系列與衰老相關的病理過程。本研究通過連續(xù)10 周腹腔注射D-gal建立小鼠衰老模型,再對小鼠灌胃不同劑量的RSV并以腦神經(jīng)細胞凋亡作為研究重點,探究RSV對衰老小鼠腦神經(jīng)細胞的保護作用及線粒體機制[26]。
結(jié)果顯示,與Control組相比,D-gal組腦器官指數(shù)顯著減?。≒<0.05),記憶能力有所降低,但無顯著差異(P>0.05),腦神經(jīng)細胞凋亡率極顯著增加(P<0.01),表明實驗周期內(nèi)D-gal能加速小鼠腦損傷,促進腦神經(jīng)細胞凋亡。而經(jīng)RSV處理4 周后,與D-gal組相比,RSV 3 個劑量組中腦器官指數(shù)增大,其中D-gal+RSV(25)組效果最明顯(P<0.05);記憶能力均有增強,但無顯著差異(P>0.05);神經(jīng)細胞凋亡率極顯著降低(P<0.01),表明RSV能有效保護腦組織,抑制腦神經(jīng)細胞的凋亡。在RSV的線粒體作用通路研究中,利用流式細胞儀檢測DCF和Rho123的熒光強度,測定腦神經(jīng)細胞ROS水平和MMP的變化,結(jié)果顯示,與Control組相比,D-gal組小鼠腦神經(jīng)細胞ROS積累極顯著增加(P<0.01),MMP極顯著降低(P <0.01),表明D-gal加速了腦神經(jīng)細胞損傷;而與D-gal組相比,RSV 3 個劑量組中ROS水平均極顯著降低(P<0.01),MMP均極顯著增加(P<0.01),結(jié)果表明RSV能抑制ROS積累,提高MMP,對腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用,此結(jié)果與Baar等[27]研究結(jié)果一致。在細胞凋亡過程中,先出現(xiàn)MMP下降,再發(fā)生胞膜磷脂酰絲氨酸由內(nèi)而外的轉(zhuǎn)變,導致Caspase家族成員被激活,其也是細胞凋亡的早期表現(xiàn)[28],且當膜電位下降時,細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn),因此MMP下降也是細胞凋亡的特征表現(xiàn),此結(jié)果與Sung等[29]的研究結(jié)果一致。
與Control組相比,D-gal組線粒體Cyt c表達下降,胞漿Cyt c表達增強;而與D-gal組相比,RSV 3 個劑量組線粒體Cyt c表達回升,胞漿Cyt c表達降低,結(jié)果提示RSV可顯著抑制D-gal致衰老小鼠神經(jīng)細胞中Cyt c的表達,與Pradelli等[23]研究結(jié)果一致,他們發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白促使線粒體損傷,而損傷的線粒體通過Cyt c誘導細胞凋亡。有研究顯示,活化的Caspase-9和Caspase-3均會參與到細胞凋亡的過程中,促進細胞凋亡[30]。本研究檢測了Caspase-9和Caspase-3活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Control組相比,D-gal組線粒體Caspase-9和Caspase-3活力極顯著上升(P<0.01);而與D-gal組相比,RSV 3 個劑量組中Caspase-9和Caspase-3活力呈劑量依賴性極顯著降低(P<0.01),表明RSV可抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞中Caspase-9和Caspase-3活性的升高。本研究中線粒體凋亡信號通路中3 個參數(shù)均發(fā)生變化,提示RSV可能通過調(diào)控線粒體通路來抑制腦神經(jīng)細胞凋亡。
綜上可知,RSV能明顯抑制D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞損傷,提高小鼠腦器官指數(shù)和記憶水平,極顯著降低細胞凋亡率、抑制ROS積累、提高MMP,說明RSV對D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞產(chǎn)生了保護作用;而RSV又能提高線粒體Cyt c表達,抑制胞漿Cyt c表達,極顯著降低Caspase-9和Caspase-3活力,說明線粒體通路介導了RSV對D-gal致衰老小鼠腦神經(jīng)細胞的保護作用。