趙成萍，上官李娜，張沛然，宋艷波*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

黑曲霉（Aspergillusniger）屬于真核生物子囊菌亞門絲孢目叢梗孢科，是一種常見的曲霉屬真菌[1-2]。黑曲霉作為發(fā)酵微生物，在酶制劑生產(chǎn)、有機(jī)酸發(fā)酵及污水處理等方面具有廣泛用途。黑曲霉具有高效的蛋白表達(dá)和修飾能力，在酶制劑工業(yè)上用來生產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、糖化酶和脂肪酶等多種酶類[3]。KANG X等[4]研究表明，黑曲霉通過生物質(zhì)自然真菌培養(yǎng)系統(tǒng)，可使土壤和污水中的稀土元素達(dá)到生物轉(zhuǎn)化和生物恢復(fù)的目的。菌絲球是絲狀真菌培養(yǎng)過程中形成的松散且不規(guī)則、致密或光滑的球形、近球形微生物顆粒，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)各不相同[5]。菌絲球按形態(tài)可分為松散型、緊密型和空心菌絲球，目前菌絲球的形成機(jī)理已有大量研究[6-8]。在菌絲球形成的過程中，大多數(shù)絲狀真菌以凝集型和非凝集型兩種方式形成菌絲球，黑曲霉以凝集型方式形成菌絲球的過程中，培養(yǎng)初期孢子通過聚集形成孢子團(tuán)，孢子團(tuán)萌發(fā)的菌絲進(jìn)一步交織纏繞形成菌絲球[9]黑曲霉在浸沒條件發(fā)酵可通過懸浮菌絲或菌絲球存在[10]，絲狀體菌絲在發(fā)酵過程中會使培養(yǎng)基黏度增加，顯著降低營養(yǎng)運(yùn)輸和生產(chǎn)效率[11-13]。因此，菌絲球的形成可降低介質(zhì)黏度和攪拌能源消耗，提高氧轉(zhuǎn)移效率，是發(fā)酵工業(yè)中絲狀真菌的理想形態(tài)[14]，菌絲球形成過程中受到碳源、氮源種類及濃度、微量元素、溫度、pH值及溶解氧等諸多因素影響[15-16]。雷德柱等[17]研究表明，菌絲在不同培養(yǎng)階段所需底物不同，菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化；丁樂洪等[18]通過顯微圖像技術(shù)對產(chǎn)黃青霉的菌絲形態(tài)進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步分析了發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)、菌絲總長度、菌絲生長期等變化規(guī)律。BIZUKOJCM等[20]研究表明，孢子接種量對菌絲球形成和大小具有重要影響，培養(yǎng)基中添加表面活性劑（Tween-80、Triton X-100）時，菌絲球直徑顯著下降。pH對菌絲體成球也具有顯著影響，冬蟲夏草菌絲體在培養(yǎng)過程中，當(dāng)pH=6.0時，可形成直徑約1.8mm大小均勻、表明光滑的菌絲球[21]。SARASWATHY A等[22]研究發(fā)現(xiàn)，青霉菌可利用難降解的芘作為碳源形成菌絲球。本試驗(yàn)以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；通過對不同培養(yǎng)基碳源種類（蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉）、pH值、外源添加物（玻璃珠和吐溫-80）等培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化，研究各因素對黑曲霉菌絲生長的影響，從而確定黑曲霉生長和發(fā)酵的最適條件，為后期黑曲霉的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

黑曲霉（Aspergillusniger）M 011.9：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 化學(xué)試劑

瓊脂（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；硝酸鈉、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津北辰方正試劑廠；硫酸鎂（分析純）：天津天力化學(xué)試劑有限公司；氯化鉀（分析純）：天津鼎盛鑫科技有限公司；硫酸亞鐵（分析純）、蔗糖（分析純）、可溶性淀粉（生化試劑）、葡萄糖（分析純）：天津化學(xué)試劑三廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30.0 g，加熱溶解于1 000m L蒸餾水中，115～116℃高壓滅菌30min。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-75HD高壓滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備公司；STARTER3100 pH計(jì)：臺灣衡欣科技股份有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：天津泰斯特儀器公司；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥箱：廣州博訊儀器設(shè)備廠；E100顯微鏡：日本尼康公司；BSA223S電子天平：德國賽多利斯科學(xué)儀器公司；74mm×33mm×5mm血球計(jì)數(shù)板：南昌科偉儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑曲霉活化

黑曲霉（Aspergillusniger）M 011.9于5～10℃的環(huán)境解凍，體積分?jǐn)?shù)為75%酒精洗脫棉擦凈，用無菌吸管吸取0.1m L菌體懸浮液，注入制定的察氏液體培養(yǎng)基內(nèi)3～4m L，然后在37℃培養(yǎng)。

1.3.2 孢子懸液制備

超凈臺中用無菌水沖洗活化的黑曲霉菌的固體平板，并用涂布器輕刮表面使菌體充分洗脫，洗脫液倒于無菌三角瓶中高溫滅活處理；用無菌的三層紗布（121℃滅菌20min）過濾菌液，移液器充分吹打使孢子呈均勻分散狀態(tài)，得到孢子懸液，血球板計(jì)數(shù)孢子數(shù)。

1.3.3 培養(yǎng)基碳源的篩選

察氏培養(yǎng)基中分別加入濃度均為1mol/L蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖各10m L，混勻，分設(shè)平行試驗(yàn)組（n=3）；高溫滅菌后（121℃滅菌20min），斜面接種法接種孢子懸液100μL，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，每12 h，10倍目鏡40倍物鏡下觀察并記錄生長狀況。

1.3.4 培養(yǎng)基pH值的選擇

用HCl和NaOH標(biāo)準(zhǔn)液分別調(diào)節(jié)察氏培養(yǎng)基的pH值為3.0、8.0、10.0，設(shè)平行試驗(yàn)組（n=8）；高溫滅菌后接種孢子懸液，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，每12h觀察并記錄生長狀況。

1.3.5 培養(yǎng)基外源添加物的篩選

分別將玻璃珠和Tween-80加入察氏培養(yǎng)基，以無任何添加察氏培養(yǎng)基為空白對照，設(shè)平行試驗(yàn)組（n=3）；高溫滅菌后接種孢子懸液，培養(yǎng)，每12 h觀察并記錄生長狀況。

1.3.6 菌株生長狀況分析

在培養(yǎng)0～48h期間，每隔12h，分別取按1.3.3～1.3.5節(jié)培養(yǎng)的黑曲霉培養(yǎng)液，吹打混勻，無菌條件下吸取0.3mL含有孢子的液體滴于載玻片上，10倍目鏡、40倍物鏡下觀察并采集圖像；48 h菌絲肉眼可見，無菌條件下接種環(huán)輕挑菌絲球于載玻片上，40倍鏡下觀察并采集圖像。每組隨機(jī)挑取10個菌絲球，平鋪成直線后濾紙輕吸水分，直尺測量長度。每組隨機(jī)挑取10個菌絲球，濾紙輕吸水分后置于60℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用SPSSV18.0對各指標(biāo)進(jìn)行方差分析，差異顯著性以P＜0.05水平表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源培養(yǎng)基菌絲生長狀況

不同蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉察氏培養(yǎng)基，分別在接種孢子懸液后0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h于40倍物鏡下觀察菌絲生長狀況，結(jié)果見圖1～圖3。由圖1可知，以蔗糖為碳源時，培養(yǎng)時間＜12 h無顯著變化（圖1a）；培養(yǎng)12～24 h孢子萌發(fā)，培養(yǎng)24 h時菌絲伸長（圖1b～c）；培養(yǎng)36 h時菌絲繼續(xù)伸長，產(chǎn)生新生分支，且開始纏繞（圖1d）；培養(yǎng)48 h時菌絲分支增多，生長旺盛，生長量增大（圖1e）；培養(yǎng)60 h形成菌絲球，外表不光滑（圖1f）。由圖2可知，以葡萄糖為碳源時，培養(yǎng)時間＜12 h無顯著變化（圖2a），培養(yǎng)12～24h孢子萌發(fā)，培養(yǎng)24h時菌絲伸長（圖2b～c），但萌發(fā)速度較以蔗糖為碳源時慢；36h菌絲纏繞，產(chǎn)生分支較少（圖2d）；培養(yǎng)48 h菌絲生長量增大（圖2e），但比以碳源為蔗糖時的菌絲量要大；60 h形成菌絲球，球徑較大，外表光滑（圖2f）。由圖3可知，以可溶性淀粉為碳源時，培養(yǎng)時間＜12 h無顯著變化（圖3a），培養(yǎng)12～24h孢子萌發(fā)，培養(yǎng)24h時菌絲伸長（圖3b～c），菌絲相比以蔗糖和葡萄糖為碳源時要粗大；培養(yǎng)36 h菌絲產(chǎn)生分支（圖3d）；培養(yǎng)48 h菌絲纏繞，生長旺盛（圖3e）；培養(yǎng)60 h菌絲未成球，依然為分散的絲狀（圖3f）。

圖1 蔗糖為碳源察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.1 Mycelium grow th situation in Czapek'sm edia with sucrose as carbon source

圖2 葡萄糖為碳源察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.2 Mycelium grow th situation in Czapek's media with glucose as carbon source

圖3 可溶性淀粉為碳源察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.3 Mycelium grow th situation in Czapek'smedia with soluble starch as carbon source

取上述不同碳源察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)60 h的菌絲球，測定菌絲球的干質(zhì)量和直徑，結(jié)果見表1。由表1可知，蔗糖和葡萄糖碳源組菌絲球干質(zhì)量和直徑分別為0.018 g、0.147 cm和0.023 g、0.155 cm，二者無顯著差異（P＞0.05），且均顯著高于可溶性淀粉組（P＜0.05）。

表1 60 h不同碳源察氏培養(yǎng)基中菌絲球的干質(zhì)量和直徑Table 1 Drymass and diameter ofmycelium pellets in Czapek's media with different carbon sources for 60 h

綜上所述，黑曲霉在不同碳源的察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)時菌絲生長狀況存在著一定差異。例如以蔗糖為碳源的菌絲在相同時間，生長量較大、但菌絲球形態(tài)不如以葡萄糖為碳源的菌絲，而以可溶性淀粉為碳源的菌絲相同時間生長量較小、粗壯但未形成球狀。因此，葡萄糖為黑曲霉菌絲的生長的最適宜碳源。

2.2 不同pH培養(yǎng)基菌絲生長狀況

在察氏培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH值至3.0、8.0、10.0，接種孢子懸液后不同時間鏡檢觀察菌絲生長狀況，結(jié)果見圖4～圖6。由圖4可知，培養(yǎng)基pH值為3.0時，培養(yǎng)時間＜12 h無明顯變化（圖4a），培養(yǎng)12～24 h孢子萌發(fā)（圖4b～c），36 h菌絲繼續(xù)生長，并未形成分支（圖4d），48 h菌絲生長旺盛，交叉纏繞，生長量增大（圖4e）；60 h形成菌絲球，外表光滑，直徑較大（圖4f）。由圖5可知，pH值為8.0時，培養(yǎng)時間＜12 h無明顯變化（圖5a），培養(yǎng)12～24 h孢子萌發(fā)（圖5b～c），36 h菌絲繼續(xù)生長，開始纏繞（圖5d）；48 h菌絲生長狀況較pH值為3.0條件下旺盛（圖5e）；60 h菌絲未形成菌絲球，而是絲狀形態(tài)（圖5f）。由圖6可知，pH值為10.0時，培養(yǎng)時間＜12 h無明顯變化（圖6a），培養(yǎng)12～24 h孢子萌發(fā)，變形（圖6b～c），36 h菌絲生長，產(chǎn)生新生分支（圖6d）；48 h菌絲生長旺盛，交織成網(wǎng)狀（圖6e）；60 h依然為絲狀，較pH值為8.0條件下形成的絲狀菌團(tuán)小（圖6f）。

圖4 pH值為3.0察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.4 Mycelium grow th situation in Czapek'smedia with pH 3.0

圖5 pH值為8.0察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.5 Mycelium grow th situation in Czapek'smedia with pH 8.0

圖6 pH值為10.0察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.6 Mycelium grow th situation in Czapek's media with pH 10.0

取上述不同pH值察氏培養(yǎng)基下培養(yǎng)60 h的菌絲球，測定菌絲球的干質(zhì)量和直徑，結(jié)果見表2。由表2可知，培養(yǎng)基pH值為8.0時，菌絲球干質(zhì)量和直徑均最大，分別為0.018 g、0.147 cm，且均顯著高于其他兩組（P＜0.05）；培養(yǎng)基pH值為10.0時，菌絲球干質(zhì)量和直徑均最小。

表2 不同pH察氏培養(yǎng)基中菌絲球的干質(zhì)量與直徑Table 2 Dry mass and diameter ofmycelium pellets in Czapek's media with different pH

綜上所述，黑曲霉在不同pH值察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)時菌絲生長狀況存在著一定差異，在不同pH培養(yǎng)基條件下均可形成菌絲球，在pH值為8.0時形成的菌絲球直徑較大，且比較均勻；在pH值為3.0和10.0時多形成絮狀菌絲，菌絲生長狀態(tài)最好。因此，黑曲霉菌絲生長的最適培養(yǎng)基pH值為8.0。

2.3 培養(yǎng)基不同添加物對菌絲生長的影響

添加物選用玻璃珠和吐溫-80是由于其外表光滑不影響黑曲霉菌絲的生長，還可以改善菌絲球均勻程度和緊密程度。察氏培養(yǎng)基添加葡萄糖為碳源，培養(yǎng)基初始pH值為8.0，在培養(yǎng)基中添加玻璃珠和Tween-80后不同時間鏡檢觀察菌絲生長狀況，結(jié)果分別見圖7和圖8。由圖7可知，培養(yǎng)基添加玻璃珠時，培養(yǎng)時間＜12 h之前無顯著變化（圖7a），培養(yǎng)12～24 h孢子開始萌發(fā)（圖7b～c）；36 h菌絲產(chǎn)生分支并纏繞在一起（圖7d）；48 h菌絲生長旺盛（圖7e）；60 h形成菌絲球，外表不光滑，內(nèi)部松散（圖7f）。由圖8可知，培養(yǎng)基添加Tween-80的條件下，培養(yǎng)時間＜12 h之前無顯著變化（圖8a），培養(yǎng)12～24 h菌絲開始萌發(fā)（圖8b～c），但萌發(fā)速度較添加玻璃珠時要慢；36 h菌絲繼續(xù)生長，未產(chǎn)生分支，且菌絲較粗大（圖8d）；48 h菌絲纏繞（圖8e），60 h形成菌絲球，外表光滑，內(nèi)部緊實(shí)（圖8f）。

圖7 添加玻璃珠察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.7 Mycelium grow th situation in Czapek's media with glass beads as additive

圖8 添加Tween-80察氏培養(yǎng)基中菌絲的生長狀況Fig.8 Mycelium grow th situation in Czapek's media with Tween-80 as additive

取上述培養(yǎng)基中添加玻璃珠和Tween-80后培養(yǎng)60 h的菌絲球測定干質(zhì)量和直徑，結(jié)果見表3。由表3可知，培養(yǎng)基添加玻璃珠和Tween-80后，菌絲球干質(zhì)量和直徑均顯著低于對照組（P＜0.05）；培養(yǎng)基添加玻璃珠后，菌絲球干質(zhì)量和直徑與Tween-80組均不存在顯著差異（P＞0.05），但干質(zhì)量和直徑均低于Tween-80組。

表3 不同添加物察氏培養(yǎng)基中菌絲球的干質(zhì)量與直徑Table 3 Dry mass and diameter ofmycelium pellets in Czapek's media with different additives

綜上所述，黑曲霉在外源添加物培養(yǎng)時菌絲生長狀況存在著一定差異，表明培養(yǎng)基中不同添加物和劑量可顯著促進(jìn)菌絲生物量的提高和次生代謝產(chǎn)物的合成。加入玻璃珠和Tween-80后，菌絲球生長趨勢和生長狀況基本一致，與對照組相比，孢子萌發(fā)速度減慢。因此，黑曲霉菌絲生長的最適外源添加物為吐溫-80。

3 討論

在傳統(tǒng)酶制劑發(fā)酵和新酶生產(chǎn)方面，黑曲霉在眾多微生物表達(dá)系統(tǒng)中具有明顯優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)和污水處理企業(yè)。黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)具有較強(qiáng)的蛋白合成后加工能力，具備好氧微生物生存力強(qiáng)、生長迅速、代謝旺盛等特點(diǎn)；同時，黑曲霉菌絲發(fā)達(dá)，分枝較多，通過孢子生殖方式使分生孢子梗從膨大的菌絲上生出，確保其在不同條件下快速增殖，并分泌表達(dá)多種蛋白[14]。黑曲霉在浸沒條件發(fā)酵可通過懸浮菌絲或菌絲球存在[15]。研究表明，絲狀體菌絲在發(fā)酵過程中會使培養(yǎng)基黏度增加，顯著降低營養(yǎng)運(yùn)輸和生產(chǎn)效率[16-18]。因此，菌絲球的形成可降低介質(zhì)黏度和攪拌能源消耗，提高氧轉(zhuǎn)移效率，是發(fā)酵工業(yè)中絲狀真菌的理想形態(tài)[19]。

4 結(jié)論

通過選擇在察氏培養(yǎng)基不同pH、不同碳源和不同外援添加物的培養(yǎng)條件下，觀察黑曲霉菌絲生長狀況，并測定菌絲球干質(zhì)量和直徑，確定黑曲霉菌絲最適生長條件為：在發(fā)酵溫度為28℃，孢子濃度為4.7×106個/m L，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min條件下，黑曲霉菌絲生長的察氏培養(yǎng)基中最佳碳源為葡萄糖，最適pH值為8.0，最佳外源添加物為吐溫-80，在此狀態(tài)下形成的菌絲分枝較多，菌絲生物量大。目前對黑曲霉菌絲不成球的影響機(jī)理研究較少，隨著研究技術(shù)的改進(jìn)和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，利用計(jì)算機(jī)及顯微圖像分析技術(shù)對絲狀真菌的生長狀況進(jìn)行定量分析和檢測，必將為黑曲霉發(fā)酵工業(yè)的深入研究和廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支持。