吳曉宗，王 巖

（1.鄭州大學化工與能源學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia Solanacearum）引起的土傳病害，它的發(fā)生不僅與高溫高濕的氣候有關，還與土壤種類、土壤養(yǎng)分、連作情況、移栽時期、田間管理等有關，難以有效防治［1-3］。近年來，人們選育出對病原菌具有拮抗效果的微生物制成生物有機肥，用來防治土傳病害，不僅能增加土壤中有益微生物數量，增強煙株抗病性，還能改善根際微生態(tài)環(huán)境，促進根系生長和對養(yǎng)分的吸收，在防病的同時還可以改善和修復土壤生態(tài)環(huán)境，減少化肥和農藥的使用，突破了傳統有機肥的肥料效果，受到了廣泛的重視［4-5］。

土壤微生物多樣性用于表征土壤微生物群落結構的變異、相互作用、營養(yǎng)水平和組成數量變化，能較早地反映土壤生態(tài)的變化過程，通過調控土壤微生物群落以及改變土壤微生物功能多樣性可以抑制作物病蟲害［6-7］。近年來發(fā)展起來的宏基因組學利用分子生物學的研究方法繞過傳統的培養(yǎng)方法來研究微生物的多樣性及功能，為土壤微生物研究開辟了新的道路［8-9］。

實驗室已從福建省邵武市青枯病發(fā)病嚴重的原位土壤中篩選出拮抗菌［10］，并利用該拮抗菌制成生物肥［11］。本研究考查了該生物肥施用后對煙草青枯病的防治效果，利用高通量宏基因組測序法研究土壤微生物多樣性特征差異，揭示生物肥對土壤微生物多樣性影響以及和防治青枯病之間的內在關系，為生物防治煙草青枯病提供進一步的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

2014年3月至8月在邵武市徐溪村青枯病常發(fā)煙田進行試驗，該地塊于2012、2013年連續(xù)兩年青枯病發(fā)病非常嚴重。試驗共設置2個處理，采用完全隨機區(qū)組設計，重復3次，共6個小區(qū)，小區(qū)面積固定為132 m2，設有保護行，煙株種植密度為16 500株/hm2，行間距為0.5 m×1.2 m。

在植煙移苗前進行施肥，采用分層施肥的方法，煙葉專用肥與化肥施用量折算為純氮用量136.35kg/hm2，N∶P∶K 為 1∶0.8∶2.7。邵武煙草公司提供有機肥，有機肥為秸稈堆肥（秸稈與動物糞便混合比例為8∶2）。鄭州大學提供拮抗菌劑，其有效菌為蠟狀芽孢桿菌 QJ-1（No.M2012271）［10］，向已降至40℃以下的秸稈堆肥中接入拮抗菌，接種量為108cfu/g（干基），生產生物有機肥。其它大田管理措施按邵武市優(yōu)質煙生產技術規(guī)程進行。處理設置如下:

T1處理:常規(guī)施肥（施煙葉專用肥+化肥+有機肥，對照）；

T2處理:施生物有機肥（施煙葉專用肥+化肥+生物有機肥，煙葉專用肥、化肥的施用量同常規(guī)施肥，生物有機肥施用量按常規(guī)施肥施用的有機肥量所生產的生物有機肥量進行）。

1.2 試驗方法

土壤取樣方法:采用五點取樣法取根際土樣［12］，樣品編號見表1。

表1 土壤樣品分類與編號

土壤微生物多樣性測定:利用OMEGA試劑盒提取土壤DNA。送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序和多樣性分析。

1.3 數據分析與試驗觀測

采用SPSS 19.0對試驗數據進行分析處理。依據《煙草病蟲害分級及調查方法》（GB/T 23222-2008）記載青枯病發(fā)生病情級數，以株為單位分組調查病害嚴重程度，病情指數計算如下:

2 結果與分析

2.1 生物有機肥對煙株青枯病防治的效果

本試驗所用的生物有機肥對煙草青枯病的抑制作用較為明顯，在以往發(fā)病嚴重的煙田中施入后，青枯病的發(fā)生情況顯著減輕，通過田間試驗觀測，青枯病從煙株移栽83 d時開始出現，青枯病病情指數如圖1所示。在煙株移栽85、95、105 d的3次觀察期內，T2的病情指數均低于T1，尤其在移栽后95 d時，青枯病病情指數下降了31.43%，說明施用生物肥可以有效抑制煙草青枯病的發(fā)生，降低病情指數，提高防控效果。

圖1 兩種處理對煙株青枯病發(fā)病的影響

2.2 生物有機肥對土壤細菌群落結構的影響

2.2.1 土壤細菌群落多樣性分析

7個樣本的土壤細菌多樣性指數如表2所示，Coverage表示測序獲得的序列占整個基因組的比例。Shannon指數反映細菌群落的變化度或差異度，受樣本總數和均勻度的影響，數值越大，表明土壤中微生物多樣性越高［6-8］。ACE指數反映物種豐富度，值越大，表明群落中含有的OTU（Operational taxonomic units）數目越多，群落豐富度越高。

表2 不同土壤細菌多樣性指數

各樣本的Coverage值均高于0.7，表明測序獲得的序列覆蓋程度較高，具有較好的代表性。這反映出本試驗構建的克隆文庫能比較真實代表該地區(qū)土壤細菌的多樣性。T2處理的Shannon指數均比同期T1處理的要大，說明生物肥的添加提高了土壤中細菌的多樣性。T1與T2處理中發(fā)病煙株土壤細菌的Shannon指數均大于健康煙株土壤和發(fā)病前煙株土壤，說明青枯病的發(fā)病與土壤細菌多樣性有一定關系。發(fā)病后T1B 的ACE指數比發(fā)病前T1W增加了12.05%，豐富度指數提高不明顯。而T2B的ACE指數比T2W增加了42.67%，說明生物肥的添加對青枯病發(fā)病時煙株土壤細菌種群豐富度影響較大。

2.2.2 生物有機肥對土壤細菌群落結構的影響

對7個樣本土壤細菌群落的組成在科與屬水平上進行了相對豐度的比較。從表3中可以看出，在科水平上，煙株移栽前TY樣本的土壤草酸桿菌科Oxalobacteraceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、梭菌科Clostridiaceae相對豐度明顯高于煙株移栽后各樣本。T1W、T2W與T1C、T2C細菌群落豐度相差不大，與T1B、 T2B相比差距明顯，比如鞘脂單胞菌科Sphingomonadaceae、間孢囊菌科Intrasporangiaceae在煙株發(fā)病的土壤中含量較低，說明在科水平上，移栽后70 d的煙株發(fā)病前土壤樣本與移栽后90 d的健康煙株土壤樣本細菌群落相似，而移栽后90 d的發(fā)病煙株土壤樣本細菌群落則差別較大，這與青枯病的發(fā)病密切相關。

表3 科水平各土壤樣本細菌群落的相對豐度 （%）

由圖2可知，在屬水平上，TY細菌種類最少，群落結構相對簡單，未分類細菌和其他類細菌的含量也較低，已分類細菌中Massilia含量最高，為優(yōu)勢菌。T1C、T2C、T1B、T2B未分類細菌的相對豐度逐漸上升，說明未分類細菌中種類和數量在增加；而已分類細菌種類相似，優(yōu)勢菌都為:酸桿菌Gp1（Acidobacteria_Gp1）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、酸桿菌Gp3（Acidobacteria_Gp3）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium），但相對豐度差異較大。

圖2 屬水平各土壤樣本細菌群落結構比較

在對T1C、T1B和T2C、T2B比較后發(fā)現，發(fā)病煙株根際土壤區(qū)系中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）均未出現，而在未發(fā)病煙株根際土壤中，卻有著一定的相對豐度，可能與煙草青枯病發(fā)病相關。

2.2.3 不同樣本細菌群落主成分分析

對7個樣本進行細菌組成的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），提取兩個主成分因子，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）是造成4個樣品的兩個最大差異特征，分別可以解釋為所有變量的56.4%和20.2%，兩個主成分累加方差貢獻率達到76.6%，可以表征大多數的標量特征。因此，取兩個主成分（PC1和PC2）作圖來表示細菌群落的特征，見圖3。

從 圖3可 以 看 出， 相 比TY，T1W、T2W、T1C、T2C、T1B、T2B 中的細菌群落結構均發(fā)生了較大改變。在第一主成分上，TY與T1B處理土壤細菌群落組成基本一致，與T1W、T2W處理存在較大差異。在第二主成分上，TY、T1W、T2W、T1C和T2C處理間的土壤細菌群落組成具有一致性，PC2的貢獻率大于PC1的貢獻率，可以認為生物肥是影響土壤細菌群落組成的主要因素。

圖3 不同樣本細菌群落PCA分析

2.3 生物有機肥對土壤真菌群落結構的影響

2.3.1 土壤真菌群落多樣性分析

7個樣本的土壤真菌多樣性指數如表4所示，7個樣本的Coverage值均高于0.8，表明測序獲得的序列覆蓋程度較高，反映出本試驗構建的克隆文庫能比較真實代表該地區(qū)土壤真菌的多樣性。TY土壤中的OTU數目最高，T2C土壤中OTU數目大于T2W，且兩者均遠大于T1B，說明生物肥的添加能增加土壤中真菌的多樣性，而T2處理下的發(fā)病土壤中Shannon指數要高于健康狀態(tài)下的，說明煙草青枯病的發(fā)生與土壤中真菌多樣性有關。發(fā)病后與發(fā)病前的ACE指數變化不大，說明施肥對土壤的真菌豐富度影響不大。

表4 不同樣本的土壤真菌多樣性指數

2.3.2 生物肥對土壤真菌群落結構的影響

對7個樣本的土壤真菌群落的組成在科水平上進行了相對豐度的比較，結果如表5所示。TY處理的土壤中被孢霉科Mortierellaceae含量最高，T2C處理的土壤除了被孢霉科Mortierellaceae增加外，其余的都有不同程度的降低，說明生物肥有利于該菌的生長，是土壤中的優(yōu)勢菌。T2B處理的土壤中被孢霉科Mortierellaceae和叢赤殼科Nectriaceae的含量分別降低了76.1%、92.3%，而糞盤菌科Ascobolaceae的含量增加了64.9%，說明青枯病的發(fā)生與這3種菌科的含量變化有一定的關系。

表5 科水平各土壤樣本真菌群落的相對豐度 （%）

由圖4可以看出，在屬水平上，TY真菌種類最少，群落結構相對簡單，未分類真菌和其他類真菌的含量也較低，已分類真菌中被孢霉屬Mortierella含量最高，為優(yōu)勢菌。T1C、T2C、T1B、T2B未分類真菌的相對豐度逐漸上升，說明未分類真菌中種類和數量在增加；已分類真菌種類存在一定的差異，T1C優(yōu)勢菌為:被孢霉屬（Mortierella）、BG01－7、糞盤菌屬（Ascobolus）、暗殼腔菌屬（Phaeosphaeria），T2C的優(yōu)勢菌為:被孢霉屬（Mortierella）、叢赤殼屬（Nectria），T1B的優(yōu)勢菌為:被孢霉屬（Mortierella）、叢赤殼屬（Nectria）、Lulwoana，T2B優(yōu)勢菌為:BG01－7、被孢霉屬（Mortierella）、糞盤菌屬（Ascobolus）、酵母屬（Saccharomyces），并且相對豐度存在一定的差異。

在對T1C、T1B和T2C、T2B比較后發(fā)現，發(fā)病煙株根際土壤區(qū)系中田頭菇屬（Agrocybe）均未出現，而在未發(fā)病煙株根際土壤中，卻有一定的相對豐度，可能與煙草青枯病發(fā)病相關。

2.3.3 不同樣本真菌群落主成分分析

對7個樣本進行真菌組成的主成分分析，提取兩個主成分因子，分別可以解釋所有變量的42.7%和26.1%，兩個主成分累加方差貢獻率達到68.8%。從圖5可以看出，在第一主成分上，T2W與TY距離較遠，土壤中的真菌菌落存在較大差異，說明生物肥是影響土壤真菌群落組成的主要因素。在第二主成分上，TY與T2W處理間的土壤真菌群落組成

具有一致性，而T2C與T2B距離較遠，說明生物肥是影響土壤真菌群落組成的主要因素。

3 討論與結論

眾多研究表明，采用拮抗菌制成生物有機肥施用來防治植物病害具有良好的效果［13-14］，生物肥不僅滿足了植物的生長需要，還為拮抗菌提供了足夠的營養(yǎng)物質，使其在根際土壤微生物區(qū)系中更易成為優(yōu)勢菌［15］。本研究中微生物有機肥的施用可以顯著降低煙草青枯病的病情指數，與王麗麗等［16］和陳巧玲等［17］的研究結果一致。生物肥的施用不僅抑制了煙草青枯病的發(fā)生，更促進了煙葉的生長和上等煙葉的比例，整體上提高了煙葉的經濟性狀。

高通量宏基因組測序從土壤樣本中直接提取微生物DNA，避免了傳統分離培養(yǎng)法會遺漏土壤中絕大多數微生物的缺點，較為真實地反映了土壤微生物群落的豐度及其作用機制。T2發(fā)病株與健康株的香農系數均比T1對應處理要高，說明生物肥的加入提高了煙株根際土壤細菌的多樣性［18］。而發(fā)病株根際細菌數量高于未發(fā)病株，可能是因為青枯病菌在侵入寄主過程中或在侵入后，一定程度上干擾植物的正常代謝，而煙株為了抵抗這種變化，通過改變根系分泌物或內生細菌來進行調節(jié)，從而造成根際微生物區(qū)系微生物種類增加，說明發(fā)病株青枯病菌誘導了根際環(huán)境發(fā)生變化。存在于發(fā)病株和健康株根際土壤中的細菌屬類大部分相同，尤其是優(yōu)勢菌都一樣，但相對豐度有差異。對于T1處理，發(fā)病株與健康株優(yōu)勢菌相對豐度差異較大，而施用生物肥的T2處理，發(fā)病株與健康株優(yōu)勢菌相對豐度差異不大，說明拮抗菌的加入，使得青枯病菌數量減少，或者說煙株更易于應對青枯病菌的侵擾，因而根際土壤微生物區(qū)系優(yōu)勢菌變化不大。在對T1C、T1B和T2C、T2B比較后發(fā)現，發(fā)病煙株根際土壤區(qū)系中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）均未出現，而在健康煙株根際土壤中，卻有著一定的相對豐度，可能與煙草青枯病發(fā)病有關。

圖4 屬水平各土壤樣本真菌群落結構比較

圖5 不同樣本真菌群落PCA分析