梁 振，張 元，朱明堅，白衛(wèi)東，2*，周子燁，蘇家杰

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點實驗室，廣東 廣州 510225）

黑糯米酒在我國有著悠久的釀造和飲用歷史，其富含礦物質(zhì)元素、γ-氨基丁酸和黃酮類化合物等，具有預(yù)防老年癡呆等功效[1]。此外，黑糯米酒中的花色苷類物質(zhì)增強(qiáng)了黑糯米酒的抗氧化能力，同時也使得黑糯米酒的顏色與眾不同[2]。

目前，對于花色苷測定方法的研究較多，其中以pH示差法、單一pH法和差減法的應(yīng)用較為普遍，但精密度差異較大。翦祎等[3]比較了以上3種方法測定干紅葡萄酒花色苷結(jié)果的差異性，發(fā)現(xiàn)3種方法的測定結(jié)果無顯著差異。唐琳等[4]對單一pH法和pH示差法測定玫瑰花花色苷的方法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)單一pH法受溶劑影響較大，測定時必須在同一溶劑中進(jìn)行；pH示差法的準(zhǔn)確性較高，但測定時要保證樣品吸光度值在0.2以上?；袅樟盏萚5]比較了直接分光光度法和pH示差法，發(fā)現(xiàn)兩種方法無顯著差異?；ㄉ諟y定方法的選定是花色苷后續(xù)研究的基礎(chǔ)，以黑糯米酒花色苷為研究對象，通過對以上3種測定方法進(jìn)行綜合比較，得到黑糯米酒花色苷測定最佳方法和最優(yōu)條件，給后續(xù)黑糯米花色苷測定提供一些有益的參考。

由于在黑糯米酒的發(fā)酵、陳釀以及貯藏等過程中，其花色苷種類和含量會隨發(fā)酵微環(huán)境、介質(zhì)溫度、外界光照等變化而發(fā)生改變，而且花色苷的組成較為復(fù)雜，其最大吸收波長始終處于動態(tài)變化的過程中，因此，一般均選用花色苷標(biāo)準(zhǔn)品來表示黑糯米酒中總花色苷含量。矢車菊素在自然界中分布最為廣泛且含量最為豐富[6]，相關(guān)研究表明，黑糯米種皮中富含矢車菊-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside），而且矢車菊素在黑糯米酒中含量較高[7-8]，因此以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品來表示黑糯米酒總花色苷。通過對黑糯米酒花色苷的測定方法的研究，以期得到一種適合黑糯米酒總花色苷測定的方法，對更深入地研究花色苷有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑糯米、酒曲：貴州永紅酒廠提供；黑糯米酒：實驗室自釀。

檸檬酸、檸檬酸三鈉、亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯化鉀、三水合乙酸鈉、氫氧化鈉、葡萄糖（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純）：大豐市俐科發(fā)特種化學(xué)試劑廠；矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

緩沖液（pH 0.5～2.0：將HCl逐滴滴入0.1mol/L檸檬酸；pH 0.8緩沖液0.2mol/L KCl∶0.3mol/L HCl=29∶40；pH 4.5緩沖液0.2mol/L NaAc·3H2O：0.2mol/LHAc=1∶1；pH 3.0緩沖液0.1mol/L檸檬酸∶0.1mol/L檸檬酸鈉=82∶18；pH 4.0緩沖液0.1mol/L檸檬酸∶0.1mol/L檸檬酸鈉=59：41；pH 5.0緩沖液0.1mol/L檸檬酸∶0.1mol/L檸檬酸鈉=35∶65；pH 6.0緩沖液0.1mol/L檸檬酸∶0.1mol/L檸檬酸鈉=12∶88）。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SP-02恒溫培養(yǎng)箱：黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海泰坦科技股份有限公司；PB-10酸度計：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑糯米酒花色苷測定波長的選定

配制質(zhì)量濃度為500mg/L的矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中吸取1m L用去離子水稀釋6倍，再吸取1m L稀釋后溶液并用pH 0.8緩沖液定容至10m L。以pH 0.8緩沖液作為空白，于波長350～710 nm區(qū)間對酒樣進(jìn)行全波段掃描，確定其最大吸收波長，并測定吸光度值。

1.3.2 測定條件選定

緩沖液pH的選定：在11支比色管中各加入1m L的酒樣，再加入9m L pH為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0的緩沖溶液，30℃恒溫水浴平衡40m in后，以去離子水作為空白，測定其最大吸收波長處吸光度值。

平衡溫度和平衡時間的選定：向6個100m L容量瓶中加入酒樣10m L，其中3個容量瓶中加入pH 0.8緩沖溶液并定容至100m L，另外3個容量瓶中加入pH4.5緩沖溶液并定容至100m L。分別置于20℃、30℃、40℃的水浴鍋中，每隔20min在波長511 nm條件下測定吸光度值。

1.3.3 矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將500mg/L的花色苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液用去離子水分別稀釋2、4、6、8、10、20、40倍（質(zhì)量濃度分別為250mg/L、125mg/L、83.33mg/L、62.5mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L），從中各吸取1m L并用pH 0.8緩沖液定容至10m L，在30℃恒溫水浴平衡40min，以pH 0.8的緩沖溶液作為空白，在波長350～710 nm區(qū)間對樣品進(jìn)行全波段掃描，并記錄曲線。在最大吸收波長處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 3種方法測定黑糯米酒總花色苷

pH示差法：分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0m L酒樣于10個10mL容量瓶中，設(shè)A、B兩組平行。A組：加入pH 0.8的緩沖液并定容，B組：加入pH 4.5的緩沖液并定容。于30℃恒溫水浴平衡40min后，以去離子水作為空白，在波長511 nm和700 nm處測定其吸光度值[9-10]。

單一pH法：分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0m L酒樣于10個10m L容量瓶中，再用pH 0.8緩沖液定容。于30℃恒溫水浴平衡40m in后，以去離子水作為空白，在波長511 nm和700 nm處測定吸光度值。

差減法：分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0m L酒樣于10個10m L容量瓶中，再用pH 0.8的緩沖液定容。另外量取上述相同體積的酒樣于10個10m L容量瓶中，添加0.8m L20%的Na2SO3溶液，再用pH 0.8的緩沖液定容至10m L。置于30℃水浴鍋中平衡40min后，以去離子水作為空白，在波長511 nm和700 nm處測定吸光度值。

1.3.5 總花色苷計算方法

pH示差法[9-10]測定花色苷含量公式：

式中：A=Aλmax；M w為矢車菊-3-O-葡萄糖苷分子量，449.38g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊-3-O-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）-1；I為比色杯光程/1cm；A1和A2分別為使用亞硫酸鈉漂白前和漂白后所測得的酒液吸光度值；k為用矢車菊-3-O-葡萄糖苷繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.3.6 黑糯米酒酒精含量對測定結(jié)果的影響

用無水乙醇配制酒精含量為20%vol、40%vol、60%vol、80%vol、100%vol的酒精溶液。分別吸取1m L酒樣于18個10m L容量瓶中，各加入1m L上述酒精，并分為A、B、C共3組，每組6個。向A組和B組容量瓶中分別加入pH 0.8和pH 4.5的緩沖液并定容，向C組中先添加0.8m L 20%亞硫酸鈉溶液，再用pH 0.8的緩沖溶液定容。將這18個容量瓶放入30℃水浴鍋中，40min后，以去離子水作為空白，于波長511 nm和700 nm處測定吸光度值。

1.3.7精密度和加標(biāo)回收率試驗

吸取2m L酒樣于3個20m L容量瓶中，往其中2個容量瓶中分別加入pH 0.8和pH 4.5的緩沖溶液并定容，向剩下1支容量瓶先加入1.6m L 20%的亞硫酸鈉溶液，再用pH 0.8緩沖液定容。于30℃恒溫處理40m in后，以去離子水為空白，于波長511 nm和700 nm處測定吸光度值。

分別從已知花色苷濃度黑糯米酒中吸取1m L至兩個容量瓶里，然后用pH 0.8的緩沖溶液定容至10m L，向其中一個容量瓶中再添加1m L稀釋6倍的矢車菊-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于30℃恒溫處理40min，以去離子水作為空白，于波長511 nm和700 nm處測定吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑糯米酒花色苷的光譜特性

圖1 矢車菊-3-O-葡萄糖苷的紫外可見吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectra of cyanidin-3-O-glucoside

從圖1可以看出，波長350～511 nm處吸光度值不斷增大，直至511 nm附近趨于穩(wěn)定；波長511～600 nm處吸光度顯著降低，波長600～710 nm處吸光度值基本保持在0附近。當(dāng)波長為511 nm附近時，矢車菊-3-O-葡萄糖苷出現(xiàn)強(qiáng)烈的吸收峰（吸光度值為0.402），因此選定最大吸收波長λmax=511 nm作為黑糯米酒花色苷的測定波長。盧鈺等[11-12]也選用矢車菊-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)樣，最大吸收波長為520 nm。

2.2 測定條件選定

2.2.1 緩沖液pH的選定

由于自身結(jié)構(gòu)特性，花色苷只有在pH＜7的環(huán)境中保持穩(wěn)定，故僅需考察緩沖溶液pH＜7的條件下花色苷的吸光度值[3]。從圖2可以看出，在pH=0.8時吸光度值最高，在pH=4.5時所測得的吸光度值最低，pH＞4.5時所測得吸光度值基本不變，原因可能是pH＞4.5時花色苷在波長511 nm處無吸收并且轉(zhuǎn)化成無色結(jié)構(gòu)。pH示差法中，兩個pH條件下的吸光度值差距最大且能保持穩(wěn)定，通過這兩個示差pH可計算得到花色苷含量[13]。黑糯米酒花色苷在pH值為0.8和4.5時的吸光度值的差值是最大的，并且在pH 0.8和pH 4.5左右的吸光度浮動較小，所以本實驗選擇緩沖液pH 0.8和pH 4.5來檢測黑糯米酒樣品花色苷的吸光度值。

圖2 緩沖液pH值對花色苷的影響Fig.2 Effect of buffer solution pH on anthocyanin

2.2.2 平衡溫度和平衡時間的選定

花色苷溶液加入pH緩沖液后，需要放置一段時間，待達(dá)到平衡之后方可用于檢測[14]。研究顯示，花色苷在高于40℃的介質(zhì)中穩(wěn)定性很差[15]，所以選擇在低于40℃條件下進(jìn)行平衡。

圖3 pH值為0.8（A）、pH值為4.5（B）時平衡溫度、時間對花色苷影響Fig.3 Effect of equilibrium temperature and time on anthocyanin at pH 0.8(A)and 4.5(B)

由圖3可知，在pH 0.8的緩沖介質(zhì)中，20℃和30℃條件下，樣品的吸光度值隨時間延長整體呈上升趨勢，40min后慢慢趨于平緩，其中30℃條件下的吸光度值始終高于20℃的吸光度值。40℃條件下吸光度值隨著時間延長吸光度值先增加，但在40min時達(dá)到平衡后減少，60min后趨于平緩。在pH 4.5緩沖介質(zhì)中，20℃、30℃、40℃條件下的吸光度值隨著時間延長整體呈下降趨勢，分別在60min、40min和60m in后逐漸趨于平緩。其中，在40℃條件下，20m in時達(dá)到平衡一段時間后繼續(xù)呈下降趨勢，可能是由于花色苷被O2氧化，從而影響了吸光度值。

綜上所述，當(dāng)3個溫度最后達(dá)到平衡時，黑糯米酒花色苷在30℃條件下，在不同pH值緩沖液的吸光度差值最大且最穩(wěn)定，并于40min時基本呈穩(wěn)定狀態(tài)，因此平衡溫度和時間選定為30℃、40min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.044 9x+0.02，R2=0.996 4，表明矢車菊-3-O-葡萄糖苷質(zhì)量濃度在11.39～221.72mg/L范圍內(nèi)，與溶液的吸光度值呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)。

2.4 3種總花色苷測定方法的比較

由圖4可知，3種測定方法曲線均呈現(xiàn)出良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，表明3種方法都可以檢測黑糯米酒中的總花色苷。

圖4 pH示差法（A）、單一pH法（B）、差減法（C）測總花色苷含量比較Fig.4 Comparison of totalanthocyanin content determ ined by pH differentialmethod(A),single pH method(B)and subtraction method(C)

2.5 酒液pH對測定結(jié)果的影響

由圖5可知，酒液pH為4時，3種方法所測得的花色苷吸光度值均為最大值，并且酒液pH4附近時所測得的吸光度值差距很小。酒液pH為1和6時，3種方法所測得的吸光度值低于其他pH條件下吸光度值。綜上所述，用3種方法測定酒液樣品吸光度值時，首先要保證所測的酒液樣品pH在4附近（pH為3～5）。經(jīng)測定，所用黑糯米酒的pH值為3.70，在其范圍內(nèi)，因此不需調(diào)整pH。

圖5 酒液pH值對3種方法測定結(jié)果的影響Fig.5 Effectofwine pH on determ ination results of three kinds ofmethods

2.6 黑糯米酒乙醇體積分?jǐn)?shù)對測定結(jié)果的影響

由圖6可知，3種方法所得結(jié)果的曲線沒有明顯的變化趨勢，而且差距不大。單一pH法、pH示差法、差減法測定黑糯米酒花色苷吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為0.010、0.009 9、0.004 4。可見黑糯米酒中的酒精含量基本不影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，可以不計加熱時乙醇揮發(fā)對測定結(jié)果帶來的影響。

圖6 酒精含量對3種方法測定結(jié)果的影響Fig.6 Effect of alcohol content on determ ination results of three kinds ofmethods

2.7 3種方法精密度試驗

采用優(yōu)化后pH示差法、單一pH法和差減法對樣品重復(fù)測6次，從表1可知，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.83%、1.60%和1.24%，表明這3種方法測定黑糯米酒花色苷的精密度良好，其中pH示差法精密度最高。

單一pH法比另外兩種方法的操作更加簡便、步驟更少、數(shù)據(jù)處理相對較簡易，在花色苷定量檢測中應(yīng)用廣泛[16]，但存在不全面、方向單一，針對性不強(qiáng)等缺點。此外，在精密度試驗中單一pH法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最高為1.60%，精密度相對另外兩種方法稍差。

表1 3種方法精密度試驗結(jié)果Table 1 Precision test results of three kinds ofmethods

pH示差法和差減法的優(yōu)勢在于儀器廉價，操作簡單，實用性強(qiáng)。由于差減法需要用到漂白劑，操作過程相對比較復(fù)雜，容易造成誤差。此外，漂白劑的添加會使得干擾物的吸光度值下降，導(dǎo)致最終結(jié)果比實際值偏大，偏差相對較大[17]。pH示差法方便、快捷、精確，適用于有干擾物的溶液中花色苷檢測，可以排除非花色苷類物質(zhì)對測定結(jié)果的影響[18]。王穎等[19-20]均使用該方法對有色馬鈴薯總花色苷進(jìn)行檢測。因此選擇pH示差法對黑糯米酒花色苷測定。2.8 pH示差法加標(biāo)回收率試驗

表2 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of standard recovery rate test

由表2可知，加標(biāo)回收率平均值達(dá)98.60%，RSD為0.38%，表明該優(yōu)化條件后的方法可靠、準(zhǔn)確，適用于黑糯米酒中總花色苷測定。

3 結(jié)論

對黑糯米酒花色苷的測定方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，pH示差法、單一pH法和差減法所測標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.997 7、0.998 5、0.999 4，線性關(guān)系較好，均可用于測定黑糯米酒中總花色苷含量。3種方法測定黑糯米酒花色苷的平衡溫度為30℃，平衡時間為40min，測定波長為511 nm。單一pH法和差減法的最適pH為0.8，pH示差法最適pH為0.8和4.5。3種方法可直接測定黑糯米酒總花色苷含量，且精密度良好，其中pH示差法精密度最高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.83%。pH示差法加標(biāo)回收率試驗結(jié)果RSD為0.38%，表明該優(yōu)化條件后的方法可靠、準(zhǔn)確，適用于黑糯米酒中總花色苷測定。