李雨楓，薛思雯，陳 星，李 鳴，徐幸蓮*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095）

肌肉蛋白營養(yǎng)豐富，包含人體所需的所有必需和非必需氨基酸，其消化率遠高于大豆蛋白等植物蛋白，是一種優(yōu)質(zhì)的人體蛋白質(zhì)補充劑[1-2]。肌原纖維蛋白（myofibrillar proteins，MP）是肌肉蛋白中最主要的蛋白質(zhì)，大約占肌肉蛋白的50%左右[3]。這部分蛋白質(zhì)由于在高鹽濃度溶液中易溶解，故被稱為鹽溶蛋白[4]。在肉品加工中，MP的溶解性會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、乳化性等功能特性，所以具有特殊的功能性。但是相比于牛奶、大豆蛋白，肌肉蛋白在食品加工中利用程度不高，主要原因是其在水或者低離子強度溶液中不溶解，從而導致肉制品形態(tài)單一。近年來，為了提高MP的溶解性，超聲波[5]、蛋白糖基化[6-7]和低鹽洗脫[8]等新技術被廣泛研究。

高壓均質(zhì)（high pressure homogenization，HPH）是一種運用于食品領域中的新型加工技術，物料在高壓作用下，通過具有特殊內(nèi)部構(gòu)造的均質(zhì)腔，同時受到高速剪切、高頻振蕩、空穴作用和對流碰撞等物理作用，使物料的性質(zhì)發(fā)生一定變化，從而達到均質(zhì)、改善加工特性和殺菌的效果[9-10]。目前已有研究表明，HPH的物理作用能夠打破MP高度交聯(lián)的復雜結(jié)構(gòu)，對MP進行物化改性，從而提高MP的水溶性[11]。同時，不同次數(shù)的HPH處理可以對植物蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)、理化特性產(chǎn)生不同的影響，從而提高植物蛋白在食品加工中的利用程度[12-18]。但關于HPH處理次數(shù)對MP在水中溶解性的影響及其調(diào)控規(guī)律尚不清楚。作為一種人體蛋白質(zhì)的重要補充來源，開展HPH對MP在水中溶解性的調(diào)控規(guī)律研究很有必要。本實驗對MP懸濁液進行不同次數(shù)的HPH處理，并對處理后的MP水溶液溶解性、穩(wěn)定性、粒徑、流變特性、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的變化情況進行初步探究，以期為肉蛋白的在食品中的進一步開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍雞胸肉 江蘇省南京市蘇果超市。

三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、牛血清白蛋白、聚乙二醇辛基苯基醚、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍R250、溴酚藍、β-巰基乙醇、五水硫酸銅、四水合酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、疊氮化鈉（均為分析純） 南京瑞翼特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GM 200粉碎儀 德國Retsch儀器有限公司；T25勻漿機 德國IKA儀器有限公司；Mini Debee超高壓均質(zhì)機美國Bee儀器有限公司；Z5（130 μm）金剛石噴嘴美國Genizer儀器有限公司；J26SXP落地式離心機 美國Beckman儀器有限公司；Nano ZS 90納米激光粒度儀英國馬爾文儀器有限公司；MCR 301流變儀 澳大利亞Anton Paar有限公司；Dimension Icon原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM） 德國Bruker有限公司；Imager Scanner III EU-88掃描儀 日本Epson公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

根據(jù)Stefansson[8]、Chen Xing[11]等的方法稍作修改，采用水洗法提取MP。將冷凍的雞胸肉在4 ℃下解凍12 h后，去除結(jié)締組織和脂質(zhì)，將雞胸肉在粉碎儀中以3 000 r/min粉碎10 s，用4 ℃的去離子水將碎肉（100 g）洗滌4 次，用勻漿機均質(zhì)2 min。將每次洗滌后的肉糜與水（1∶100，m/V）靜置10 min，在4 ℃下18 000×g離心20 min，回收沉淀物，在第3次洗滌時，將離心前的懸濁液用3 層紗布過濾以去除結(jié)締組織和脂質(zhì)。最后一次洗滌、離心后的沉淀物即為MP。所有操作都在4 ℃條件下進行。

1.3.2 HPH處理

提取后的MP質(zhì)量濃度為60 mg/mL，在MP中加入4 ℃去離子水將MP質(zhì)量濃度稀釋至5 mg/mL備用，8 000 r/min勻漿處理2 min。用配備有Z5型號金剛石噴嘴的高壓均質(zhì)機將樣品在103MPa壓力下分別處理1～6 次，以未經(jīng)過HPH處理的樣品為對照組，處理后將所有樣品裝入無菌袋保存，為了防止微生物污染對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，添加質(zhì)量分數(shù)0.02%的疊氮化鈉作為防腐措施[19]，所有樣品置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 溶解度的測定

溶解度的測定根據(jù)Chen Xing等[11]的方法，并略作修改。將經(jīng)過處理后的樣品在4 ℃條件下，使用離心機在20 000×g下離心20 min，收集上清液，溶解度以離心后上清液MP質(zhì)量濃度相對于離心前MP懸濁液質(zhì)量濃度的百分比表示，每個樣品平行測定3 次。

1.3.4 穩(wěn)定性的測定

將經(jīng)過處理后的MP水溶液在4 ℃條件下放置9 d，在第0、3、6、9天分別測定其溶解度并進行記錄，每個樣品平行測定3 次。

1.3.5 SDS-PAGE分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）采用Khiari等[20]的方法。將10 μL經(jīng)過20 000×g離心后的上清液樣品、經(jīng)過HPH處理的MP懸濁液樣品和Marker同時加入到質(zhì)量分數(shù)4%～20%預制分離膠上。使用Mini-PROTEAN II System Cell以120 V恒壓電泳1 h。待條帶跑至電泳板的最底部時停止電泳，將膠剝離取出，放置在染色液中染色1 h，然后放入乙酸脫色液中脫色11～12 h，及時更換脫色液。待電泳凝膠的底色脫為透明時，使用Imager Scanner III掃描儀掃描染色的凝膠，并且通過Quantity One軟件進行條帶處理分析。

1.3.6 粒徑分布的測定

根據(jù)Chen Xing等[11]的方法并略作修改。使用Nano ZS 90納米激光粒度儀進行測定。將通過0～6 次HPH處理的MP水溶液稀釋10 倍后，分別置于1 cm光程石英比色杯中，并在25 ℃條件下進行測量，得到平均粒度和粒徑分布。

1.3.7 流變特性的測定

使用MCR30流變儀獲得樣品的流動曲線[21]。測量間距0.5 mm，測量前將樣品在流變儀上平衡30 s以獲得25 ℃的理想溫度，在剪切速率1～1 000 s－1范圍內(nèi)記錄黏度。

1.3.8 AFM觀察

參考Zhong Jian等[22]的方法，通過使用配備有Si3N4懸臂式掃描儀的AFM獲得以輕敲模式掃描的AFM圖像（SCANASYST-AIR模式、共振頻率70 kHz、彈簧系數(shù)0.4 N/m），實驗在室溫（25 ℃）下進行。線性掃描速率在1 Hz下進行優(yōu)化，掃描分辨率為每行512 個樣本。用超純?nèi)ルx子水將樣品稀釋至0.05 mg/mL，并將5 mL MP水溶液澆鑄在新鮮切割的云母上，并使其在空氣中干燥20 min，然后進行AFM觀察。所有高度圖像都使用Nanoscope分析軟件進行“平滑”處理。

1.3.9 表面疏水性的測定

MP在水中表面疏水性的測定根據(jù)Cao Yingying等[23]的方法進行修改。使用ANS測試表面疏水性。向2 mL樣品（1 mg/mL）中加入10 μL 15 mmol/L ANS溶液（0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）。避光孵育20 min，使用380 nm的激發(fā)波長和410～570 nm的發(fā)射波長在5 nm/s掃描速率下測定熒光強度。表面疏水性用熒光強度（a.u.）表示。

1.3.10 活性巰基含量的測定

根據(jù)Chen Xing等[24]的方法進行改進，測定水中MP的活性巰基基團含量。將MP水溶液用去離子水稀釋到1 mg/mL，將50 μL 5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.0）中加入4 mL樣品（1 mg/mL），并在25 ℃條件下孵育20 min，并通過Microplate Reader分光光度計在412 nm波長處測定混合物的吸光度。使用13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)按下式計算巰基含量。

式中：A412nm為吸光度；D為稀釋倍數(shù)；ρ為肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。每個壓力水平重復實驗3 次。

1.3.11 圓二色光譜分析

使用Jasco J-715分光偏振計測量圓二色光譜（circular dichroism，CD）。用去離子水將MP水溶液調(diào)整到0.3 mg/mL，隨后轉(zhuǎn)移至0.1 cm光徑的石英池中。在調(diào)節(jié)溫度下以20 nm/min的掃描速率在200～240 nm的范圍內(nèi)測量分子橢圓率。使用Jasco J-715旋光偏振計提供的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)計算程序測定α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均重復實驗3 次，使用SAS軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05為顯著差異。采用Origin 2017軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPH處理次數(shù)對MP水溶液溶解度的影響

圖1 HPH處理次數(shù)對MP水溶液溶解度的影響Fig. 1 Effect of HPH cycle on aqueous solubility of MPs

由圖1可知，未經(jīng)HPH處理的MP懸濁液呈現(xiàn)較低的溶解度（23.6%），說明MP在水中的溶解性較差[5,11]。由于HPH在處理過程中會對物料產(chǎn)生高速剪切、空穴作用、對流撞擊等機械作用，促使MP蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，極性基團和疏水基團更多地暴露出來，導致表面電荷增加，從而提高其溶解性。同時，Chen Xing等[11]也通過103 MPa、2 次HPH處理實現(xiàn)了MP在水或低離子強度溶液中的溶解。在本實驗中，隨著處理次數(shù)的增加，MP水溶液的溶解度持續(xù)上升，在4 次處理時達到最高（96.1%）。當處理次數(shù)達到到5～6 次時，MP溶解度增長放緩，甚至出現(xiàn)下降趨勢，此時MP溶解度與經(jīng)過4 次處理的樣品不存在明顯差異。原因可能是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在經(jīng)過多次HPH處理后進一步展開，導致蛋白質(zhì)之間接觸增加，在疏水作用下，蛋白質(zhì)重新聚集，使得MP溶解度呈現(xiàn)降低趨勢[18]。

2.2 HPH處理次數(shù)對MP水溶液穩(wěn)定性的影響

穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)一種很重要的特性，良好的穩(wěn)定性有利于蛋白質(zhì)在食品加工中的進一步利用。將HPH處理后的MP水溶液在4 ℃條件下靜置9 d，每隔3 d測定其溶解度，與未經(jīng)HPH處理的樣品進行對比，結(jié)果見圖2。當HPH處理次數(shù)為1～3 次時，與第0天相比，樣品的溶解度在第9天時顯著下降（P＜0.05），其中經(jīng)過1 次HPH處理的MP水溶液在第9天時僅能保持40.0%的溶解度，原因可能是由于處理次數(shù)較少，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)并未完全被破壞，蛋白質(zhì)顆粒大小不一，隨著貯藏時間的延長，不同蛋白質(zhì)分子的顆粒大小以及介質(zhì)的密度差會導致蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象[11]，導致水溶液穩(wěn)定性較差。當HPH處理4～6 次時，水溶液在第9天時仍然保持較好的溶解性（90%以上），溶解度與靜置初期相比沒有明顯下降。這可能是由于隨著HPH處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被進一步被完全破壞成較小的顆粒，從而提高了MP水溶液的均勻性，在貯藏過程中保持了較好的穩(wěn)定性[12]。其中當HPH處理次數(shù)為5～6 次時，與處理4 次相比，穩(wěn)定性較差，隨著處理次數(shù)增加，蛋白質(zhì)可能會進一步聚集，導致蛋白質(zhì)分子在MP水溶液中分布不均，從而影響其穩(wěn)定性。

圖2 HPH處理次數(shù)對MP水溶液穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Effect of HPH cycle on stability of MPs in water

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖3 HPH處理后MP水溶液SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of MPs aqeuous solutions undergoing different HPH cycles

由圖3可知，未經(jīng)HPH處理和經(jīng)過HPH處理的樣品蛋白條帶中肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈較為明顯。經(jīng)過離心后的未經(jīng)HPH處理的樣品上清液幾乎看不到蛋白條帶（泳道2），說明MP在水中具有不溶性，這與之前的相關研究結(jié)果[11,24]相符，證明MP不溶于水。經(jīng)過20 000×g離心后，HPH處理的樣品上清液仍然保留了部分蛋白質(zhì)（泳道4、6、8、10、12和14），并且與未經(jīng)離心的蛋白溶液條帶相比沒有明顯差異。以上結(jié)果說明HPH實現(xiàn)MPs在水中溶解的同時，MP沒有發(fā)生明顯的水解現(xiàn)象，因此HPH實現(xiàn)MP在水中的溶解并不是通過多肽的斷裂或縮短引起的[11,25]。

2.4 HPH處理次數(shù)對MP在水中顆粒特性的影響

圖4 HPH處理次數(shù)對MP在水中粒徑分布的影響Fig. 4 Effect of the HPH cycle on particle size distribution of MPs in water

圖5 HPH處理次數(shù)對MP在水中平均粒徑的影響Fig. 5 Effect of HPH cycle on Z-average of MPs in water

如圖4、5所示，與未經(jīng)處理的樣品平均粒徑（1 252 nm）相比，經(jīng)過HPH處理后MP在水中的平均粒徑顯著下降（P＜0.05），均為400 nm以下，同時呈現(xiàn)雙峰分布，粒徑分布變得更加均勻。當樣品在高壓作用下通過均質(zhì)機時，高度有序的MP結(jié)構(gòu)被破壞，施加的機械力對其產(chǎn)生隨機破裂、解聚或解離等作用[26]，導致粒徑減小。HPH處理1～4 次時，樣品的平均粒徑隨著處理次數(shù)的增加逐漸變小，分別為327、251、227、204 nm，同時粒徑分布峰均向小粒徑峰移動，其中在HPH處理4 次時粒徑最小。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，處理組的峰與空白組的間距增大，并且在第4次時達到最大，推測是由于樣品循環(huán)進行HPH處理的過程中，HPH對樣品施加反復的物理作用，樣品在循環(huán)通過噴嘴時，蛋白顆粒的結(jié)構(gòu)持續(xù)破壞。當HPH處理次數(shù)達到4 次及以上時，其粒徑分布峰開始向右移動，表現(xiàn)出向大粒徑峰分布的趨勢，同時，其平均粒徑的降低不再顯著（P＞0.05）。有研究表明，當HPH的壓力過高、均質(zhì)次數(shù)過多時，可能會引起蛋白質(zhì)的重新聚合，導致粒徑增大[11,17,27-28]。

2.5 HPH處理次數(shù)對MP水溶液流變特性的影響

由圖6可知，經(jīng)過HPH處理后，MP水溶液的表觀黏度顯著降低，其中未經(jīng)HPH處理的樣品與HPH處理1～2 次的樣品表觀黏度都隨著剪切速率的增加而表現(xiàn)出剪切變稀的現(xiàn)象，呈現(xiàn)非牛頓流體狀態(tài)，說明蛋白溶液中還保留著一些完整的MP片段，具有高黏度；其中大的蛋白顆粒以及大分子互相糾纏在一起，增加了溶液流動的阻力；隨著剪切速率的增加，蛋白纖維之間的連接被破壞，摩擦阻力減小，導致黏度下降。當處理次數(shù)為3～6 次時，可以看到與前3 組相比，表觀黏度顯著下降，在剪切速率范圍內(nèi)呈現(xiàn)牛頓流體性質(zhì)?？赡苁怯捎贖PH次數(shù)增加時，蛋白粒徑減小，流動性增加，所以呈現(xiàn)較低的表觀黏度。HPH處理6 次時，蛋白質(zhì)之間重新聚集，粒徑變大，導致其表觀黏度較HPH處理5 次相比有所增加。

圖6 HPH處理次數(shù)對MP水溶液流變特性的影響Fig. 6 Effect of HPH cycle on flowability of MPs in water

2.6 HPH處理次數(shù)對MP水溶液形貌結(jié)構(gòu)的影響

圖7 HPH處理MP水溶液的AFM圖Fig. 7 Effect of HPH cycle on AFM morphology of MPs in water

通過AFM觀察到了不同HPH處理次數(shù)對MP水溶液形貌結(jié)構(gòu)的影響，如圖7所示，未經(jīng)處理的樣品中觀察到一束具有完整線性特征結(jié)構(gòu)的蛋白分子，說明此時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)還保持著高度有序的狀態(tài)，這與Yoshikawa等[27]在兔骨骼肌蛋白質(zhì)中觀察到的現(xiàn)象一致。經(jīng)過HPH處理之后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，表現(xiàn)出具有較小粒徑的分散顆粒，同時其顆粒高度也由91.6 nm降低到11.2 nm以下。隨著處理次數(shù)的增加，MP結(jié)構(gòu)顯示出更短更細的絲狀片段，并且釋放出一些單體或低聚體蛋白，當處理次數(shù)達到3～4 次時，絲狀結(jié)構(gòu)會進一步分裂破碎成具有亞單位的細絲或者單體蛋白[11]，顯著增加MP水溶液的分散性。當處理次數(shù)達4 次以上時，如圖7E～G所示，由于處理次數(shù)過多，蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的相互作用，形成了一些較大顆粒的不規(guī)則聚集物[11]，同時觀察到樣品的顆粒高度在處理6 次時明顯增加。

2.7 HPH處理次數(shù)對MP水溶液表面疏水性的影響

圖8 HPH處理次數(shù)對MP水溶液表面疏水性的影響Fig. 8 Effect of HPH cycle on surface hydrophobicity of MPs in water

表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)表面疏水性基團的數(shù)量，它決定蛋白質(zhì)分子間相互作用的能力，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、功能性質(zhì)及構(gòu)象具有重要的作用。如圖8所示，未經(jīng)HPH處理樣品的疏水基團大多數(shù)緊密包埋在球狀區(qū)域內(nèi)，疏水基團與ANS之間的接觸受到抑制[28]，導致其具有較少的疏水基團。經(jīng)HPH處理后，MP水溶液的表面疏水基團數(shù)量均明顯增加，并且隨著HPH處理次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，其中經(jīng)過4 次HPH處理的樣品表面疏水性最高。HPH處理時，最初產(chǎn)生的高靜壓通過氫鍵和疏水作用導致水穿透蛋白質(zhì)的內(nèi)部從而修飾蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進而破壞MP的三級結(jié)構(gòu)[25,29]。隨著HPH處理次數(shù)的增加，MP持續(xù)受到高靜壓、剪切力和空穴作用等機械力反復作用，蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊現(xiàn)象，抑制了部分二硫鍵的產(chǎn)生，促進了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，疏水基團暴露并且相互作用，從而導致表面疏水性持續(xù)提高。當HPH處理次數(shù)達到4 次以上時，可以看到表面疏水性出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這可能是因為MP蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進一步展開的同時，眾多蛋白質(zhì)分子在疏水作用與二硫鍵作用下重新聚集[30]，導致疏水基團減少，從而降低其表面疏水性。

2.8 HPH處理次數(shù)對MP水溶液活性巰基含量的影響

圖9 HPH處理次數(shù)對MP水溶液活性巰基含量的影響Fig. 9 Effect of HPH cycle on reactive sulfhydryl group content of MPs in water

巰基是MP中重要的功能基團，其含量變化可以反映出MP空間結(jié)構(gòu)的改變。MP水溶液的活性巰基含量變化如圖9所示。經(jīng)過HPH處理后，與未經(jīng)處理的樣品（4.53 μmol/100 mg）相比，樣品的活性巰基含量顯著上升（P＜0.05），說明HPH會導致MP中的巰基暴露在蛋白質(zhì)表面，這與Liu Wei等[31]的研究結(jié)果一致?；钚詭€基含量的增加說明HPH可以誘導水中MP結(jié)構(gòu)展開，有研究表明，HPH處理時產(chǎn)生的劇烈機械作用會導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變或者變性[32]。當MP懸濁液高速通過HPH均質(zhì)閥門時，會受到強剪切力、湍流和空穴作用等作用力，從而引起膠體顆粒和蛋白質(zhì)的分離、聚集或重排[12]，導致蛋白質(zhì)發(fā)生變性、結(jié)構(gòu)展開。蛋白質(zhì)分子展開后可能會誘導巰基以及疏水基團從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部暴露出來，導致其活性巰基含量增加。隨著HPH處理次數(shù)的增加，MP水溶液的活性巰基含量也持續(xù)增加，說明多次的HPH處理可以顯著提升MP水溶液的活性巰基含量。同時，當HPH處理次數(shù)為3～5 次時，活性巰基含量沒有顯著性差異（P＞0.05），然而在HPH處理6 次時出現(xiàn)了顯著下降?？赡苁怯捎诋擧PH處理達到一定次數(shù)后，在強力的機械作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生聚集現(xiàn)象，聚集體進一步解折疊，導致暴露的巰基被氧化而重新形成二硫鍵，從而降低活性巰基含量[30]。

2.9 HPH處理次數(shù)對MP水溶液二級結(jié)構(gòu)組成的影響

表1 CD分析MP水溶液的二級結(jié)構(gòu)組成Table 1 Secondary structure composition of MPs in water determined by CD

如表1所示，與未經(jīng)HPH處理的樣品相比，所有經(jīng)過HPH處理后的MP水溶液表現(xiàn)出α-螺旋相對含量降低、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量增加的現(xiàn)象。據(jù)報道，熱加工和HPH處理會誘導蛋白質(zhì)部分結(jié)構(gòu)的展開，且后者對結(jié)構(gòu)改變起主導作用[30]，這可能是導致MP水溶液中α-螺旋相對含量降低的原因，肌球蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)的缺失可能導致分子間相互作用的變化，從而破壞蛋白組裝過程，導致在水中溶解度增加[24]。當HPH處理次數(shù)為1～4 次時，隨著處理次數(shù)的增加，α-螺旋相對含量持續(xù)降低，說明HPH持續(xù)對MP水溶液產(chǎn)生的機械作用可以誘導MP結(jié)構(gòu)的不斷展開，同時β-轉(zhuǎn)角相對含量的持續(xù)增加也說明了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了展開和重組[17]。當HPH處理次數(shù)達到4 次以上時，可以發(fā)現(xiàn)α-螺旋相對含量有增加趨勢；同時反向平行的β-折疊的結(jié)構(gòu)容易在聚集的蛋白分子中形成，說明蛋白質(zhì)發(fā)生了不溶性的聚集，這與2.6節(jié)討論結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本實驗對不同次數(shù)的HPH處理對MP水溶液功能特性的影響進行了研究，不同次數(shù)的HPH處理對MP水溶液結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)具有不同的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過4 次HPH處理的MP水溶液具有較好的溶解性（90%以上），同時HPH處理4～6 次的樣品在4 ℃下放置9 d后仍具有較好的穩(wěn)定性；SDS-PAGE結(jié)果顯示經(jīng)過HPH處理后幾乎沒有發(fā)生蛋白質(zhì)降解的現(xiàn)象。隨著HPH處理次數(shù)的增加，MP水溶液的結(jié)構(gòu)被破壞，粒徑先減小后增大，同時表觀黏度降低，流動能力得到改善；表面疏水性和活性巰基含量先增加后減少，α-螺旋相對含量呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量明顯變化；過多次數(shù)（4 次以上）的HPH處理會引起MP水溶液產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象，從而導致其溶解性以及穩(wěn)定性的下降。上述研究表明，不同次數(shù)HPH處理可以對MP水溶液的功能特性進行調(diào)控。在本實驗中，經(jīng)過4 次HPH處理的MP水溶液具有較好的理化特性。選擇合適的HPH處理次數(shù)可以使MP水溶液具有較好的溶解性和穩(wěn)定性，降低粒徑、獲得較好的流動性，從而達到改善其加工特性的目的，為其今后在食品工業(yè)中的加工應用提供指導思路。