聶 恬，孟未群，李夢然，張玉明，倪志華*

（河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002）

利用秸稈、木材等可再生資源生物煉制生物基產(chǎn)品是生物技術領域的研究熱點，其技術關鍵是葡萄糖和木糖的高效生物轉(zhuǎn)化。與代謝葡萄糖不同，微生物對木糖利用率普遍不高。細菌中木糖分解代謝涉及兩種重要的酶：木糖異構酶（EC 5.3.1.5）和木酮糖激酶（EC 2.7.1.17）。木糖異構酶將木糖代謝為木酮糖，然后由木酮糖激酶將其轉(zhuǎn)化為木酮糖5-磷酸后進入磷酸戊糖途徑或磷酸解酮酶途徑以分解代謝[1]。微生物中木酮糖激酶的克隆表達與理化性質(zhì)的研究已有大量報道[2-3]。通常，來源于耐/嗜熱微生物的酶具有耐微生物污染、催化能力強和高溫穩(wěn)定等優(yōu)點，在工業(yè)催化領域獨具優(yōu)勢[4]。AHMAD S等[5-6]對兩株耐熱菌Saccharococcus caldoxylosilyticus和海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）中的木酮糖激酶進行了系統(tǒng)研究，獲得了高活性、耐高溫的催化酶。

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）具有高溫發(fā)酵木糖和葡萄糖生產(chǎn)乳酸的能力[7-8]，已經(jīng)成功應用于秸稈、淀粉等可再生資源的生物煉制[9-10]，對其所含功能酶的克隆、表達和純化研究已經(jīng)多有報道[11-14]。然而，針對該菌種的木糖代謝機制的研究還很匱乏。ZHENG Z等[15]首次從木糖操縱子角度，研究了B.coagulans NL01中的木酮糖激酶，然而未對該酶的結構特點和耐熱機制進行研究。

B.coagulans IPE22是本實驗室分離鑒定的一株乳酸生產(chǎn)菌，可高溫發(fā)酵木糖生產(chǎn)L-乳酸[16]，說明該菌株中一定具有高效的木糖代謝酶系。因此，本研究擬對B.coagulans IPE22中木酮糖激酶基因Bc-XK進行克隆表達和生物信息學分析，并對其熱穩(wěn)定性進行研究，最后將木酮糖激酶Bc-XK與其它細菌來源的木酮糖激酶進行氨基酸序列比對、活性位點分析和系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析，旨在闡述該酶的耐熱機制，為其工業(yè)化應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）IPE22、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）：本實驗保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉1%、瓊脂粉1.5%，121℃高壓滅菌20min。液體LB培養(yǎng)基中不添加瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

載體pET-30a：美國Novagen公司；His-Trap鎳親和層析柱：美國GE health公司；細菌基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、限制性內(nèi)切酶NcoI（10 U/μL）和XhoI（10U/μL）、T4DNA連接酶（350U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5430型臺式高速離心機：德國艾本德公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇潔凈化設備有限公司；PowerPac 300電泳儀：美國伯樂公司；2720型PCR基因擴增儀：美國ABI公司；MLS-3750型全自動滅菌鍋：日本三洋公司；Scientz-IID型超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木酮糖激酶基因Bc-XK的克隆

將B.coagulans IPE22接種于LB液體培養(yǎng)基中，45℃、150 r/m in條件下培養(yǎng)16 h，離心，收集菌體，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取B.coagulans IPE22基因組DNA。根據(jù)美國國立生物技術信息中心（national center forbiotechnology information，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫中B.coagulans 36D1（登錄號：CP003056.1）的木酮糖激酶基因信息設計基因Bc-XK的PCR擴增引物，正向引物為5'-CATGCCATGGCTATGAAATATGCAATCGGTGTC-3'，反向引物為5'-CCGCTCGAGCGGTTAAATTTCATCTGTTTTCCCT-3'。引物中，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點NcoI（正向引物）和XhoI（反向引物）。以基因組DNA為模板，采用設計的引物進行聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增，PCR擴增體系和擴增條件參考文獻[11]。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.3.2 重組菌的構建

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和XhoI分別對純化的PCR擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-30a進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化目的片段。采用T4DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物，以獲得重組質(zhì)粒pET-30a-Bc-XK。采用氯化鈣法[17]將重組質(zhì)粒pET-30a-Bc-XK轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）宿主菌中，涂布于含有25mg/L卡那霉素的LB平板上，于37℃條件下倒置培養(yǎng)18 h。挑取陽性克隆子送至蘇州金唯智公司進行測序。

1.3.3 Bc-XK基因的表達

將重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值約0.6后，添加終濃度為0.5mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）誘導表達。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，8 000 r/min離心10min，收獲菌體。

1.3.4 重組酶Bc-XK的純化

獲得的菌體在冰水浴中進行超聲破壁，超聲條件為功率95W，12m in，2 s工作，2 s間隔，360個循環(huán)。細胞破碎液在4℃、10 000 r/min條件下離心15min，棄沉淀，取上清液，使用鎳柱進行蛋白純化[4]。采用10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測重組酶Bc-XK的分子質(zhì)量。

1.3.5 木酮糖激酶活性檢測及熱穩(wěn)定性研究

參照文獻[15]測定木酮糖激酶活性。將酶促反應體系分別置于50℃、60℃和70℃，每隔60min測定一次木酮糖激酶活性，以相對酶活力表示。相對酶活力定義為殘留酶活力與未經(jīng)熱處理的初始酶活力之比值。

1.3.6 分析方法

參照《生物信息學》[18]進行生物信息學分析。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和NetPhosBac（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosBac/）對Bc-XK基因及其編碼的氨基酸序列進行理化性質(zhì)分析；采用Prositeexpasy（https：//prosite.expasy.org/）預測Bc-XK基因編碼蛋白的二級結構；采用NCBI-CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/w rpsb.cgi）分析蛋白質(zhì)保守結構域和功能位點；采用SW ISS-MODEL（https：//sw issmodel.expasy.org/interactive）預測高級結構。

從NCBI中選取15株細菌的木酮糖激酶氨基酸序列，使用MEGA X 10.0.5軟件將其與Bc-XK氨基酸序列進行比對分析?；谀就羌っ赴被嵝蛄?，采用最大似然（maximum likelihood，ML）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Timetree數(shù)據(jù)庫（http：//www.timetree.org/）對木酮糖激酶來源物種系統(tǒng)進化地位進行分析。

2 結果與分析

2.1 木酮糖激酶基因Bc-XK的克隆

以B.coagulans IPE22基因組為模板進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。由圖1可知，PCR擴增產(chǎn)物堿基長度約為1 500 bp，與Bc-XK基因的預期片段大小相符合。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR amplification product

2.2 重組酶Bc-XK的表達與純化

重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK經(jīng)IPTG誘導、表達后，對重組酶Bc-XK進行純化和SDS-PAGE分析，結果見圖2。由圖2可知，重組菌E.coli BL21 pET-30a-Bc-XK經(jīng)IPTG誘導表達，獲得重組酶Bc-XK，其分子質(zhì)量為56 kDa，該結果與生物信息學預測結果一致。經(jīng)鎳柱純化后，重組酶Bc-XK條帶單一，達到電泳純，比酶活力為（20.56±3.31）U/mg。

圖2 粗酶液和重組蛋白的SDS-PAGE結果Fig.2 SDS-PAGE results of crude enzyme and recombinant protein

2.3 重組酶Bc-XK的熱穩(wěn)定性研究

B.coagulans IPE22可高溫發(fā)酵木糖生產(chǎn)乳酸，對源于其的重組酶Bc-XK進行溫度穩(wěn)定性研究結果如圖3所示。由圖3可知，Bc-XK在50℃穩(wěn)定性非常好；當溫度為60℃時，重組酶Bc-XK也表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，在180min內(nèi)幾乎沒有活性損失；當溫度為70℃時，孵育180min后，重組酶Bc-XK的相對酶活力為（39±3.1）%。說明重組酶Bc-XK具有良好的熱穩(wěn)定性，在工業(yè)上具有潛在的應用價值[19-20]。并且，可以利用基因工程方法將Bc-XK基因轉(zhuǎn)入其他具備生物煉制能力的細菌或酵母中，實現(xiàn)微生物對木質(zhì)纖維素中葡萄糖或木糖的全利用[21]。

圖3 重組酶Bc-XK的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermalstability of recombinase Bc-XK

2.4 重組酶Bc-XK的生物信息學分析

2.4.1 重組酶Bc-XK的結構分析

將Bc-XK基因的核苷酸序列信息提交至NCBI的Gen-Bank數(shù)據(jù)中，登錄號為MF543361。利用ProtParam對Bc-XK基因進行分析，結果表明，Bc-XK基因含有堿基長度為1 536 bp的一個開放閱讀框，共編碼511個氨基酸（登錄號：ATB56311.1），該基因編碼的蛋白質(zhì)等電點為5.46。

經(jīng)Prosite-expasy和NetPhosBac預測，重組酶Bc-XK為親水蛋白質(zhì)，含有4個N-糖基化位點和多個磷酸化位點?；赑rosite-expasy的蛋白質(zhì)二級結構預測結果顯示，重組酶Bc-XK中α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈含量豐富，分別為38.16%、43.25%和18.59%。

利用NCBI-CDD分析重組酶Bc-XK的保守結構域，結果如圖4A所示。由圖4A可知，重組酶Bc-XK含有多個木酮糖結合位點、金屬結合位點和鎂三磷酸腺苷（magnesium adenosine triphophate，MgATP）結合位點，這與FLANAGAN T等[22]的研究結果一致。同時，重組酶Bc-XK中含有墨角藻糖激酶-葡萄糖酸激酶-甘油激酶-木酮糖激酶（fucolokinase-gluconokinase-glycerolkinase-xylulokinase，F(xiàn)GGY）結構域和氮端核苷酸結合域-糖激酶-熱休克蛋白-肌動蛋白（N-terminalnucleotidebinding domain-sugarkinase-heatshock protein-actin superfam ily，NBD-sugar-kinase-HSP70-actin su-perfamily）超家族結構域。重組酶Bc-XK中具有的FGGY結構域是激酶典型的結構特點，與E.coli中木酮糖激酶類似[23]。NBD-sugar-kinase-HSP70-actin結構域中熱休克蛋白（heatshock protein，HSP）具有輔助熱變性蛋白質(zhì)恢復高級結構的功能，因此，推測重組酶Bc-XK中的HSP結構域可能與其高溫催化特性有關。

使用SWISS-MODEL預測重組酶Bc-XK的高級結構，結果見圖4B。由圖4B清晰可見酶的催化位點：天冬氨酸-8、蘇氨酸-11和天冬氨酸-239。并且，圖4B中也顯示了Bc-XK中底物（木酮糖）結合區(qū)域與催化位點相鄰，這與NCBI-CDD預測結果一致。

圖4 重組酶Bc-XK的保守結構域（A）和高級結構（B）預測結果Fig.4 Forecasted results of conserved domains(A)and advanced structure(B)of recombinase Bc-XK

2.4.2 重組酶Bc-XK的活性位點分析

為了研究蛋白質(zhì)結構與功能的關系，使用ClustalX2軟件將重組酶Bc-XK與海棲熱袍菌（Thermotogamaritima）中的木酮糖激酶Tm-XK、模式生物大腸桿菌（E.coli）中的木酮糖激酶Ec-XK和常見工業(yè)乳酸生產(chǎn)菌短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）中的木糖激酶Lb-XK的氨基酸序列進行比對分析，結果見圖5。

由圖5可知，木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK、Ec-XK和Lb-XK的氨基酸序列相似性分別為38%、38%和57%，且4個木酮糖激酶均含有27個活性位點，包括3個催化位點（見圖4）：天冬氨酸-8、蘇氨酸-11、天冬氨酸-239；2個金屬結合位點：天冬氨酸-8、天冬氨酸-239；7個木酮糖底物結合位點：谷氨酰胺-80、甲硫氨酸-81、組氨酸-82、色氨酸-100、天冬氨酸-239、天冬酰胺-240、甲硫氨酸-294；21個MgATP結合位點：天冬氨酸-8、甘氨酸-10、蘇氨酸-11、絲氨酸-12、絲氨酸-13、賴氨酸-15、天冬氨酸-239、異亮氨酸-259、甘氨酸-260、蘇氨酸-261、甘氨酸-301、酪氨酸-302、亮氨酸-304、絲氨酸-305、苯丙氨酸-317、丙氨酸-318、亮氨酸-320、甘氨酸-402、甘氨酸-403、甘氨酸-404、絲氨酸-407。

圖5 重組酶Bc-XK與其他木酮糖激酶氨基酸序列比對與活性位點分析Fig.5 Am ino acid sequence alignm ent and active sites analysis between recombinase Bc-XK and other xylulose kinase

值得指出的是，木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK雖然都是耐熱木酮糖激酶，但是其氨基酸序列相似性不高。木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK的27個活性位點中存在7個差異位點（絲氨酸-12、異亮氨酸-259、甘氨酸-301、絲氨酸-305、苯丙氨酸-317、丙氨酸-318和亮氨酸-320），且僅涉及MgATP結合位點功能區(qū)域，而其他活性位點（木酮糖結合位點、催化位點和金屬結合位點）均相同。一般而言，決定酶促反應機制的關鍵位點是催化位點[22]。木酮糖激酶Bc-XK與Tm-XK的催化位點完全相同，均為天冬氨酸-8、蘇氨酸-11和天冬氨酸-239。因此，木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK具有類似的催化機制。推測木酮糖激酶Bc-XK和Tm-XK在MgATP結合位點存在的差異僅會導致底物結合能力變化，影響酶的催化反應速度高低。

2.4.3 木酮糖激酶Bc-XK的遺傳學分析

重組酶Bc-XK的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6A。由圖6A可知，16個木酮糖激酶聚為4個類群（I、II、III和IV）。其中，類群I由來自芽孢桿菌屬（Bacillus）的木酮糖激酶組成；類群II和III由來自乳酸細菌的木酮糖激酶組成；類群IV由來自T.maritim e、T.neapolitana和E.coli中的木酮糖激酶組成。為了驗證基于木酮糖激酶氨基酸序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹是否與物種的進化地位一致，基于Timetree數(shù)據(jù)庫，對本研究涉及的14個物種進行分析[24]，結果如圖6B所示。由圖6B可知，涉及的14個物種聚類為4個類群：類群I為包括凝結芽孢桿菌在內(nèi)的5株芽孢桿菌屬細菌；類群II均為乳酸細菌；類群III為E.coli；類群IV為兩種嗜熱細菌（T.maritime和T.neapolitana）。與圖6A結果類似，說明基于木酮糖激酶構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以很好的反映出物種的進化關系。從系統(tǒng)進化和發(fā)育角度而言，雖然Bc-XK不是一個嶄新的催化酶，但是其具有良好的高溫催化能力和優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，在工業(yè)上亦具有廣闊的應用價值。

圖6 基于木酮糖激酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（A）和基于物種的時間樹（B）Fig.6 Phylogenetic tree based on am ino acid sequence ofxylulose kinase(A)and time tree based on species(B)

2.5 基于生物信息學分析木酮糖激酶Bc-XK熱穩(wěn)定性機理

有研究報道，耐熱蛋白質(zhì)富含帶電氨基酸殘基；高級結構中α-螺旋結構較多且肽鏈長；與α-螺旋形成有關的丙氨酸含量高；富含金屬離子結合位點等[25-26]。通過生物信息學分析可知，木酮糖激酶Bc-XK中帶電氨基酸（精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）共有112個，占總氨基酸數(shù)量21.92%；分子中易于形成α-螺旋的丙氨酸含量位于所有氨基酸組成的第3位，比例為7.80%；高級結構中α-螺旋含量較高，且含有2個金屬結合位點。因此，木酮糖激酶Bc-XK具有較好的熱穩(wěn)定性。

3 結論

菌株B.coagulans IPE22中的木酮糖激酶基因Bc-XK與載體pET-30a連接后，成功在E.coli BL21（DE3）中誘導表達。重組酶Bc-XK經(jīng)純化后，比酶活力為（20.56±3.31）U/mg。該酶熱穩(wěn)定性好，可以在60℃保持活力180min以上。生物信息分析結果顯示，基因Bc-XK含有一個1 536bp的開放閱讀框，共編碼511個氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)為親水蛋白，分子質(zhì)量為56 kDa，等電點為5.46，二級結構中α-螺旋、無規(guī)卷曲和延伸鏈含量豐富，3個催化位點為天冬氨酸-8、蘇氨酸-11、天冬氨酸-239。氨基酸序列比對和聚類分析結果顯示，不同細菌來源的木酮糖激酶具有高度保守的3個催化位點，且基于木酮糖激酶構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以很好的反映出物種的進化關系。